一种快速应用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病的方法与流程

本发明属于微生物生物防治技术领域，具体涉及一种应用松材线虫寄生真菌-伊氏杀线菌固体发酵产物对松萎蔫病进行防治的方法。

背景技术：

松萎蔫病又称松材线虫病，是由松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)引起的松树快速死亡、连片毁灭的一种危险性病害，主要以松褐天牛等昆虫为媒介进行传播。该病于1905年在日本首次报道，并迅速蔓延至中国、韩国、越南以及欧洲等国家和地区，严重威胁世界范围内的松林安全。该病具有传播途径多、发病速度快、治理难度大等特点，截止目前仍没有有效的防治办法，被称为松树的癌症。我国松树种植面积大、感病寄主多、传播媒介广、气候条件适宜，致使松萎蔫病在我国大范围爆发。松萎蔫病于1982年在南京市中山陵首次发现，并迅速蔓延至全国各地。根据2017年秋季普查结果(国家林业局公告，2018年第1号)，该病已扩散蔓延至福建、浙江、江苏、辽宁等16个省(市、自治区)的325个县级行政区，其中2017年度新增疫区78个(辽宁省占12个)，发生面积127.54万亩，病死树118.95万株，出现了“疫区和新发疫区大量增加，发生面积及病死树大量增加”两个增加的局面。松萎蔫病已经成为我国最为严重的森林灾害，导致森林资源、自然景观和生态环境遭到严重破坏，同时直接或间接导致的经济损失超过千亿元，也严重影响了我国林业生态文明建设发展，其控制已刻不容缓。

松萎蔫病的防控是世界性的难题，尽管我国采取了一系列防治措施，在一定程度上降低了其扩散速度，但疫点仍不断增加、发生范围不断扩大。目前的防治松萎蔫病常用的方法主要有：检验检疫、物理防治、化学防治、生物防治、营林技术等，其中生物防治因环保、高效、安全而具有巨大的研发前景与应用潜力，已逐渐成为松萎蔫病防治技术研究的热点。g810生物制剂是将松萎蔫病生防真菌esteyavermicola(伊氏杀线菌，下简称e.vermicola)液体发酵产物与多种保护剂、营养剂按照一定比例混合而成的，可有效杀死松材线虫并对松萎蔫病进行防治。e.vermicola是第一种被报道的松材线虫内寄生真菌，在世界范围内均有分布，可感染松材线虫和瑞士伞滑刃线虫。e.vermicola可产生新月形和杆状两种不同类型的分生孢子其中新月形侵染孢子可粘附在松材线虫体表，随后萌发并刺入线虫体内形成菌丝，利用线虫体内的营养物质迅速生长，最终导致线虫活力降低和死亡；当线虫体内的营养物质消耗殆尽时，菌丝穿出在线虫体表产生新的新月形侵染孢子。e.vermicola对松材线虫的侵染活性较高，90％供试线虫在24h内被新月形孢子粘附，3-4天后几乎所有供试线虫都被侵染致死。该菌在生长过程中产生的非挥发性和挥发性物质(如α-蒎烯、β-蒎烯和莰酮)能诱引松材线虫，随后侵染并杀死线虫。用e.vermicola孢子悬浮液处理松萎蔫致死木，可显著降低其中的松材线虫数量，具有减少病死木中羽化天牛所携带和传播线虫数量进而降低松萎蔫发生和传播的潜力；e.vermicola可能也会由羽化的天牛所携带并在健康松树之间进行传播和扩散，这为应用e.vermicola防治松萎蔫提供了一种新策略。

目前应用e.vermicola防治松萎蔫病的措施主要有喷洒和注射两种防治措施，都是直接利用该生防真菌在固体培养基或液体培养基中产生的孢子，混合一定的保护剂和抗生素后加工制作成为丸剂保存；使用时，将丸剂溶解后添加保护剂并稀释后用于喷洒或树干注射。生防真菌孢子的生产主要利用麦麸、松木屑的混合物高温高压灭菌后，将液体培养的孢子悬液接种至混合物中并搅拌均匀，随后将混合物平铺在不锈钢盘中并用保鲜膜覆盖培养；该培养方法操作复杂，操作环节中人为原因或自然原因导致的污染现象严重，难以适用于大规模生产。固体培养中新月形孢子悬液的获得采用无菌水浸泡、尼龙纱过滤得到孢子悬液，然后离心获得孢子浓缩液；该操作流程复杂且长期暴露于空气中，极易污染。新月形孢子浓缩液添加保护剂及抗生素后采用海藻酸钙固定制作成为丸剂保存，使用时，将丸剂浸泡于柠檬酸钠溶液中溶解；该方式虽然一定程度上延长了制剂的保藏期限，然而保存后获得的孢子悬液活性显著降低，严重影响菌剂的防治效果。目前应用该制剂采用钻孔-钉塞-注射或直接喷洒的方式。树干注射的操作流程包括：在树干钻孔后，首先使用高压塞塞住钻孔，随后通过高压塞的单向橡胶注射孔向树体内注射药剂。该方法不仅操作流程复杂，且高压塞的制作成本较高，耗费大量人力物力；同时，制剂本身存在储藏期短、易污染、活性不稳定等缺点，难以实现高效、便捷的在大面积山林中应用防治松萎蔫病。由麦麸、松木屑等混合而成的固体培养基可为微生物提供足够的营养物质及微量元素，然而由于其本身是碎屑状，难以直接应用作为最终产品应用于松萎蔫病的生物防治实践中。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明通过在固体培养产物中添加一定比例的营养物质、保护剂、生长刺激因子以及产孢刺激因子、粘附剂并混合均匀后，向固体培养产物中添加无害塑化剂，并将其压制加工成为长棒状产品，最后在其表面包裹一层糯米纸，整个生产过程均与外界环境隔离，不需要人为操作，极大的降低了有人为因素或暴露于外界环境导致的污染。应用时只需要钻孔-钉入两个操作环节，无需使用高压塞，大大降低了人力、物力；同时大大延长了产品的储藏期限，显著提高了制剂的生物活性；解决了固体培养产物不能直接应用于生物防治的难题。本发明所采用的技术方案是：

一种快速应用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病的方法，包括有预先得到的伊氏杀线菌菌落，包括以下步骤：

(1)预处理：将操作间、超净工作台、固体搅拌发酵罐以及之后步骤中使用的所有器具进行灭菌处理，并将灭好菌的所有器具放入超净工作台，开启紫外灯、鼓风；操作人员穿戴好灭过菌的工作服、帽、口罩和手套；

(2)菌种制备：称取27gpdb粉末溶解于1l蒸馏水中，并分装于培养容器中，常规高温高压灭菌20分钟；冷却后接入伊氏杀线菌菌落，置于摇床上培养5-6天，培养温度为26℃，摇床转速为120转/分钟；培养结束后得到伊氏杀线菌菌种；

(3)菌剂扩繁：称取540gpdb粉末溶解于20l蒸馏水中，加入混合物重量0.1％的消泡剂，随后将混合液倒入发酵罐中，常规高温高压灭菌30分钟；当罐内液体培养基冷却至26℃时，在火焰消毒环境下将步骤(2)所得菌种接种至发酵罐内，26℃培养3-4天；

(4)固体发酵培养基配置：将麦麸、碎木屑、葡萄糖按照重量比5:4-4.8:0.2-1的比例混合均匀后，装入固体搅拌发酵罐，加入混合物重量10％的蒸馏水，采用常规高温高压灭菌1小时，得到无菌固体培养基；

(5)菌剂接种和培养：待步骤(4)所得无菌固体培养基冷却至室温后，将步骤(3)扩繁后的菌剂在无菌环境下接种至固体搅拌发酵罐中的培养基，室温环境下搅拌发酵培养14天，通气量为5m³/h，检测菌剂生长情况并调节固体培养产物的含水量至低于10％；

(6)通过取样和显微镜检查，确认步骤(5)固体培养产物生长良好且无污染后，向固体搅拌发酵罐中加入灭菌后的pda粉末、保护剂、菌丝生长刺激因子、产孢刺激因子以及粘附剂和塑化剂，并搅拌均匀，得到伊氏杀线菌固体培养产物；

(7)将步骤(6)所得伊氏杀线菌固体培养产物于无菌车间挤压加工成直径为0.8-1cm、长10-15cm的圆棒状，一端为圆锥状，另一端套入木制圆塞中，得初成品；并在初成品表面包裹一层糯米纸，得到成品制剂，封装并保存于4℃储藏，待用；

(8)使用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病：

a)根据所防治松树的直径，计算本发明产品的接种数量：直径为15cm以下时，接种2-3个；直径每增加15cm，增加一个接种孔；

b)首先用电钻在松树树干钻取直径1cm，10-15cm深的圆孔，再将步骤(7)所得成品制剂于封装袋内取出，小心置于钻得的松树圆孔内，并使用铁锤敲击塞紧即可。

本发明所述快速应用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病的方法，所述消泡剂是乳化硅油、高碳醇脂肪酸酯复合物、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚、聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚、聚氧丙烯甘油醚和聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚、聚二甲基硅氧烷中的任意一种。

优选的，本发明所述快速应用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病的方法，步骤(4)中麦麸、碎木屑、葡萄糖的重量比为5:4.5:0.5。

优选的，本发明所述快速应用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病的方法，步骤(6)中固体培养产物、pda粉末、保护剂、菌丝生长刺激因子、产孢刺激因子以及粘附剂和塑化剂的重量比为70：7：8.1:2.01:0.01:10:3；其中保护剂为山梨醇、peg8000、腐殖酸按照重量比5:3:0.1混合而得；菌丝生长刺激因子为马铃薯浸出液、酵母抽提物、硫胺素按照重量比1:1:0.01混合而得；产孢刺激因子为氯化钙；粘附剂为糊精；塑化剂为dehp。

以上操作步骤均在无菌条件下进行，并确保无外源污染物。所述的常规高温高压灭菌方法可选择121℃，100kpa。

有益效果：

本发明利用伊氏杀线菌固体培养产物直接应用于松萎焉病的防治，解决了原孢子生物制剂操作繁琐、防治成本高、储藏期短、易污染、生物活性低等问题。本发明通过在固体培养产物中添加一定比例的营养物质、保护剂、生长刺激因子以及产孢刺激因子、粘附剂并混合均匀后，向固体培养产物中添加无害塑化剂，并将其压制加工成为长棒状产品，最后在其表面包裹一层糯米纸，整个生产过程均与外界环境隔离，不需要人为操作，极大的降低了人为因素或暴露于外界环境导致的污染。应用时只需要钻孔-钉入两个操作环节，无需使用高压塞，大大降低了人力、物力；同时大大延长了产品的储藏期限(4-6个月)，显著提高了其生物活性；解决了固体培养产物不能直接应用于生物防治的难题。本发明应用于林间防治工作时操作简单、成本低廉、工作效率大大提高。

附图说明

图1为本发明成品结构模型示意图，2为木质圆塞，1为伊氏杀线菌固体培养产物经挤压形成的圆锥状本体；

图2为本发明成品结构模型沿a-a向的剖面示意图；

图3为本发明成品制剂的菌丝及孢子的形态显微照片；

图4为本发明制剂新月形孢子侵染、寄生并杀死松材线虫的显微照片；

图5为本发明制剂在不同储藏时间后生物活性与现有技术制剂的对比图；

图6为本发明钻孔钉入松树树干后菌丝在松树体内繁殖、扩散、产孢的显微照片；

图7为本发明钻孔钉入松树树干后在树体内孢子感染松材线虫的显微照片；

图8为本发明应用于野外防治的防治效率图表；

图9为本发明应用于野外防治实验中被感染松树携带的松材线虫数量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。

实施例1

一种快速应用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病的方法，包括有预先得到的伊氏杀线菌菌落，包括以下步骤：

(1)预处理：将操作间、超净工作台、固体搅拌发酵罐以及之后步骤中使用的所有器具进行灭菌处理，并将灭好菌的所有器具放入超净工作台，开启紫外灯、鼓风；操作人员穿戴好灭过菌的工作服、帽、口罩和手套；

(2)菌种制备：称取27gpdb粉末溶解于1l蒸馏水中，并分装于培养容器中，常规高温高压灭菌20分钟；冷却后接入伊氏杀线菌菌落，置于摇床上培养6天，培养温度为26℃，摇床转速为120转/分钟；培养结束后得到伊氏杀线菌菌种；

(3)菌剂扩繁：称取540gpdb粉末溶解于20l蒸馏水中，加入混合物重量0.1％的消泡剂，随后将混合液倒入发酵罐中，常规高温高压灭菌30分钟；当罐内液体培养基冷却至26℃时，在火焰消毒环境下将步骤(2)所得菌种接种至发酵罐内，26℃培养4天；

(4)固体发酵培养基配置：将麦麸、碎木屑、葡萄糖按照重量比5:4.5:0.5的比例混合均匀后，装入固体搅拌发酵罐，加入混合物重量10％的蒸馏水，采用常规高温高压灭菌1小时，得到无菌固体培养基；

(5)菌剂接种和培养：待步骤(4)所得无菌固体培养基冷却至室温后，将步骤(3)扩繁后的菌剂在无菌环境下接种至固体搅拌发酵罐中的培养基，室温环境下搅拌发酵培养14天，通气量为5m³/h，检测菌剂生长情况并调节固体培养产物的含水量至低于10％；

(6)取少量固体发酵产物，在光学显微镜下检查菌丝生长状态及产孢量，确认步骤(5)固体培养产物生长良好且无污染后，向固体搅拌发酵罐中加入灭菌后的pda粉末、保护剂、菌丝生长刺激因子、产孢刺激因子以及粘附剂和塑化剂，并搅拌均匀，得到伊氏杀线菌固体培养产物；

(7)将步骤(6)所得伊氏杀线菌固体培养产物于无菌车间挤压加工成直径为0.8cm、长10-15cm的圆棒状，一端为圆锥状，另一端套入木制圆塞中，得初成品；并在初成品表面包裹一层糯米纸，得到成品制剂，封装并保存于4℃储藏，待用；如图1所示，为本发明成品结构模型示意图，2为木质圆塞，1为伊氏杀线菌固体培养产物经挤压形成的圆锥状本体；其中a-a界面的剖面示意图如图2所示，其中2为木质圆塞，1为伊氏杀线菌固体培养产物经挤压形成的圆锥状本体；

(8)使用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病：

a)根据所防治松树的直径，计算本发明产品的接种数量：直径为15cm以下时，接种2-3个；直径每增加15cm，增加一个接种孔；

b)首先用电钻在患病松树树干钻取直径1cm，10-15cm深的圆孔，再将步骤(7)所得成品制剂于封装袋内取出，小心置于钻得的松树圆孔内，并使用铁锤敲击塞紧即可。

所述消泡剂是乳化硅油。

步骤(6)中固体培养产物、pda粉末、保护剂、菌丝生长刺激因子、产孢刺激因子以及粘附剂和塑化剂的重量比为70：7：8.1:2.01:0.01:10:3；其中保护剂为山梨醇、peg8000、腐殖酸按照重量比5:3:0.1混合而得；菌丝生长刺激因子为马铃薯浸出液、酵母抽提物、硫胺素按照重量比1:1:0.01混合而得；产孢刺激因子为氯化钙；粘附剂为糊精；塑化剂为dehp。

以上操作步骤均在无菌条件下进行，并确保无外源污染物。

实施例2

一种快速应用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病的方法，包括有预先得到的伊氏杀线菌菌落，包括以下步骤：

(1)预处理：将操作间、超净工作台、固体搅拌发酵罐以及之后步骤中使用的所有器具进行灭菌处理，并将灭好菌的所有器具放入超净工作台，开启紫外灯、鼓风；操作人员穿戴好灭过菌的工作服、帽、口罩和手套；

(2)菌种制备：称取27gpdb粉末溶解于1l蒸馏水中，并分装于培养容器中，常规高温高压灭菌20分钟；冷却后接入伊氏杀线菌菌落，置于摇床上培养5天，培养温度为26℃，摇床转速为120转/分钟；培养结束后得到伊氏杀线菌菌种；

(3)菌剂扩繁：称取540gpdb粉末溶解于20l蒸馏水中，加入混合物重量0.1％的消泡剂，随后将混合液倒入发酵罐中，常规高温高压灭菌30分钟；当罐内液体培养基冷却至26℃时，在火焰消毒环境下将步骤(2)所得菌种接种至发酵罐内，26℃培养3天；

(4)固体发酵培养基配置：将麦麸、碎木屑、葡萄糖按照重量比5:4.8:0.2的比例混合均匀后，装入固体搅拌发酵罐，加入混合物重量10％的蒸馏水，采用常规高温高压灭菌1小时，得到无菌固体培养基；

(5)菌剂接种和培养：待步骤(4)所得无菌固体培养基冷却至室温后，将步骤(3)扩繁后的菌剂在无菌环境下接种至固体搅拌发酵罐中的培养基，室温环境下搅拌发酵培养14天，通气量为5m³/h，检测菌剂生长情况并调节固体培养产物的含水量至低于10％；

(6)取少量固体发酵产物，在光学显微镜下检查菌丝生长状态及产孢量，确认步骤(5)固体培养产物生长良好且无污染后，向固体搅拌发酵罐中加入灭菌后的pda粉末、保护剂、菌丝生长刺激因子、产孢刺激因子以及粘附剂和塑化剂，并搅拌均匀，得到伊氏杀线菌固体培养产物；

(7)将步骤(6)所得伊氏杀线菌固体培养产物于无菌车间挤压加工成直径为0.9cm、长10-15cm的圆棒状，一端为圆锥状，另一端套入木制圆塞中，得初成品；并在初成品表面包裹一层糯米纸，得到成品制剂，封装并保存于4℃储藏，待用；

(8)使用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病：

a)根据所防治松树的直径，计算本发明产品的接种数量：直径为15cm以下时，接种2-3个；直径每增加15cm，增加一次接种次数；

b)首先用电钻在患病松树树干钻取直径1cm，10-15cm深的圆孔，再将步骤(7)所得成品制剂于封装袋内取出，小心置于钻得的松树圆孔内，并使用铁锤敲击塞紧即可。

所述消泡剂是聚氧丙烯甘油醚。

步骤(6)中固体培养产物、pda粉末、保护剂、菌丝生长刺激因子、产孢刺激因子以及粘附剂和塑化剂的重量比为70：7：8.1:2.01:0.01:10:3；其中保护剂为山梨醇、peg8000、腐殖酸按照重量比5:3:0.1混合而得；菌丝生长刺激因子为马铃薯浸出液、酵母抽提物、硫胺素按照重量比1:1:0.01混合而得；产孢刺激因子为氯化钙；粘附剂为糊精；塑化剂为dehp。

以上操作步骤均在无菌条件下进行，并确保无外源污染物

实施例3

一种快速应用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病的方法，包括有预先得到的伊氏杀线菌菌落，包括以下步骤：

(1)预处理：将操作间、超净工作台、固体搅拌发酵罐以及之后步骤中使用的所有器具进行灭菌处理，并将灭好菌的所有器具放入超净工作台，开启紫外灯、鼓风；操作人员穿戴好灭过菌的工作服、帽、口罩和手套；

(2)菌种制备：称取27gpdb粉末溶解于1l蒸馏水中，并分装于培养容器中，常规高温高压灭菌20分钟；冷却后接入伊氏杀线菌菌落，置于摇床上培养6天，培养温度为26℃，摇床转速为120转/分钟；培养结束后得到伊氏杀线菌菌种；

(3)菌剂扩繁：称取540gpdb粉末溶解于20l蒸馏水中，加入混合物重量0.1％的消泡剂，随后将混合液倒入发酵罐中，常规高温高压灭菌30分钟；当罐内液体培养基冷却至26℃时，在火焰消毒环境下将步骤(2)所得菌种接种至发酵罐内，26℃培养4天；

(4)固体发酵培养基配置：将麦麸、碎木屑、葡萄糖按照重量比5:4.8:0.2的比例混合均匀后，装入固体搅拌发酵罐，加入混合物重量10％的蒸馏水，采用常规高温高压灭菌1小时，得到无菌固体培养基；

(5)菌剂接种和培养：待步骤(4)所得无菌固体培养基冷却至室温后，将步骤(3)扩繁后的菌剂在无菌环境下接种至固体搅拌发酵罐中的培养基，室温环境下搅拌发酵培养14天，通气量为5m³/h，检测菌剂生长情况并调节固体培养产物的含水量至低于10％；

(6)取少量固体发酵产物，在光学显微镜下检查菌丝生长状态及产孢量，确认步骤(5)固体培养产物生长良好且无污染后，向固体搅拌发酵罐中加入灭菌后的pda粉末、保护剂、菌丝生长刺激因子、产孢刺激因子以及粘附剂和塑化剂，并搅拌均匀，得到伊氏杀线菌固体培养产物；

(7)将步骤(6)所得伊氏杀线菌固体培养产物于无菌车间挤压加工成直径为0.9cm、长10-15cm的圆棒状，一端为圆锥状，另一端套入木制圆塞中，得初成品；并在初成品表面包裹一层糯米纸，得到成品制剂，封装并保存于4℃储藏，待用；

(8)使用伊氏杀线菌固体培养产物防治松萎蔫病：

a)根据所防治松树的直径，计算本发明产品的接种数量：直径为15cm以下时，接种2-3个；直径每增加15cm，增加一次接种次数；

b)首先用电钻在患病松树树干钻取直径1cm，10-15cm深的圆孔，再将步骤(7)所得成品制剂于封装袋内取出，小心置于钻得的松树圆孔内，并使用铁锤敲击塞紧即可。

所述消泡剂是聚二甲基硅氧烷。

步骤(6)中固体培养产物、pda粉末、保护剂、菌丝生长刺激因子、产孢刺激因子以及粘附剂和塑化剂的重量比为70：7：8.1:2.01:0.01:10:3；其中保护剂为山梨醇、peg8000、腐殖酸按照重量比5:3:0.1混合而得；菌丝生长刺激因子为马铃薯浸出液、酵母抽提物、硫胺素按照重量比1:1:0.01混合而得；产孢刺激因子为氯化钙；粘附剂为糊精；塑化剂为dehp。

以上操作步骤均在无菌条件下进行，并确保无外源污染物。

测试及防治应用试验

对比本发明实施例1所得制剂与申请号为201310642065.1的发明专利所得生物制剂的生物活性，对比图如图5所示，从图中数据可得经过本发明处理的制剂较现有技术公开制剂的生物活性高且活性稳定，可大大延长产品的储藏期限。

为验证本发明制剂效果，发明人于2016年6月-2018年10月间，选取长势均匀、健康状况良好的松树90棵，随机分成3组，分别为s1-s3，其中s1和s2接种同等数量的松材线虫，s1同时使用本发明实施例1所得制剂进行处理，s2不做任何处理；s3为空白对照，不接种松材线虫也不做其他处理。期间采取相同的林间管理。

统计松树成活率，其防治效果图如图8所示，从图中我们可以看出：接种了松材线虫的s2，松树存活率迅速下降，实验结束后，松树存活率降至0，松材线虫对松树致死率为100％；而接种松材线虫后使用本发明实施例1所得制剂处理后的s1，松树最终存活率在80％左右，且存活率呈现平缓下降后趋于稳定，可见本发明制剂对感染松材线虫的松树具有较好的治疗效果；而不做任何处理的对照组s3则生长状况良好，表明本实验结果未受外界环境因素干扰。

同时对试验组结束后s1和s2中死亡松树木质部中松材线虫数量进行分析和统计，其结果如图9所示：松材线虫对照组s2平均每10g重量的松树样本中含松材线虫260头左右，而试验组s1平均每10g重量的松树样本中仅含50头左右。

需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。