一株高产6-磷酸-β-半乳糖苷酶的乳酸乳球菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株高产6-磷酸-β-半乳糖苷酶的乳酸乳球菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

发酵乳制品是以牛乳作为主要原料，经乳酸菌发酵或乳酸菌、酵母菌共同发酵制成的酸性乳制品，其作为一种乳产品，凭借独特的口感与风味深受人们的喜爱，已经畅销市场多年。有研究表明，影响消费者购买发酵乳制品的主要因素有风味、价格、可用性和品牌，其中，风味占比最重，因此，提升发酵乳制品的风味无疑是企业迎合市场最重要的手段。

乳糖是牛乳中最主要的碳水化合物，占牛乳中碳水化合物总量的99％以上，且乳糖经初步代谢会生成6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘油醛，6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘油醛会通过糖酵解途径进一步代谢生成丙酮酸，而丙酮酸会最终代谢生成乳酸、乙醛、乙酸、双乙酰及乙偶姻等发酵乳制品中重要的风味物质，因此，乳酸菌的乳糖代谢特性对发酵乳制品的制备至关重要。

乳酸菌中主要存在两条乳糖代谢通路，这两条代谢途径的关键酶分别是β-半乳糖苷酶和6-磷酸-β-半乳糖苷酶，其中，β-半乳糖苷酶在乳酸菌中普遍存在，而6-磷酸-β-半乳糖苷酶仅在少数几种乳酸菌(主要包括干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、屎肠球菌和粪肠球菌)中完成了生化表征，且目前发现的这些可产6-磷酸-β-半乳糖苷酶的乳酸菌多数6-磷酸-β-半乳糖苷酶产量并不高，不足以达到影响发酵乳制品品质的地步。

因此，找到一种高产6-磷酸-β-半乳糖苷酶的乳酸菌，以期作为发酵剂应用于乳制品发酵，以降低发酵乳制品中乳糖含量，提升发酵乳制品的品质，是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一株乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033，此乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033具有生长速率快(将此菌株以1×10⁷cfu/ml的接种量接种至牛乳中发酵2h，即可使发酵乳中乳酸乳球菌的活菌数达8.37×10⁸cfu/ml)、6-磷酸-β-半乳糖苷酶产量高(将此菌株以2％的接种量接种至mrs液体培养基中培养至od600达1.736，即可使6-磷酸-β-半乳糖苷酶的酶活达96.9u/l)且产香特性良好(将此菌株以1×10⁷的接种量接种至牛乳中发酵12h，即可代谢牛乳中10.2％的乳糖，同时，使得到的发酵乳中双乙酰和乙偶姻的含量分别达5.83μg/kg和31.44μg/kg)的优势，能有效降低发酵乳制品中乳糖含量，且有利于发酵乳制品品质的提高，在发酵乳制品的制备中具有很重要的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一株乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033，所述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033已于2018年09月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.60450，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

所述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033是从中国青海西宁地区传统发酵乳制品曲拉中分离得到的，该菌株经测序分析，其16srrna序列如seqidno.1所示，将该序列在genbank中进行比对，结果显示此菌株为乳酸乳球菌，命名为乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033。

所述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033的细胞呈球状，革兰氏染色结果为紫色，即为革兰氏阳性菌，且其在mrs固体培养基上生长时的菌落呈乳白色，有光泽，边缘光滑，凸起，中等大小。

本发明提供了含有上述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033的发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033接种至培养基中，于30℃下培养至乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033活菌浓度不低于1×10⁸cfu/ml，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用缓冲液清洗2～3次后用冻干保护剂重悬至菌浓度不低于1×10⁹cfu/ml，得到菌悬液；将悬浮液干燥，得到发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为mrs培养基或m17培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为双蒸水、生理盐水或磷酸盐缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂为蔗糖、海藻糖或脱脂乳粉。

在本发明的一种实施方式中，所述干燥为真空冷冻干燥。

本发明提供了上述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033或上述发酵剂在制备食品方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述食品为使用上述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033或上述发酵剂生产得到的发酵乳制品。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵乳制品包含发酵乳、发酵乳饮料、奶酪或马奶酒。

本发明提供了一种发酵乳的制备方法，所述方法为使用上述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033或上述发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将牛乳经均质、巴氏杀菌后冷却，得到发酵原料；在发酵原料中接种上述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033或上述发酵剂进行发酵，得到发酵乳。

在本发明的一种实施方式中，所述牛乳包含原料乳、复原乳或脱脂乳。

所述脱脂乳是指是将牛乳中的脂肪脱去后得到的乳液；所述原料乳是指从奶牛乳房挤出未经过任何处理的生牛奶；所述复原乳是指把牛奶浓缩、干燥成为浓缩乳或乳粉，再添加适量水，制成与原乳中水、固体物比例相当的乳液。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将牛乳在压力14mpa～21mpa、温度40～85℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，得到灭菌后的牛乳；将灭菌后的牛乳冷却至21～30℃，得到发酵原料；在发酵原料中接种上述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033或上述发酵剂后于37℃下发酵12h，得到发酵乳；将酸奶在4℃的条件下放置24～48h，得到后熟后的发酵乳成品。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033或发酵剂在发酵原料中的接种量为乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033在发酵原料中的活菌数达1×10⁶～1×10⁷cfu/ml。

本发明提供了应用上述制备方法制备得到的发酵乳。

有益效果：

(1)本发明的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033具有生长速率快、6-磷酸-β-半乳糖苷酶产量高且产香特性良好的优势，能有效降低发酵乳制品中乳糖含量，且有利于发酵乳制品品质的提高，在发酵乳制品的制备中具有很重要的应用；

(2)将本发明的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033以1×10⁷cfu/ml的接种量接种至牛乳中发酵2h，即可使发酵乳中乳酸乳球菌的活菌数达8.37×10⁸cfu/ml；

(3)将本发明的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033以2％(v/v)的接种量接种至mrs液体培养基中培养至od600达1.736，即可使培养液中6-磷酸-β-半乳糖苷酶的酶活达96.9u/l；

(4)将本发明的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033以1×10⁷的接种量接种至牛乳中发酵12h，即可代谢牛乳中10.2％的乳糖，同时，使得到的发酵乳中双乙酰和乙偶姻的含量分别达5.83μg/kg和31.44μg/kg；

(5)利用本发明的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033制备得到的发酵乳乙醛、双乙酰和乙偶姻等挥发性风味物质含量高，乳糖含量低，具有较好的品质。

生物材料保藏

一株乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033，分类学命名为lactococcuslactis，已于2018年09月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.60450，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1：本发明菌株的革兰氏染色特征；

图2：本发明菌株菌落特征；

图3：本发明菌株在脱脂乳中的生长状况；

图4：本发明菌株在脱脂乳中发酵的ph变化情况；

图5：本发明菌株在脱脂乳中发酵的酸度变化情况；

图6：本发明菌株在mrs培养基中的6-磷酸-β-半乳糖苷酶产量；

图7：本发明菌株在脱脂乳中发酵的乳糖变化情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的脱脂乳购自光明乳品股份有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

mrs固体培养基：胰蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母浸粉5.0g/l、柠檬酸氢二胺2.0g/l、葡萄糖20.0g/l、吐温801ml/l、无水乙酸钠2.0g/l、七水硫酸镁0.5g/l、一水合硫酸锰0.25g/l、三水磷酸氢二钾2.6g/l，加入蒸馏水完全溶解后按1.5％(m/v)的量添加纯化琼脂粉，115℃灭菌20min。

mrs液体培养基：胰蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母浸粉5.0g/l、柠檬酸氢二胺2.0g/l、葡萄糖20.0g/l、吐温801ml/l、无水乙酸钠2.0g/l、七水硫酸镁0.5g/l、一水合硫酸锰0.25g/l、三水磷酸氢二钾2.6g/l，加入蒸馏水完全溶解后，115℃灭菌20min。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

活菌数的检测方法：采用国标《gb4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。

ph检测方法：采用ph计测量。

酸度检测方法：采用国标gb431334-2010。

6-磷酸-β-半乳糖苷酶酶活的检测方法：吸取100μl对数期菌液加入900μlzbuffer磷酸盐缓冲溶液，加入10μl三氯甲烷，涡旋震荡10s，加入200μl6-磷酸-onpg底物溶液，置于30℃金属浴中恒温反应，并开始计时；当的od420达到0.6～0.9之间时，加入500μl1mol/lna2co3溶液终止反应，测定终止反应后od420，并记录反应时间，最长反应时间为90min；

按酶活力＝(1000×od420)/[od600×v菌液(ml)×反应时间(min)]计算6-磷酸-β-半乳糖苷酶的活性。

挥发性物质含量检测：gc-ms测发酵后酸奶中的挥发性物质含量；

气相色谱条件及升温程序：选择rtx-wax毛细管(30m×0.25mm，0.25mm)，进样口温度225℃，分流比10，载气(氦气)流速1ml/min。升温程序设置初始温度30℃，保持3min，以15℃/min升温至225℃，保持5min；

质谱条件：离子化方式ei，发射能量70ev，发射电流200μa，检测器电压1.4kv，离子源温度240℃，接口温度230℃，四级杆温度150℃，质量扫描范围m/z30～500；

将gc-ms得到的谱图，在nist2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，用峰面积归一化法定量。

乳糖含量的检测：称取1g(精确到0.001g)发酵乳样品于10ml容量瓶中，加入70％(v/v)乙醇定容至刻度，混匀后4℃提取24h，11000g、4℃离心10min，取上清液进行衍生化，微孔滤膜过滤后采用高效液相色谱测定(外标法定量分析乳糖含量)。

实施例1：菌株的筛选及鉴定

1、筛选

(1)制备合适的样品稀释梯度并培养

将-80℃冰箱中贮藏的青海西宁传统发酵乳制品曲拉甘油样品取出，置于冰上解冻，震荡混匀后取0.5ml样品加入4.5ml无菌生理盐水中，完成一次10倍稀释，振荡混匀后再从该稀释液中取出0.5ml稀释液加入4.5ml无菌生理盐水中，完成第二次10倍稀释，以此类推，直至稀释到10^-6，从每个梯度的稀释液中吸取100μl，均匀涂布于mrs固体培养基平板上，倒置，放于37℃厌氧下培养36～48h，并及时观察。

(2)划线分离与纯化

将长出菌落的平板取出后，选取单菌落明显的梯度平板，挑取不同菌落形态的菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。

(3)革兰氏染色和过氧化氢酶实验

挑取单菌落于载玻片上，经过涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后镜检，记录革兰氏染色结果；并挑取单菌落于载玻片上，加入3％过氧化氢溶液，观察有无气泡产生，并记录过氧化氢酶接触结果以鉴定挑选的菌株是否具有乳酸菌的特征。

(4)菌种保藏

将纯化完成后的每株菌株的单菌落挑入5mlmrs液体培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20～24h，吸取1ml菌液至保菌管中，6000rpm离心3min，倾去上清，加入1ml30％无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。

2、鉴定

(1)16srdna序列扩增

吸取1ml上述菌液6000rpm离心3min，倾去上清，水洗两次，离心倾去上清液，获得菌泥，以此为模板，进行pcr扩增，流程如下：

1)扩增体系20μl：

其中模板量为1μl(27f0.5μl、1492r0.5μl)，taq酶mastermix为10μl，ddh2o为7μl，所用引物为27f：agagtttgatcctggcctca(seqidno2)和1492r：ggttaccttgttacgactt(seqidno3)。

2)扩增条件：

预变性：95℃3min

第一步变性：94℃1min

第二步退火：60℃30s

第三步延伸：72℃2min

循环次数：30次循环

第四步最后延伸：72℃5min

第五步保持：12℃10min

(2)琼脂糖凝胶电泳

称取80ml琼脂糖加入锥形瓶中，加入80ml1xtae，微波间断式加热4min，至液体澄清透明，稍稍冷却，加入4μl核酸染料，摇匀，无气泡，倒入胶板槽中，冷却40min凝固后，置于电泳槽中，排气泡，依次加入pcr扩增产物，每个孔中加入2μlpcr扩增产物，120v15min跑胶结束后取出，置于凝胶电泳成像仪中拍照保存，记录pcr成功样品的编号，将成功的pcr产物置于-20℃冰箱中保藏。

(3)菌株序列送测与鉴定

将pcr成功的样品送到华大基因进行检测，根据华大基因反馈的序列结果，结合ncbi菌株序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行blast检索，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录，pcr成功的两株菌株均为乳酸乳球菌，分别命名为为乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033以及乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12。

实施例2：菌株的培养

将乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033接种于mrs固体培养基，置于30℃倒置培养48h，观察菌落形态；挑取单菌落于载玻片上，经过涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后镜检，记录形态和革兰氏染色结果。

油镜下观察到的乳酸乳球菌ccfm1033呈球状，革兰氏染色结果为紫色，即为革兰氏阳性菌(见图1)；并且，该菌株在固体mrs培养基上的菌落呈白色、有光泽、边缘光滑、不透明、微凸起、中等大小(见图2)。

实施例3：菌株在乳体系中的生长特性

1、乳酸乳球菌在脱脂乳中生长12h的生长曲线

将-80℃保存的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033以及乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12分别接种于mrs液体培养基中，在30℃下培养24h，传代培养2～3次，至菌浓度达10⁸～10⁹cfu/ml；取出在mrs中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于脱脂乳中，使体系中的菌量达到10⁷cfu/g；将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵，每隔2h取样，检测发酵过程菌量的变化，结果如图3所示。

由图3可知，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033在发酵2h后菌量达到8.37×10⁸cfu/ml，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12在发酵2h后菌量达到7.95×10⁸cfu/ml，因此，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033在脱脂乳中生长速率更快。

2、乳酸乳球菌在脱脂乳中生长12h的ph和滴定酸度变化

将-80℃保存的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033以及乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12分别接种于mrs液体培养基中，在30℃下培养24h，传代培养2～3次，至菌浓度10⁸～10⁹cfu/ml；取出在mrs中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于脱脂乳中，使体系中的菌量达到10⁷cfu/g；将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵，每隔2h取样，检测发酵过程中ph和滴定酸度的变化，实验结果如图4所示。

由图4可知，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033在发酵12h后ph为5.46、酸度为45.10°t，产酸速率比乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12快。

实施例4：菌株的6-磷酸-β-半乳糖苷酶产量

将-80℃保存的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033以及乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12分别接种于mrs液体培养基中，在30℃下培养24h，传代培养2～3次，至菌浓度10⁸～10⁹cfu/ml；将mrs中活化后的菌液按2％体积比接种于乳糖mrs液体培养基中，培养至对数期，测定od600值为1.736；吸取100μl对数期菌液进行6-磷酸-β-半乳糖苷酶酶活的检测，结果如图4所示。

由图4可知，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033的6-磷酸-β-半乳糖苷酶活力为96.9u，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12的6-磷酸-β-半乳糖苷酶活力为1.03u，因此，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033的6-磷酸-β-半乳糖苷酶产量更高。

实施例5：菌株的应用

将-80℃保存的乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033以及乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12分别接种于mrs液体培养基中，在30℃下培养24h，传代培养2～3次，至菌浓度10⁸～10⁹cfu/ml；取出在mrs中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于脱脂乳中，使体系中的菌量达到10⁷cfu/g；将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵12h，得到发酵乳；吸取发酵乳进行挥发性物质含量以及乳糖含量检测，挥发性物质含量如表1所示，乳糖含量如图5所示。

由表1可知，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033在发酵12h后，发酵乳中的乙醛、双乙酰和乙偶姻的产量都较高，分别达到1.07μg/kg、5.83μg/kg和31.44μg/kg，而乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12分别达到0.29μg/kg、0.29μg/kg和0.62μg/kg，因此，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033产香特性优良。

由图5可知，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033在发酵12h后，发酵乳中的乳糖含量较低，为5873.82mg/100g，而乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12为6470.60mg/100g，因此，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033发酵后乳糖含量显著低于乳酸乳球菌(lactococcuslactis)d-xj4-12，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)ccfm1033乳糖利用能力强。

表1慢发酵12h后挥发性物质含量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一株高产6-磷酸-β-半乳糖苷酶的乳酸乳球菌及其应用

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1374

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gtactcccaactcccgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcacc60

gcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagccta120

caatccgaactgagaatggttttaagagattagctaaacatcactgtctcgcgactcgtt180

gtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtc240

atccccaccttcctccggtttatcaccggcagtctcgttagagtgcccaacttaatgatg300

gcaactaacaataggggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgag360

ctgacgacaaccatgcaccacctgtatcccgtgtcccgaaggaacttcctatctctagga420

atagcacgagtatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacat480

gctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtact540

ccccaggcggagtgcttattgcgttagctgcgatacagagaacttatagctccctacatc600

tagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgc660

tttcgagcctcagtgtcagttacaggccagagagccgctttcgccaccggtgttcctcca720

tatatctacgcatttcaccgctacacatggaattccactctcctctcctgcactcaagtc780

taccagtttccaatgcatacaatggttgagccactgccttttacaccagacttaataaac840

cacctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgctcgggacctacgtattaccg900

cggctgctggcacgtagttagccgtccctttctgggtagttaccgtcacttgatgagctt960

tccactctcaccaacgttcttctctaccaacagagttttacgatccgaaaaccttcttca1020

ctcacgcggcgttgctcggtcagactttcgtccattgccgaagattccctactgctgcct1080

cccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaccctctcaggtcggc1140

tatgtatcatcgccttggtgagcctttacctcaccaactagctaatacaacgcgggatca1200

tctttgagtgatgcaattgcatctttcaaacttaaaacttgtgtttaaagtttttatgcg1260

gtattagcattcgtttccaaatgttgtcccccgctcaaaggcagattccccacgcgttac1320

tcacccgttcgctgctcatccagtcggtacaagtaccaaccttcagcgctcaac1374

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agagtttgatcctggcctca20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggttaccttgttacgactt19