一种肿瘤标志物循环肿瘤DNA检测芯片及试剂盒的制作方法

癌症严重威胁人类的健康和生命。根据世界卫生组织(who)的最新调查结果表明，每年有880万人因癌症死亡，几乎占全球死亡数的六分之一。根据全球癌症流行病统计数据显示，在2012年全球癌症发病人数达到140多万，死亡人数多达八十多万，如此高的发病率和死亡率意味着癌症确实是全人类所面临的一大难题。这种现状存在的一大问题就是癌症病例的诊断过晚，这一现象在低收入和中等收入国家表现的更为显著，即使在具备良好的卫生系统和卫生服务设施的国家，许多癌症病例也是在癌症晚期才得到诊断，致使其治愈的希望就十分渺茫。故而，在2017年3月2号发布who癌症早期诊断指南，表明癌症诊断可以拯救生命，减少治疗损失，所有的国家都应该采取措施促进癌症的早期诊断。

癌症的诊断主要有三种形式，一是影像学，二是组织活检，三是基于标志物的血液活检。影像学可以实现肿瘤的可视化，但是相应地小病灶发现难，对设备要求高，部分有放射危害；组织活检作为诊断金标，存在取样难，侵入性强和代表性不全的缺点。相比较而言，基于标志物的血液活检具备侵入性小和发现及时的优点。血液活检是基于肿瘤标志物进行的。肿瘤标志物包括蛋白类标志物和核酸类标志物，如microrna，循环肿瘤dna(ctdna)。相比较于蛋白类标志物在血液中长达数周的半衰期而言，ctdna在血液中的半衰期低于2h。故而，基于ctdna肿瘤标志物的检测，可以实现癌症的早期诊断，并且可以实现在侵入性较小的情况下掌握更为及时的肿瘤状态的动态变化。

目前对ctdna的定量检测方法主要有标记扩增深度测序(tam-seq)，癌症个性化深度测序(capp-seq)，但是操作复杂，价格昂贵并且耗时耗力。除此之外，锁式探针，基于分子信标荧光检测法，基于肽核酸(pna)的电化学检测方法，及其基于pcr也能实现ctdna检测，但是这些方法或多或少存在特异性差，信号不稳定等缺点。

技术实现要素：

本发明的目有是克服现有技术的不足，提供一种肿瘤标志物ctdna的定量且高灵敏的肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

本发明的第二个目的是提供一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片，包括负载有纳米金属的基板，所述纳米金属与拉曼信号分子连接，拉曼信号分子通过连接分子与茎环结构探针连接。

金属优选为银，金或铜。

拉曼信号分子为活性羧基信号分子、羧基信号分子或氨基信号分子，所述活性羧基信号分子为5,5’-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)；所述羧基信号分子为对巯基苯甲酸或2-硝基-5-巯基苯甲酸；所述氨基信号分子为对巯基苯胺或2-氨基-6-巯基嘌呤。

连接分子为c3-c12的烷基氨基或c3-c12的烷基羧基。

茎环结构探针是一条dna-rna嵌合体，dna-rna嵌合体分为1、2和3三个部分，第1部分和第3部分为5-7个脱氧核糖核苷酸组成的序列并反向互补配对构成茎环结构探针的茎，第2部分为茎环结构探针的环，所述环是由14-22个脱氧核糖核苷酸和1个核糖核苷酸组成的序列并能与目标待检测物dna碱基互补配对，所述茎环结构探针的环的位置有一个核糖核苷酸，其它位置为脱氧核糖核苷酸。

一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片的制备方法，包括如下步骤：

1)制备负载有纳米金属的基板；

2)制备连接有连接分子的茎环结构探针：

(1)合成一条dna-rna嵌合体，所述dna-rna嵌合体分为1、2和3三个部分，第1部分和第3部分为5-7个脱氧核糖核苷酸组成的序列并能反向互补配对构成茎环结构探针的茎，第2部分为茎环结构探针的环，所述环由14-22个脱氧核糖核苷酸和1个核糖核苷酸组成的序列并能与目标待检测物dna碱基互补配对；在所述dna-rna嵌合体的5’端或3’端连接上连接分子；

(2)将步骤(1)获得的连接有连接分子的dna-rna嵌合体配成浓度为10nm-100um的水溶液，加入nacl使终浓度为50-100mm，混匀，置于pcr仪中，升温至95-90℃，在0.5-2小时内降温到25-4℃，得到连接有连接分子的茎环结构探针；

3)将拉曼信号分子配成拉曼信号分子溶液，将负载有纳米金属的基板浸泡于拉曼信号分子溶液中，浸泡2-12h，使纳米金属与拉曼信号分子连接；

4)将步骤3)获得的产物与步骤2)获得的连接有连接分子的茎环结构探针中的连接分子连接，得到一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

步骤4)具体为：

当拉曼信号分子为活性羧基信号分子

将步骤3)获得的产物与步骤2)获得的连接有c3-c12的烷基氨基连接分子的茎环结构探针混合，静置，(使拉曼信号分子与连接分子结合)转移到丁胺-磷酸盐缓冲溶液中，室温下浸泡，封闭未反应的活性羧基，得到一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

或：步骤4)具体为：

当拉曼信号分子为羧基信号分子

将步骤3)获得的产物浸于含nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)的溶液中，放置，与步骤2)获得的连接有c3-c12的烷基氨基连接分子的茎环结构探针混合，静置2-4h，(使拉曼信号分子与连接分子结合)转移到丁胺-磷酸盐缓冲溶液中，室温下浸泡，封闭未反应的活性羧基，得到一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

或：步骤4)具体为：

当拉曼信号分子为氨基信号分子

将步骤3)获得的产物浸于含nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)的溶液中，放置，与步骤2)获得的连接有c3-c12的烷基羧基连接分子的茎环结构探针混合，静置，(使拉曼信号分子与连接分子结合)，得到一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

金属优选为银，金或铜。

连接分子为c3-c12的烷基氨基或c3-c12的烷基羧基。

拉曼信号分子优选为活性羧基信号分子、羧基信号分子或氨基信号分子，所述活性羧基信号分子为5,5’-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)；所述羧基信号分子为对巯基苯甲酸或2-硝基-5-巯基苯甲酸；所述氨基信号分子为对巯基苯胺或2-氨基-6-巯基嘌呤。

一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测试剂盒，包括上述肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片，试剂1，试剂2和试剂3；

试剂1为5u/ulrnasehii溶液；

试剂2为10×buffer(100mmkcl，200mmtris-hcl，100mm(nh4)2so4，20mmmgso4，1％tritonx-100，ph8.8)；

试剂3为用ph＝5.7-8.0磷酸盐缓冲液配制浓度为0.5-10um的fs序列的溶液；所述fs序列为与连接有连接分子的茎环结构探针的连接分子到一个核糖核苷酸之间的脱氧核糖核苷酸序列的反向互补序列。

fs序列优选用seqidno.7所示的第一种fs序列、用seqidno.8所示的第二种fs序列或用seqidno.9所示的第三种fs序列。

本发明的优点：

1.利用纳应力传感，循环肿瘤dna的浓度信息转化为信号分子的特征峰位移量，从而可以通过其来检测循环肿瘤dna绝对浓度，检测准确性更高；

2.肿瘤标志物循环肿瘤dna检测探针是茎环结构形式的探针，有利于增加循环肿瘤dna检测的特异性；

3.肿瘤标志物循环肿瘤dna检测探针是dna-rna嵌合体结构，基于此引入rnasehii不仅可以提高循环肿瘤dna检测特异性，并且可以引发循环反应，增加其检测灵敏度。

附图说明

图1为实施例1-3肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片示意图。图1中：1.负载有纳米金属的基底；2.拉曼信号分子；3.连接分子；4.茎环结构探针；5.一个核糖核苷酸。

图2为实施例1拉曼信号分子dsnb的拉曼谱图。

图3为实施例7进行不同浓度循环肿瘤dna检测的信号分子dsnb特征峰1334cm^-1位置的图谱局部图，其中编号1,2,3,4和5分别代表循环肿瘤dna浓度分别为0，10^-8，10^-10，10^-12，10^-14,10^-15m。

图4为实施例7进行不同浓度循环肿瘤dna和一个肺癌病人血清检测时，循环肿瘤dna浓度与对应信号分子特征峰位移大小的关系。

具体实施方式

rnasehii溶液，市售；

buffer，市售。

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

dna-rna嵌合体分为1、2和3三个部分，第1部分和第3部分为5-7个脱氧核糖核苷酸组成的序列并能反向互补配对构成茎环结构探针的茎，第2部分为茎环结构探针的环，环由14个脱氧核糖核苷酸和1个核糖核苷酸组成的序列，实施例1-3举出的seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3的序列，仅是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何的限定，只要能满足条件上述条件的茎环结构探针的任何序列都可以用于本发明。

实施例1

一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片的制备方法，见图1，包括如下步骤：

1)制备负载有纳米银的基板(zl201510127809.5)；

2)制备连接有连接分子的茎环结构探针：

(1)合成一条dna-rna嵌合体，

第一种dna-rna嵌合体序列用seqidno.1所示：

seqidno.1：

dna-rna嵌合体分为1、2和3三个部分，第1部分和第3部分(波浪下划线)为7个脱氧核糖核苷酸组成的序列并能反向互补配对构成茎环结构探针的茎，第2部分(双下划线)为茎环结构探针的环，环由16个脱氧核糖核苷酸和1个核糖核苷酸(ar代表了腺嘌呤核糖核苷酸)组成的序列并能与目标待检测物dna(待检测的ctacgccatcagctcca(seqidno.4)ctdna的核苷酸序列为例)碱基互补配对；在所述dna-rna嵌合体的5’端连接上连接分子(-(ch2)6-nh2)；

(2)将步骤(1)获得的连接有连接分子的dna-rna嵌合体配成浓度为10um的水溶液，加入nacl使终浓度为50mm，混匀，置于pcr仪中，升温至95℃，在2小时内降温到4℃，得到连接有连接分子的茎环结构探针；

3)将拉曼信号分子dsnb配成浓度为1mm的dsnb乙腈溶液，将负载有纳米银的基板浸泡于dsnb乙腈溶液中，浸泡4h，使纳米银与dsnb连接；

拉曼信号分子为活性羧基信号分子，活性羧基信号分子为5,5’-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)简称dsnb；

4)将步骤3)获得的产物与步骤2)获得的连接有连接分子的茎环结构探针混合，静置2h，(使拉曼信号分子与连接分子结合)转移到10um的丁胺-磷酸盐缓冲溶液中，室温下浸泡50min，封闭未反应的活性羧基，得到一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

实施例2

一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片的制备方法，见图1，包括如下步骤：

1)制备负载有纳米金的基板(zl201710505915.1)；

2)制备连接有连接分子的茎环结构探针：

(1)合成一条dna-rna嵌合体，

第二种dna-rna嵌合体序列用seqidno.2所示：

seqidno.2：

dna-rna嵌合体分为1、2和3三个部分，第1部分和第3部分(波浪下划线)为5个脱氧核糖核苷酸组成的序列并能反向互补配对构成茎环结构探针的茎，第2部分(双下划线)为茎环结构探针的环，环由14个脱氧核糖核苷酸和1个核糖核苷酸(ar代表了腺嘌呤核糖核苷酸)组成的序列并能与目标待检测物dna(待检测的tacgccatcagctcc(seqidno.5)ctdna的核苷酸序列为例)碱基互补配对；在所述dna-rna嵌合体的3’端连接上连接分子-(ch2)3-nh2；

(2)将步骤(1)获得的连接有连接分子的dna-rna嵌合体配成浓度为10nm的水溶液，加入nacl使终浓度为100mm，混匀，置于pcr仪中，升温至90℃，在0.5小时内降温到25℃，得到连接有连接分子的茎环结构探针；

3)将拉曼信号分子mba配成浓度为2mm的mba乙醇溶液，将负载有纳米金的基板浸泡于mba乙醇溶液中，浸泡12h，使纳米金与mba连接；

拉曼信号分子为羧基信号分子，羧基信号分子为对巯基苯甲酸，简称mba；

4)将步骤3)获得的产物浸于含10mmnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和50mmedc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)的溶液中，放置1h，与步骤2)获得的连接有连接分子的茎环结构探针混合，静置2h，(使拉曼信号分子与连接分子结合)转移到100μm的丁胺-磷酸盐缓冲溶液中，室温下浸泡40min，封闭未反应的活性羧基，得到一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

所述丁胺-磷酸盐缓冲溶液的溶剂为ph＝8的磷酸盐缓冲液；含10mmnhs和50mmedc的溶液的溶剂为ph＝6.8的磷酸盐缓冲液。

实验证明，用-(ch2)12-nh2)替代本实施例的-(ch2)3-nh2，其它同本实施例，制备出相应的一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

实验证明，用2-硝基-5-巯基苯甲酸替代本实施例的对巯基苯甲酸，其它同本实施例，制备出相应的一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

实施例3

一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片的制备方法，见图1，包括如下步骤：

1)制备负载有纳米铜的基板(cn201810481929.9)；

2)制备连接有连接分子的茎环结构探针：

(1)合成一条dna-rna嵌合体，

第三种dna-rna嵌合体序列用seqidno.3所示：

seqidno.3：

dna-rna嵌合体分为1、2和3三个部分，第1部分和第3部分(波浪下划线)为7个脱氧核糖核苷酸组成的序列并能反向互补配对构成茎环结构探针的茎，第2部分(双下划线)为茎环结构探针的环，环由22个脱氧核糖核苷酸和1个核糖核苷酸(gr代表了鸟嘌呤核糖核苷酸)组成的序列并能与目标待检测物dna(待检测的tggttggagctcgtggcgtagga(seqidno.6)ctdna的核苷酸序列为例)碱基互补配对；在所述dna-rna嵌合体的5’端连接上连接分子(-(ch2)12-cooh)；

(2)将步骤(1)获得的连接有连接分子的dna-rna嵌合体配成浓度为100um的水溶液，加入nacl使终浓度为100mm，混匀，置于pcr仪中，升温至90℃，在0.5小时内降温到25℃，得到连接有连接分子的茎环结构探针；

3)将拉曼信号分子6-tg配成浓度为2mm的6-tg水溶液，将负载有纳米银的基板浸泡于6-tg水溶液，浸泡2h，使纳米铜与6-tg连接；

拉曼信号分子为氨基信号分子为2-氨基-6-巯基嘌呤，简称6-tg；

4)将步骤3)获得的产物浸于含10mmnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和70mmedc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)的溶液中，放置2h，与步骤2)获得的连接有连接分子的茎环结构探针混合，静置2h，(使拉曼信号分子与连接分子结合)，得到一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

所述含10mmnhs和70mmedc的溶液的溶剂为ph＝6.8的磷酸盐缓冲液。

实验证明，用-(ch2)3-cooh)替代本实施例的(-(ch2)12-cooh)其它同本实施例，制备出相应的一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

实验证明，用对巯基苯胺替代本实施例的2-氨基-6-巯基嘌呤，其它同本实施例，制备出相应的一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片。

实施例4

一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测试剂盒，包括实施例1制备的肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片，试剂1，试剂2和试剂3；

试剂1为5u/ulrnasehii溶液；

试剂2为10×buffer；

试剂3为用ph＝7.4磷酸盐缓冲液配制浓度为1um的fs序列的溶液；所述fs序列为与连接有连接分子的茎环结构探针的连接分子到一个核糖核苷酸之间的脱氧核糖核苷酸序列的反向互补序列。

seqidno.1：

连接有连接分子的seqidno.1：

第一种fs序列：cagctccaagacaga(seqidno.7)

实施例5

一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测试剂盒，包括实施例2制备的肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片，试剂1，试剂2和试剂3；

试剂1为5u/ulrnasehii溶液；

试剂2为10×buffer；

试剂3为用ph＝5.7磷酸盐缓冲液配制浓度为0.5um的fs序列的溶液；所述fs序列为与连接有连接分子的茎环结构探针的连接分子到一个核糖核苷酸之间的脱氧核糖核苷酸序列的反向互补序列。

seqidno.2：

连接有连接分子的seqidno.2：

第二种fs序列：cagctccagaga(seqidno.8)

实施例6

一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测试剂盒，包括实施例3制备的肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片，试剂1，试剂2和试剂3；

试剂1为5u/ulrnasehii溶液；

试剂2为10×buffer；

试剂3为用ph＝8.0磷酸盐缓冲液配制浓度为10um的fs序列的溶液；所述fs序列为与连接有连接分子的茎环结构探针的连接分子到一个核糖核苷酸之间的脱氧核糖核苷酸序列的反向互补序列。

seqidno.3：

连接有连接分子的seqidno.3：

第三种fs序列：tctgtcttggttggagct(seqidno.9)

实施例7

一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测试剂盒的使用方法，该试剂盒为实施例4制备：

1)根据胎牛血清配制含有不同浓度循环肿瘤dna(10^-8,10^-10,10^-12,10^-14,10^-15，0m)的血清样品，各500ul，同时取肺癌病人血清样品500ul，将dna提取试剂(酚：氯仿＝25:24，市售)分别与配置的含有不同浓度循环肿瘤dna的胎牛血清和肺癌病人血清等体积混合后，震荡1min后，10000g离心10min，取上清，干燥后得到dna提取物；

2)将20ul试剂1，50ul试剂2和430ul去离子水加入步骤1)获得的产物中，混合；

3)将步骤3)获得的混合液混合后分别置于不同肿瘤标志物ctdna检测芯片的表面，37℃下孵育2h；

3)用ph＝7.4的pbs溶液冲洗2遍，测其拉曼峰；

4)再置于试剂3中孵育12h，孵育完成后用ph＝7.4的pbs溶液冲洗2遍，测其拉曼峰；

5)比较步骤3)和步骤4)测定拉曼峰位置的不同，统计拉曼峰位置变化。见图4。

关于茎环结构探针序列是dna-rna嵌合体的说明：

dna-rna嵌合体分为1、2和3三个部分，第1部分和第3部分为5-7个脱氧核糖核苷酸组成的序列并能反向互补配对构成茎环结构探针的茎，第2部分为茎环结构探针的环，所述环由14-22个脱氧核糖核苷酸，其中嵌合着1个核糖核苷酸组成的序列，并能与目标待检测物dna碱基互补配对。检测过程中，茎环结构探针的环与目标待检测物dna碱基互补配对，茎环结构探针的环上的rna位点在rnasehii作用下被水解，茎环结构探针的环被破坏释放出目标待检测物dna，引发下一轮反应，基于此的循环放大反应可以增加检测灵敏度。

序列表

<110>天津大学

<120>一种肿瘤标志物循环肿瘤dna检测芯片及试剂盒

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>31

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tctgtcttggagctgatggcgtagagacaga31

<210>2

<211>25

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tctctggagctgatggcgtaagaga25

<210>3

<211>37

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tctgtcttcctacgccacgagctccaaccaagacaga37

<210>4

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ctacgccatcagctcca17

<210>5

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tacgccatcagctcc15

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tggttggagctcgtggcgtagga23

<210>7

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cagctccaagacaga15

<210>8

<211>12

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cagctccagaga12

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tctgtcttggttggagct18