一种益生菌胞外多糖的提取方法与流程

本发明涉及一种益生菌胞外多糖的提取方法，属于微生物学领域。

背景技术：

益生菌胞外多糖是指一些益生菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的次级代谢产物，根据其与细胞壁结合的能力强弱可分为两种，一种失去与细胞结合的能力而渗入培养基形成粘液，称粘液多糖；另一种粘附于细胞壁形成荚膜，称荚膜多糖。在自然环境中，胞外多糖通常起着保护微生物的作用，它可以避免细胞干燥脱水，遭噬菌体浸染、受抗生素或者有毒物质损害、原生动物伤害，还可以稳定渗透压、支持细胞结构、参与细胞信息传递和细胞构成等。

益生菌胞外多糖作为一种安全的天然产物，因其独特的理化特性，越来越多地被应用于食品工业中。它能改善乳制品和豆乳制品的流变性、乳化性、黏着性以及质构特性，使其变得更加细腻均匀、平滑稠密，还能提高焙烤类食品保水性，改善面包体积和柔软度。近年来，随着研究的深入，益生菌胞外多糖的抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等生理功能也逐渐引起人们的关注。

目前，胞外多糖提取过程中除蛋白的方法多采用三氯乙酸法，该法反应剧烈，极易破坏多糖的结构，且三氯乙酸本身具有毒性，此法得到的多糖不利于功能性研究与应用。

由于益生菌菌株本身特性不同，现有生产方法中，其胞外多糖产量从几十到几百毫克每升不等，得率较低，制约其大规模生产，因此如何提高产量与提取量是目前急需解决的问题。当前我们对优化培养基成分与发酵条件提高胞外多糖产量的研究较多，而对优化从发酵液中提取胞外多糖的研究甚少。

技术实现要素：

针对益生菌胞外多糖提取量的问题，本发明的目的是提供一种能提高益生菌胞外多糖提取量的制备方法。

本发明采用的技术方案是：一种益生菌胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：

1)除菌体：将益生菌发酵液在4℃条件下，10000r/min离心10min，除去沉淀菌体，保留上清液；

2)除蛋白：向步骤1)中所得的上清液中加入聚酰胺，室温下置于摇床振荡2-10h，使蛋白质吸附于聚酰胺，然后抽滤去除聚酰胺；

3)浓缩：将步骤2)所得滤液浓缩至原体积的20-80％，得浓缩液；

4)醇沉：调节浓缩液的ph，加入95％乙醇，4℃静置，离心，倾去上清液，沉淀用适量蒸馏水溶解后，置透析袋中透析24h，冻干保存。

上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤2)中，按固液比，聚酰胺：上清液＝40-200g：1l。

上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤2)中，按固液比，聚酰胺：上清液＝120g：1l。

上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤2)中，所述的聚酰胺粒径为80-100目。

上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤3)中，将步骤2)所得滤液浓缩至原体积的20％。

上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤4)中，所述的95％乙醇的加入量是浓缩液的1-5倍。

上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤4)中，所述的95％乙醇的加入量是浓缩液的4倍。

上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤4)中，所述的静置的时间为2-16h。

上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤4)中，所述的ph调节至5-9。

上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，所述的益生菌为鼠李糖乳杆菌。

本发明的有益效果是：

1.本发明通过优化除蛋白和醇沉工艺，得出益生菌胞外多糖提取率较高且经济适用的除蛋白和醇沉条件。

2.通过本发明的方法制备的益生菌胞外多糖具有抗氧化作用。

3.本发明采用聚酰胺，通过吸附作用除去发酵液中的蛋白质及其它杂质，反应条件温和、无毒害，且聚酰胺能够回收利用，具有节能环保的特点。

附图说明

图1为本发明得到的鼠李糖乳杆菌胞外多糖，呈淡黄色粉末。

图2为鼠李糖乳杆菌胞外多糖对dpph自由基的清除作用。

图3为鼠李糖乳杆菌胞外多糖对oh自由基的清除作用。

具体实施方式

实施例1鼠李糖乳杆菌发酵液除蛋白条件的确定

方法：1)活化：将鼠李糖乳杆菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlmrs培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得鼠李糖乳杆菌发酵种子液。

2)发酵：将鼠李糖乳杆菌发酵种子液以2％的接种量接种于mrs液体培养基中，调节初始ph值为6.5，于37℃下，转速为100r/min，培养24h，得发酵液。mrs液体培养基的组成为：低聚半乳糖1％，大豆蛋白胨2％，磷酸盐0.2％，酵母粉0.5％，柠檬酸氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，其余为蒸馏水。

3)除菌体：将步骤2)中所得的发酵液在4℃条件下，10000r/min离心10min去除沉淀菌体，保留上清液。

4)除蛋白：在步骤3)中所得的上清液中加入(80-100)目的聚酰胺，室温下摇床振摇，抽滤除去吸附蛋白质的聚酰胺。

5)蛋白质清除率测定：用考马斯亮蓝法测定发酵液中剩余蛋白质的浓度，计算蛋白质的清除率。

(一)不同除蛋白时间的影响

方法同上。按固液比，聚酰胺：上清液＝80g：1l，向上清液中加入聚酰胺，振摇时间如表1。结果如表1：

表1

由表1可见，蛋白质清除率随振摇时间的延长而提高，振摇4h以上时，蛋白质清除率变化不明显，综合考虑除蛋白效果与时间成本，选择4h为最优除蛋白时间，蛋白质清除率可达56.8％。

(二)不同聚酰胺添加量的影响

方法同上。在除菌体后的上清液中加入聚酰胺，添加量如表2，振摇6h。结果如表2：

表2

由表2可见，蛋白质清除率随聚酰胺添加量的升高而提高，聚酰胺添加量大于120g/l时清除率变化不明显，综合考虑除蛋白效果与成本，选择120g/l为聚酰胺最优添加量，蛋白质清除率可达59.9％。

由实施例1得出，鼠李糖乳杆菌胞外多糖的最佳除蛋白条件为：按固液比，聚酰胺：上清液＝120g：1l的比例加入聚酰胺，摇床振摇4h。

实施例2鼠李糖乳杆菌发酵液浓缩条件的确定

方法：1)活化：将鼠李糖乳杆菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlmrs培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得鼠李糖乳杆菌发酵种子液。

2)发酵：将鼠李糖乳杆菌发酵种子液以2％的接种量接种于mrs液体培养基中，调节初始ph值为6.5，于37℃下，转速为100r/min，培养24h，得发酵液。

mrs液体培养基的组成为：低聚半乳糖1％，大豆蛋白胨2％，磷酸盐0.2％，酵母粉0.5％，柠檬酸氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，其余为蒸馏水。

3)除菌体：将步骤2)中所得的发酵液在4℃条件下，10000r/min离心10min去除沉淀菌体，得上清液。

4)除蛋白：按固液比，聚酰胺：上清液＝120g：1l，向上清液中加入(80-100)目的聚酰胺，室温下摇床振摇4h，抽滤除去吸附蛋白质的聚酰胺。

5)浓缩：将步骤4)所得产物进行浓缩，得浓缩液。

6)醇沉：向浓缩液中加入浓缩液三倍体积的95％乙醇，于4℃冷藏12h。于4℃条件下10000r/min离心10min，除去上清液，沉淀以定量蒸馏水溶解，即得胞外多糖溶液。冻干后称重，并计算胞外多糖得率。

(一)浓缩体积分数的影响

方法同上。发酵液经离心除菌体、除蛋白后，如表3进行浓缩。结果如表3：

表3

由表3可见，多糖得率随浓缩后体积的减小而增大。但当浓缩倍数过高时会导致醇沉得到的多糖颜色较深，且耗能较大。综合考虑得率与经济因素，选择浓缩至原体积的20％作为最优条件，多糖得率可达11.804g/l。

实施例3鼠李糖乳杆菌胞外多糖醇沉条件的确定

方法：1)活化：将鼠李糖乳杆菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlmrs培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得到鼠李糖乳杆菌发酵种子液。

2)发酵：将鼠李糖乳杆菌发酵种子液以2％的接种量接种于mrs液体培养基中，调节初始ph值为6.5，于37℃下，转速为100r/min，培养24h，得发酵液。

mrs液体培养基的组成为：低聚半乳糖1％，大豆蛋白胨2％，磷酸盐0.2％，酵母粉0.5％，柠檬酸氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，其余为蒸馏水。

3)除菌体：10000r/min离心10min去除沉淀菌体，得上清液。

4)除蛋白：按固液比，聚酰胺：上清液＝120g：1l，向上清液中加入(80-100)目的聚酰胺，室温下摇床振摇4h，抽滤除去吸附蛋白质的聚酰胺。

5)浓缩：将步骤4)所得产物浓缩至原体积的40％，得浓缩液。

6)醇沉：调节浓缩液ph，加入95％乙醇，于4℃冷藏。于4℃条件下10000r/min离心10min，除去上清液，沉淀以定量蒸馏水溶解，即得胞外多糖溶液。冻干后称重，并计算胞外多糖得率。

(一)不同ph的影响

方法同上。发酵液离心除菌体、除蛋白、浓缩后，如表4调节ph值，加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，静置8h。结果如表4：

表4

由表4可见，多糖得率随着ph的升高先增大后减小，ph＝7时醇沉得到的多糖最多，此时多糖得率可达6.453g/l。

(二)不同乙醇添加倍数的影响

方法同上。发酵液离心除菌体、除蛋白、浓缩后，调节ph至6，如表5加入95％乙醇，静置8h。结果如表5：

表5

由表5可见，多糖得率随乙醇添加倍数的增大先增大后减小，乙醇添加倍数为4倍时多糖得率最高，为6.344g/l。

(二)不同醇沉时间的影响

方法同上。发酵液离心除菌体、除蛋白后，调节ph至6，加入浓缩液3倍体积95％乙醇，静置时间如表6。结果如表6：

表6

由表6可见，多糖得率随醇沉时间的延长而提高，且增长速度逐渐变缓，综合考虑得率与时间成本，选择12h为最优醇沉时间，此时多糖得率为6.253g/l。

由实施例2和实施例3得出，益生菌胞外多糖的最佳回收条件为：将发酵液浓缩至原体积的20％，调ph为7，加4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h。

实施例4鼠李糖乳杆菌胞外多糖提取量验证

方法：1)活化：将鼠李糖乳杆菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlmrs培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得到鼠李糖乳杆菌发酵种子液。

2)发酵：将鼠李糖乳杆菌发酵种子液以2％的接种量接种于mrs液体培养基中，调节初始ph值为6.5，于37℃下，转速为100r/min，培养24h，得发酵液。

mrs液体培养基的组成为：低聚半乳糖1％，大豆蛋白胨2％，磷酸盐0.2％，酵母粉0.5％，柠檬酸氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，其余为蒸馏水。

3)除菌体：10000r/min离心10min去除沉淀菌体，得上清液。

4)除蛋白：按固液比，聚酰胺：上清液＝120g：1l，向上清液中加入(80-100)目的聚酰胺，室温下摇床振摇4h，抽滤除去吸附蛋白质的聚酰胺。

5)浓缩：将步骤4)所得产物浓缩至原体积的20％，得浓缩液。

6)醇沉：调节浓缩液ph至7，加入4倍体积的95％乙醇，于4℃冷藏12h。于4℃条件下10000r/min离心10min，除去上清液，沉淀以定量蒸馏水溶解，即得胞外多糖溶液。冻干后称重，并计算胞外多糖得率。

实验结果：在上述最优条件下，鼠李糖乳杆菌胞外多糖的得率为15.52g/l。

实施例5鼠李糖乳杆菌胞外多糖在清除自由基中的应用

样品的制备：

1)活化：将鼠李糖乳杆菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlmrs培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得到鼠李糖乳杆菌发酵种子液。

2)发酵：将鼠李糖乳杆菌发酵种子液以3％的接种量接种于mrs液体培养基中，调节初始ph值为6.5，于28℃下，培养10h，得发酵液。

所述的mrs液体培养基的组成为：按重量百分比，低聚半乳糖1％，大豆蛋白胨2％，磷酸氢二钾0.2％，酵母粉0.5％，柠檬酸氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，其余为蒸馏水；组成的mrs液体培养基的碳氮比为1:2。

3)除菌体：将步骤2)中所得的发酵液在4℃条件下，10000r/min离心10min，除去沉淀菌体，保留上清液。

4)除蛋白：按固液比，聚酰胺：上清液＝120g：1l，向上清液中加入(80-100)目的聚酰胺，室温下摇床振摇4h，抽滤除去吸附蛋白质的聚酰胺。

5)浓缩：将步骤4)所得产物浓缩至原体积的20％，得浓缩液。

6)醇沉：调节浓缩液的ph至7，加入浓缩液4倍体积的95％乙醇，于4℃冷藏12h。于4℃条件下10000r/min离心10min，除去上清液，沉淀以定量蒸馏水溶解后冻干，即得鼠李糖乳杆菌胞外多糖。

自由基清除实验：

1)dpph自由基清除实验：取2ml样品+2ml0.2mmdpph·的od517为ai；2ml样品+2ml无水乙醇的od517为aj；2ml0.2mmdpph·+2ml无水乙醇的od517为ac。对照组以抗坏血酸代替样品。每组实验重复三次。

计算清除率公式：

dpph自由基清除率(％)＝[1－(ai－aj)/ac]×100％

2)oh自由基清除实验：取2ml样品+2ml3mmol/l水杨酸-乙醇溶液+0.6ml8mmol/lfeso4+0.5ml20mmol/lh2o2，37℃水浴反应30min后流水冷却，加入0.9ml蒸馏水，3000r/min离心10min，在510nm处测定吸光度为a1；以蒸馏水替代样品，同上操作，在510nm处测定吸光度为a0。对照组以抗坏血酸代替样品。每组实验重复三次。

oh自由基清除率(％)＝(1－a1/a0)×100％

实验结果：

1.如图2所示，鼠李糖乳杆菌胞外多糖对dpph自由基的清除效率随着样品浓度提高而提高。当含量为2.5mg/ml时，抑制效率达到13.8％，当浓度达到20g/ml时，抑制效率达到85.24％。

2.如图3所示，鼠李糖乳杆菌胞外多糖对oh自由基的清除效率随着样品浓度提高而提高。当含量为2.5mg/ml时，抑制效率达到2.0％，当浓度达到20g/ml时，抑制效率达到84.93％。