一种细胞纯悬浮工艺生产猪圆环病毒2型（PCV2）的方法与流程

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及一种基于pk15细胞生产猪圆环病毒2型的方法。

背景技术：

猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv2)感染是目前国内养殖场普遍存在的现象，由于该病毒的感染会导致免疫抑制并诱发其他疾病的发生，给养猪业带来巨大的经济损失，因此圆环病毒相关性疾病的防控面临着严峻的形势。

疫苗免疫仍是目前防控猪圆环病毒2型感染的主要措施之一。将pcv2灭活制成的全病毒灭活疫苗由于其含有完整的病毒颗粒，具有较好的免疫效果，仍是目前市场上的主流产品。

借助猪肾细胞pk15悬浮培养、再接种pcv2于前述细胞，来生产pcv2，是目前pcv2生产的主流技术发展方向。目前有很多疫苗生产企业采用细胞微载体悬浮培养技术进行圆环病毒2型病毒液的制备，可以获得较高的病毒滴度；但该工艺由于使用了细胞微载体、且需要血清和d-氨基葡萄糖等成分来提高病毒效价，导致原料和分离成本较高。

专利cn108103003a公开了一种不带细胞微载体的悬浮培养技术，只能在2l培养体系中使得pk15细胞浓度超过微载体悬浮培养。但该技术的培养体系太小，不足以达到产业化要求。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种细胞纯悬浮工艺生产猪圆环病毒2型的方法，它是使用无血清悬浮培养基，并包括如下步骤：

(1)细胞准备：在摇瓶中培养pk15细胞，ph值维持在6.8-7.4；

(2)细胞放大培养：将复苏的细胞接种到生物反应器中逐级放大培养，其ph值维持在6.8-7.4；

(3)病毒接种：将pcv2病毒接种于反应器内，继续培养细胞，其ph值维持在6.8-7.4；

(4)病毒收获；

步骤(2)所述的逐级放大培养，其传代后初始细胞密度为0.8×10⁶-1×10⁶个/ml；

进一步地，所述无血清悬浮培养基为上海奥浦迈生物科技有限公司生产的opm-pk15sfml培养基。

如前所述的方法，步骤(1)的摇瓶容积为100-250ml。

如前所述的方法，步骤(2)的生物反应器包括1l、7l、85l和500l的至少两种。

如前所述的方法，步骤(2)的1l生物反应器培养条件为：搅拌速度为110-140rpm，优选为120rpm；溶氧量为30-50％，优选40％；通气方式为大泡通气；通气量为0.8-1.0l/h，优选1.0l/h。

如前所述的方法，步骤(2)的7l生物反应器培养条件为：搅拌速度为30-100rpm，优选为70-80rpm；通气方式为大泡通气；通气量为0.4-3l/h，优选6-12l/h。

如前所述的方法，步骤(2)的85l生物反应器培养条件为：搅拌速度为25-60rpm，优选为25-50rpm；通气方式为大泡通气；通气量为3-7l/h，优选4.8-6l。

如前所述的方法，步骤(3)的病毒接种时，初始感染复数为0.02。

如前所述的方法，步骤(4)的病毒收获是：接毒后每72h对pk15细胞传代一次，每传代一次则收获部分细胞，剩下的细胞用无血清悬浮培养基稀释至1×10⁶cells/ml继续培养、传代，传代时仍然收获部分细胞，剩下的细胞用无血清悬浮培养基稀释至1×10⁶cells/ml继续培养、传代......如此循环，直到继续培养至细胞活力＜70％，将所有培养物收获。

另外，步骤(4)的病毒收获还可以是：接毒后每24小时取样收获细胞培养物，待细胞活力＜70％时，将所有培养物一起收获。

本发明的技术方案避免了血清和微载体的使用，节约了原料成本，还能降低病毒的纯化成本。

另一方面，本发明的技术方案还能获得很高的病毒滴度，1g(tcid50/ml)的值最高可以达到7.83，而目前近似体量的微载体悬浮培养pk15细胞生产pcv2最高能达到8.0，说明本发明的方法在不使用微载体和血清的情况下，还能达到与微载体培养方法相当的病毒滴度，效果是难以预料的。

本发明还具有生产周期短的优点，仅312小时，就可以从85l生物反应器中收获病毒。

综上，本发明的在pcv2的生产上具有很好的商业价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为细胞在生物反应器上的扩增路线示意图

具体实施方式

实施例1pk15细胞悬浮培养

细胞先在摇瓶中活化，然后经过生物反应器逐级扩增培养，扩增路线如图1所示。具体的，分如下步骤进行：

1.细胞准备

将复苏后的pk15细胞置于3个250ml摇瓶中，培养培养条件37℃，5％co2，130rpm，培养3-4天后对细胞取样计数，根据计数的结果来判定传代比例，传代后初始细胞密度应维持在(0.8-1)×10⁶cells/ml。

2.pk15细胞在1l生物反应器中放大

将细胞密度调整到8×10⁵cells/ml，转入1l生物反应器中进行培养，培养体积为800ml，培养条件为：溶氧40％，ph7.2，转速130rpm，温度37℃，通气控制在0.8-1.0l/h。培养72h细胞密度增长至3.2×10⁶cells/ml，细胞活力93％，96h后细胞密度达到4.8×10⁶cells/ml，细胞活力93.6％。

3.pk15细胞在7l生物反应器中放大

将1l生物反应器中的细胞按照1×10⁶cells/ml的细胞密度进行扩增，扩增后细胞体积为4l，并转入7l生物反应器进行培养。

设置培养条件为：ph7.2，搅拌器转速80rpm，溶氧量40％，通气方式为大泡通气，通气量10-20ml/min。

细胞培养96h后细胞密度达到3.6×10⁶cells/ml，细胞活力91.6％。将细胞培养体积扩大到5l，培养48h后测定细胞密度为4.2×10⁶cells/ml，活力为92％。

4.pk15细胞在85l生物反应器中放大

将细胞进行传代，并扩增培养体积至20l，细胞密度为1×10⁶cells/ml，转入85l生物反应器中进行培养。培养条件为溶氧40％，ph7.2，转速50rpm，温度37℃，通气控制在80-100ml/min，并根据ph的变化不断的补入新鲜培养基。培养72h后，取样测定细胞密度为3.4×10⁶cells/ml，细胞活力92.1％。补入新鲜培养基，调整细胞密度至1×10⁶cells/ml，细胞培养体积扩大到60l。

实施例2细胞接毒及传代收获

将pcv2细胞毒按照0.02moi(moi，multiplicityofinfection，感染复数)接种到生物反应器中，接毒后每72h对pk15细胞传代一次，即取样测定细胞活力和密度后，将满足细胞稀释后密度为1×10⁶cells/ml的细胞体积后多余的细胞和培养基混合物收获，补加新鲜培养基至细胞密度为1×10⁶cells/ml，继续培养72h，重复上述操作，直至某次取样细胞测定的细胞活力＜70％，则停止培养，将所有的细胞及培养基一起收获。

为了体现技术方案的效果，以下提供实验例做进一步说明。

实验例185l生物反应器中传代收获时细胞密度、活力和pcv2效价测定

1.方法

1.1细胞培养

根据实施例1进行。

1.2细胞接毒

根据实施例2进行。

1.3取样

接毒后，对培养物进行取样。取样时间点为：接种后48小时(f1-48h)、72小时(f1-72h)，第一次传代24小时(f2-24h)、48小时(f2-48h)、72小时(f2-72h)，第二次传代后24小时(f3-24h)。

1.4细胞密度及活力检测

采用countstar公司的细胞计数仪(型号biotechic1000)对取得样品进行细胞密度及活力的检测。具体检测方法如下：

将收获的样品使用移液枪混匀后，取20μl与相同体积的0.02％的台盼蓝进行1∶1混匀，混匀后取20μl均匀加入到细胞计数仪的细胞计数板中，放入仪器中，自动分析获得细胞密度及活力。

1.5pcv2病毒的效价测定

1.5.1细胞准备

利用生长液制备pk-15细胞(细胞数为2.0×10⁵个/ml)悬液，利用排枪将细胞悬液加入到96孔细胞培养板中培养，每孔100μl，预留阴性对照与阳性对照孔，待用。

取待用96孔细胞板，确定细胞状态正常无污染后。弃掉生长液，加入维持液，每孔100μl，阴性对照12孔，每孔补加加入100ul生长液。阳性对照12孔，每孔补加100ul已知病毒液。

1.5.2病毒液稀释

将圆环2型病毒液摇匀后取100μl进行10×倍比稀释。具体操作如下：取100μl待检样品靠液面上壁加入到灭菌ep管(已加入好900μl维持液)中，弃掉枪头，换新1ml枪头在该稀释度的ep管中吹打8次，更换100μl枪再吸取100μl稀释液靠液面上壁加入到下一个稀释度中，弃掉枪头，换新1ml枪头在该稀释度的ep管中吹打8次，以此类推进行10×梯度稀释，6个稀释度(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8)，每个稀释度8孔，每孔100μl。

每次检测毒价时最好同时设立1个已知毒价的阳性对照(稀释度10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8)。做好标记，将接种的pk-15细胞放置37℃，5％co2恒温培养箱中培养24h，然后更换还有2mmol/mld-氨基葡糖糖的维持液，继续培养48h。

1.5.3tcid50的测定

稀释样品接种72h后，测定其tcid50，具体的操作步骤如下：

(1)先在显微镜下观察，细胞形态正常无污染，然后弃掉维持液，用pbs洗2次，用排枪缓慢沿孔壁加入pbs，每孔200μl，每次5min，轻微震荡混匀，轻轻拍干；

(2)用80％冷丙酮(预先放置-20℃)每孔150μl，4℃固定40min，弃丙酮，自然晾干，pbs洗涤2次，每孔200μl，每次5min，轻微震荡混匀，拍干；

(3)用pbs以1：1000稀释anti-pcv2鼠单抗(南京史记动物动物健康管理有限公司，货号ab-0033)，每孔50μl，于37℃孵育1.5h，弃一抗，pbs涤3次，每孔200μl，每次5min，轻微震荡混匀，拍干；

(4)用pbs以1：125稀释的fitc标记的羊抗鼠igg(sigma公司，货号：f0257-2ml)，每孔50μl于37℃避光孵育1h，弃二抗，pbs洗涤3次，每孔200μl，每次5min，轻微震荡混匀，拍干；

(5)荧光显微镜观察结果，猪瘟特异性荧光(团块荧光)判为阳性；

最后，根据reed-muench法计算tcid50。

2.结果

2.1细胞状况

细胞密度在前两代均能达到1×10⁶cells/ml以上，到第二次传代后24h下降到7.75×10⁶cells/ml；细胞活力在传代后一直下降，在第二次传代后24h下降到71.19％(表1)。

表1：85l生物反应器中细胞的细胞密度和细胞活力变化表

2.2病毒效价

病毒效价普遍较高，lg(tcid50/ml)最高可达7.5(表2)。

表2：85l生物反应器中细胞接毒后pcv2效价

实验例285l生物反应器中连续收获时pcv2效价测定

1.方法

1.1细胞培养

根据实施例1进行。

1.2细胞接毒

根据实施例2进行。

1.3取样

接毒后，对培养物进行取样。取样时间点为：接种后0小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时。

1.4pcv2病毒的效价测定

1.4.1细胞准备

利用生长液制备pk-15细胞(细胞数为2.0×105个/ml)悬液，利用排枪将细胞悬液加入到96孔细胞培养板中培养，每孔100μl，预留阴性对照与阳性对照孔，待用。

取待用96孔细胞板，确定细胞状态正常无污染后。弃掉生长液，加入维持液，每孔100μl，阴性对照12孔，每孔补加加入100ul生长液。阳性对照12孔，每孔补加100ul已知病毒液。

1.4.2病毒液稀释

将圆环2型病毒液摇匀后取100μl进行10×倍比稀释。具体操作如下：取100μl待检样品靠液面上壁加入到灭菌ep管(已加入好900μl维持液)中，弃掉枪头，换新1ml枪头在该稀释度的ep管中吹打8次，更换100μl枪再吸取100μl稀释液靠液面上壁加入到下一个稀释度中，弃掉枪头，换新1ml枪头在该稀释度的ep管中吹打8次，以此类推进行10×梯度稀释，6个稀释度(分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8倍稀释)，每个稀释度8孔，每孔100μl。

每次检测毒价时最好同时设立1个已知毒价的阳性对照(稀释度10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8)。做好标记，将接种的pk-15细胞放置37℃，5％co2恒温培养箱中培养24h，然后更换还有2mmol/mld-氨基葡糖糖的维持液，继续培养48h。

1.4.3tcid50的测定

稀释样品接种72h后，测定其tcid50，具体的操作步骤如下：

(1)先在显微镜下观察，细胞形态正常无污染，然后弃掉维持液，用pbs液洗2次，用排枪缓慢沿孔壁加入pbs，每孔200μl，每次5min，轻微震荡混匀，轻轻拍干；

(2)用80％冷丙酮(预先放置-20℃)每孔150μl，4℃固定40min，弃丙酮，自然晾干，pbs洗涤2次，每孔200μl，每次5min，轻微震荡混匀，拍干；

(3)用pbs以1：1000稀释anti-pcv2鼠单抗(南京史记动物动物健康管理有限公司，货号ab-0033)，每孔50μl，于37℃孵育1.5h，弃一抗，pbs涤3次，每孔200μl，每次5min，轻微震荡混匀，拍干；

(4)用pbs以1：125稀释的fitc标记的羊抗鼠igg(sigma公司，货号：f0257-2ml)，每孔50μl于37℃避光孵育1h，弃二抗，pbs洗涤3次，每孔200μl，每次5min，轻微震荡混匀，拍干；

(5)荧光显微镜观察结果，猪瘟特异性荧光(团块荧光)判为阳性；

最后，根据reed-muench法计算tcid50。

2.结果

pcv效价在接毒后呈现先升高后降低的趋势，其中lg(tcid50/ml)最高可达7.83(表3)。

表3：85l生物反应器中细胞接毒后pcv2一步病毒生长曲线

以上实验表明，通过本发明的方法，可以实现pcv2的高效生产。