鉴定六妹羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用与流程

本发明属于生物学技术领域，具体涉及鉴定六妹羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用。本发明技术适用于检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有六妹羊肚菌；鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为六妹羊肚菌；鉴定或辅助鉴定市售六妹羊肚菌的真伪性。

背景技术：

羊肚菌(morchella)隶属于真菌界，子囊菌亚门(ascomycotina)，盘菌纲(discomycetes)，盘菌目(pezizales)，羊肚菌科(morchellaceae)，是一种珍贵的食药用菌。羊肚菌的野生产量少，采集困难，栽培技术不成熟，价格昂贵，近年来研究人员大力发展羊肚菌的人工培植技术。据文献报道，羊肚菌属有三个支系、30个品种如尖顶羊肚菌、黑脉羊肚菌、六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌等，外观及其相似，目前对其鉴别研究较少。仅有几篇文献使用真菌通用引物its扩增后测序比对确定品种，如王波等人，对人工栽培的梯棱羊肚菌进行了形态特征描述和itsrdna序列分析，建立发育树.(人工栽培羊肚菌的鉴定[j].西南农业学报,2013,26(5):1988-1991.)；陈吉岳等人对15个羊肚菌菌株和1个子实体对照进行了rapd分析.(国产羊肚菌菌株的rapd鉴别[j].植物分类与资源学报,2004,26(4):434-438.)。众所周知，采用its序列进行dna测序来鉴别品种，时间比较长，且还需进行序列分析。目前未见报道通过羊肚菌特异性对羊肚菌物种进行鉴别。

技术实现要素：

为弥补现有技术的空白，解决现有技术的缺陷，本发明提供了鉴定六妹羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用。本发明首次对羊肚菌品种进行了特异性引物的设计，适用于检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有六妹羊肚菌；鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为六妹羊肚菌；鉴定或辅助鉴定市售六妹羊肚菌的真伪性。本发明提供的特异性引物对通过pcr技术可以快速、准确、灵敏地实现上述应用，且引物特异性强，pcr扩增反应时间短，引物的耐用性好。

具体的，

一方面，本发明提供了一种六妹羊肚菌特异性引物，其序列如下：

ms-1f：5’-gtaattctgacgtctgtttg-3’；

ms-1r：5’-acacagaaaagggctgctatagg-3’。

另一方面，本发明提供了一种鉴定六妹羊肚菌的试剂盒，包含以下引物：

ms-1f：5’-gtaattctgacgtctgtttg-3’；

ms-1r：5’-acacagaaaagggctgctatagg-3’。

另一方面，本发明提供了一种鉴定六妹羊肚菌的方法，包括使用本发明所述的引物或本发明所述的试剂盒。

另一方面，本发明提供了一种鉴定六妹羊肚菌的方法，包括步骤：

a)提取待测样品的基因组dna；

b)利用本发明所述的六妹羊肚菌特异性引物或本发明所述的鉴定六妹羊肚菌的试剂盒对步骤a)中的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；

c)利用步骤b)中获得的扩增产物鉴定所述待测样品。

在一些实施例中，pcr扩增条件为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火10sec-15sec，72℃延伸10sec-15sec，30-35个循环；72℃延伸5min；任选的，pcr扩增条件为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火10sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min；任选的，pcr扩增条件为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，35个循环；72℃延伸5min。

在一些实施例中，pcr扩增条件为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火10sec-15sec，72℃延伸10sec-15sec，30-35个循环；72℃延伸5min。

在一些实施例中，pcr扩增条件为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火10sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min。

在一些实施例中，pcr扩增条件为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，35个循环；72℃延伸5min。

在一些实施例中，pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl或pfumix12.5μl或pcrmix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，浓度大于0.01ng/μl的dna模板1μl，ddh2o补足至25μl；任选的，pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl或pfumix12.5μl或pcrmix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，0.01ng/μl至100ng/μl的dna模板1μl，ddh2o补足至25μl；任选的，pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl或pfumix12.5μl或pcrmix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，0.05ng/μl至50ng/μl的dna模板1μl，ddh2o补足至25μl；任选的，pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl或pfumix12.5μl或pcrmix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，50ng/μl的dna模板1μl，ddh2o补足至25μl。

在一些实施例中，pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl或pfumix12.5μl或pcrmix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，浓度大于0.01ng/μl的dna模板1μl，ddh2o补足至25μl。

在一些实施例中，pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl或pfumix12.5μl或pcrmix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，0.01ng/μl至100ng/μl的dna模板1μl，ddh2o补足至25μl。

在一些实施例中，pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl或pfumix12.5μl或pcrmix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，0.05ng/μl至50ng/μl的dna模板1μl，ddh2o补足至25μl。

在一些实施例中，pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl或pfumix12.5μl或pcrmix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，50ng/μl的dna模板1μl，ddh2o补足至25μl。

在一些实施例中，pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，50ng/μldna模板1μl，ddh2o补足至25μl。

在一些实施例中，pcr扩增体系：pfumix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，50ng/μldna模板1μl，ddh2o补足至25μl。

在一些实施例中，pcr扩增体系：pcrmix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，50ng/μldna模板1μl，ddh2o补足至25μl。

在一些实施例中，对获得的扩增产物琼脂糖凝胶电泳方法进行鉴定；琼脂糖凝胶电泳方法：pcr产物6μl+1μl10xloadingbuffer，电压110v，时间35min；鉴定六妹羊肚菌特征在于，可以获得大小为100-250bp唯一条带。

另一方面，本发明提供了一种使用本发明所述的方法鉴定六妹羊肚菌的试剂盒。

另一方面，本发明提供了本发明所述引物的应用，其特征在于，包括：

制备用于检测或辅助检测六妹羊肚菌的试剂盒；

检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有六妹羊肚菌；

制备用于鉴定或辅助鉴定六妹羊肚菌的试剂盒；

鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为六妹羊肚菌；

制备用于鉴定或辅助鉴定市售六妹羊肚菌的真伪性的试剂盒；

鉴定或辅助鉴定市售六妹羊肚菌的真伪性。

另一方面，本发明提供了本发明所述方法的应用，其特征在于，包括：

检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有六妹羊肚菌；

鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为六妹羊肚菌；

鉴定或辅助鉴定市售六妹羊肚菌的真伪性。

详细说明

本发明将会把确定的具体化的内容所对应的文献详细列出。本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。有很多文献和相似的物质与本发明申请相区别或抵触，其中包括但绝不限于术语的定义，术语的用法，描述的技术，或如本发明申请所控制的范围。

本发明所使用的“引物”是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条dna模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条dna模板链互补。在pcr(聚合酶链式反应)技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用pcr扩增技术，目的基因dna受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在dna聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

本发明所使用的“鉴定六妹羊肚菌的方法”包括但不限于检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有六妹羊肚菌；鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为六妹羊肚菌；鉴定或辅助鉴定市售六妹羊肚菌的真伪性。

本发明所使用的“琼脂糖凝胶电泳方法”为用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用，本发明使用的琼脂糖凝胶浓度为1.5％。

本发明所使用的“2xprimestarmaxpremix”为pcr反应中使用的一种扩增体系，含有primestarhsdna聚合酶、2mmmg²⁺、0.4mmdntp。

本发明所使用的“pfumix”为pcr反应中使用的一种扩增体系，含有pfudna聚合酶、0.4mmdntp、100mmkcl、20mmtris-cl、3mmmgcl2、溴酚蓝。

本发明所使用的“pcrmix”为pcr反应中使用的一种扩增体系，含有0.1u/μltaqdna聚合酶、0.4mmdntp、100mmkcl、20mmtris-cl、3mmmgcl2、溴酚蓝。

本发明所使用的“pcr扩增体系”是指pcr体外扩增所需试剂的一个组合。pcr为聚合酶链式反应的缩写，是一种体外dna扩增技术，是在模板dna、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于dna聚合酶的酶促合反应，将待扩增的dna片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使dna片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。本发明所使用的扩增体系含有2xprimestarmaxpremix或pfumix或pcrmix12.5μl、引物各1μl、模板1μl、ddh2o9.5μl。

本发明所使用的“loadingbuffer”是一种琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液，本发明所用的上样缓冲液为10xloadingbuffer，含0.9％sds、50％甘油、0.05％溴酚蓝。

本发明所述的“浓度大于0.01ng/μl的dna模板1μl”中dna模板的浓度最大值尽管没有限定，但是应当理解为本领域所需模板浓度的最大值为本发明dna模板的浓度最大值；在一些实施例中浓度大于0.01ng/μl为0.01ng/μl至100ng/μl；在一些实施例中，浓度大于0.01ng/μl为0.05ng/μl至50ng/μl；在一些实施例中，浓度大于0.01ng/μl为50ng/μl。

ms-1f序列为序列表中seqidno：1：gtaattctgacgtctgtttg

ms-1r序列为序列表中seqidno：2：acacagaaaagggctgctatagg

its5f序列为序列表中seqidno：3：ggaagtaaaagtcgtaacaagg

its4r序列为序列表中seqidno：4：tcctccgcttattgatatgc

本发明提供的六妹羊肚菌特异性引物ms-1f/ms-1r特异性强，耐用性好，灵敏度高，适用条件广，不但可以将六妹羊肚菌从伪品中区分出来，还可以鉴定或辅助鉴定六妹羊肚菌，与粗柄羊肚菌、七妹羊肚菌、高羊肚菌、小海绵羊肚菌、梯棱羊肚菌等区分出来，而且缩短了鉴定pcr的反应时间，提高鉴定效率。

本发明提供了的鉴定六妹羊肚菌的方法反应时间短，能很好的区分六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌。

附图说明

图1六妹羊肚菌特异性引物pcr扩增退火温度考察，其中，m代表marker，1、2、5、6、9、10、13、14代表梯棱羊肚菌，3、4、7、8、11、12、15、16代表六妹羊肚菌。

图2六妹羊肚菌特异性引物pcr扩增退火时间考察，其中，m代表marker，1、2、3、4代表梯棱羊肚菌，5、6、7、8代表六妹羊肚菌，n代表阴性对照。

图3六妹羊肚菌特异性引物pcr扩增延伸时间考察，其中，m代表marker，1、2、3、4代表梯棱羊肚菌，5、6、7、8代表六妹羊肚菌，n代表阴性对照。

图4六妹羊肚菌特异性引物pcr扩增循环数数考察，其中，m代表marker，1、2、3、4代表梯棱羊肚菌，5、6、7、8代表六妹羊肚菌，n代表阴性对照。

图5六妹羊肚菌特异性引物不同模板量考察，其中m代表marker，1、2、3、4、5代表稀释不同倍数的梯棱羊肚菌，6、7、8、9、10代表稀释不同倍数的六妹羊肚菌，n代表阴性对照；其中6代表稀释10倍，7代表稀释50倍，8代表稀释100倍，9代表稀释500倍，10代表稀释1000倍。

图6六妹羊肚菌特异性引物不同引物量考察，其中，m代表marker，1-16代表加入不同引物量的六妹羊肚菌。

图7六妹羊肚菌特异性引物不同酶考察，其中，m代表marker，1、2、3、4代表稀释不同倍数的梯棱羊肚菌，5、6、7、8代表稀释不同倍数的六妹羊肚菌，n代表阴性对照。

图8不同品种羊肚菌中鉴别六妹羊肚菌，其中，1：粗柄羊肚菌(p1)；2：七妹羊肚菌；3：高羊肚菌；4：小海绵羊肚菌；5：粗柄羊肚菌(p2)；6：六妹羊肚菌；7：阴性对照。

图9不同种属样品中鉴别六妹羊肚菌，其中，1.新疆虫草，2.金水宝胶囊，3.百令胶囊，4.白草，5.凉山虫草，6.蛹虫草，7.蝉花，8.戴氏虫草，9.亚香棒虫草，10.马草，11.中华被毛孢，12.水黑草，13.虫草花，14.牛樟芝，15.花脸蘑，16.松茸，17.草菇，18.黄菇，19.灰树花，20.紫丁香蘑，21.姬松茸，22.六妹羊肚菌，23.阴性对照，m.500dlmarker。

具体实施方式

为能进一步解释本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与方案，结合以下附图与具体实施方式对本发明的详述进行进一步地解释。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种修改和改动，这些等价形式同样落于本发明所要求保护的范围内。

实施例1：六妹羊肚菌引物的制备

1、样品来源

六妹羊肚菌样品来源信息

2、实验仪器与试剂

3、实验方法

3.1、dna提取

取羊肚菌干品子实体约30mg样品，在mm400球磨仪上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的高效植物基因组dna试剂盒提取总dna，提取物分装放置-20℃备用。

3.2、its通用引物pcr扩增反应

使用真菌通用的its序列作为羊肚菌dna条形码，核苷酸序列为：

its5f：5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’；

its4r：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。

pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl，10μm/l的真菌通用引物its5f/its4r各1μl，dna模板1μl浓度50ng/μl，ddh2o补足至25μl。

pcr扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性45sec，62℃退火45sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳：6μlpcr产物+1μl10xloadingbuffer，电压120v，时间30min，可获得500-1000bp之间唯一条带。

3.3、pcr产物测序设计特异性引物

pcr产物测序分别得到六妹羊肚菌的dna序列，使用dnaman软件比对得到变异位点，使用primer5软件设计引物。

最终确定的六妹羊肚菌特异性引物对核苷酸序列：

ms-1f：5’-gtaattctgacgtctgtttg-3’；

ms-1r：5’-acacagaaaagggctgctatagg-3’。

实施例2：pcr扩增条件和程序研究

1、退火温度研究(58℃/60℃/62℃/64℃/66℃)

选择核苷酸序列：ms-1f：5’-gtaattctgacgtctgtttg-3’；ms-1r：5’-acacagaaaagggctgctatagg-3’，作为六妹特异性引物对，tm＝4℃(g+c)+2℃(a+t)计算引物对的tm值为58℃，以引物对的tm值作为参考，设置退火温度梯度试验，温度为58℃/60℃/62℃/64℃/66℃。

pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，dna模板1μl(浓度50ng/μl)，ddh2o补足至25μl。

pcr的扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性45sec，58℃/60℃/62℃/64℃/66℃退火45sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行电泳分析，6μl+1μl10xloadingbuffer，电压110v，时间35min，在100-250bp间可获得唯一条带。结果如图1所示。

因此，六妹羊肚菌特异性引物的pcr最终选择退火温度为62℃。

2、退火时间(10sec/15sec)

pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，dna模板1μl(浓度50ng/μl)，ddh2o补足至25μl。

pcr的扩增程序为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火10sec/15sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳：pcr产物6μl+1μl10xloadingbuffer，电压110v，时间35min，在100-250bp间可获得唯一条带。结果如图2所示。

六妹羊肚菌特异性引物的pcr退火时间为10sec就能显示条带，退火时间为15sec的条带更亮。

3、延伸时间(10sec/15sec)

pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，dna模板1μl(浓度50ng/μl)，ddh2o补足至25μl。

pcr的扩增程序为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸10sec/15sec，35个循环；72℃延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳：pcr产物6μl+1μl10xloadingbuffer，电压110v，时间35min，在100-250bp间可获得唯一条带。结果如图3所示。

六妹羊肚菌特异性引物的pcr延伸时间为10sec就能显示条带，，延伸时间为15sec的条带更亮。

4、循环数(30个循环/35个循环)

pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，dna模板1μl(浓度50ng/μl)，ddh2o补足至25μl。

pcr的扩增程序为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环/35个循环；72℃延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳：pcr产物6μl+1μl10xloadingbuffer，电压110v，时间35min，在100-250bp间可获得唯一条带。结果如图4所示。

六妹羊肚菌特异性引物的pcr轮数30个循环/35个循环均可被检测到dna条带。

一般pcr扩增程序总时长为1h40min，本发明特异性引物结合pcr方法优化，在保证dna条带可被检测到的前提下，缩短了pcr反应时间，提高检测效率；预变性与变性温度同时提高至98℃；pcr条件优化后，总反应时间由1h40min缩短至24min(退火及延伸为10sec，循环30轮)-33min(退火及延伸时间15sec，循环35轮)。从上可以看出，发明人经过大量创造性的劳动和大量的试验才得出本发明的引物，扩增系统及程序。本发明提供了一种快速高效鉴别六妹羊肚菌的引物和方法。

实施例3：耐用性研究

1、不同模板量(5ng/μl/1ng/μl/0.5ng/μl/0.1ng/μl/0.05ng/μl)

pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，初始浓度50ng/μl稀释10倍/50倍/100倍/500倍/1000倍的dna模板1μl，ddh2o补足至25μl。

pcr的扩增程序为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，35个循环；72℃延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳：pcr产物6μl+1μl10xloadingbuffer，电压110v，时间35min，在100-250bp间可获得唯一条带。

六妹羊肚菌特异性引物dna模板初始浓度为50ng/μl，考察六妹羊肚菌特异性引物dna模板量稀释10倍/50倍/100倍/500倍/1000倍。结果如图5显示。

结果：尽管稀释倍数很多，仍可检测到dna条带，本发明所述的引物的灵敏度高。

2、不同引物量(0.75μl/1.0μl/1.25μl/1.5μl)

pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各0.75μl/1.0μl/1.25μl/1.5μl，dna模板1μl(浓度50ng/μl)，ddh2o补足至25μl。

pcr的扩增程序为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，35个循环；72℃延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳：pcr产物6μl+1μl10xloadingbuffer，电压110v，时间35min，在100-250bp间可获得唯一条带。

考察六妹羊肚菌特异性引物10μm/l时取引物量0.75μl-1.5μl，结果如图6所示。

结果：在检测的引物量范围内，均可检测到dna条带，说明该引物在引物量适用范围较宽，再一次证明其灵敏度高。

3、不同酶(pfumix/pcrmix)

pcr扩增体系：pfumix/pcrmix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，dna模板1μl(浓度50ng/μl)，ddh2o补足至25μl。

pcr的扩增程序为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸10sec，35个循环；72℃延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳：pcr产物6μl+1μl10xloadingbuffer，电压110v，时间35min，在100-250bp间可获得唯一条带。

考察引物对不同酶的适应性，使用保真性不同的酶进行试验，分别是pfudna聚合酶和taqdna聚合酶。结果如图7所示。

结果：通过使用不同保真性的酶进行测试得出，本发明所述的引物对酶的适应性宽。

实施例4六妹羊肚菌鉴定

1、不同品种羊肚菌中的鉴别

a)提取待测样品的基因组dna；取约30mg样品，在mm400球磨仪上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的高效植物基因组dna试剂盒提取总dna，提取物分装放置-20℃备用。

b)利用引物对ms-1f：5’-gtaattctgacgtctgtttg-3’；ms-1r：5’-acacagaaaagggctgctatagg-3’，对步骤a)中的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；pcr扩增条件为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，35个循环；72℃延伸5min。pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，dna模板1μl(浓度50ng/μl)，ddh2o补足至25μl。

c)利用步骤b)中获得的扩增产物鉴定所述待测样品。对获得的扩增产物琼脂糖凝胶电泳方法进行鉴定；琼脂糖凝胶电泳方法：pcr产物6μl+1μl10xloadingbuffer，电压110v，时间35min；鉴定六妹羊肚菌特征在于，可以获得大小为100-250bp唯一条带。结果如图8所示。其中1：粗柄羊肚菌(p1)；2：七妹羊肚菌；3：高羊肚菌；4：小海绵羊肚菌；5：粗柄羊肚菌(p2)；6：六妹羊肚菌；7：阴性对照。

结论：用不同品种羊肚菌与六妹羊肚菌在同一pcr程序扩增，非六妹羊肚菌无条带，仅六妹羊肚菌在100-250bp左右呈现单一均匀条带，说明该特异性引物对ms-1f/1r可鉴别六妹羊肚菌与其他品种羊肚菌，特异性高。

2、不同属样品的鉴别

a)提取待测样品的基因组dna；取约30mg样品，在mm400球磨仪上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的高效植物基因组dna试剂盒提取总dna，提取物分装放置-20℃备用。

b)利用引物对ms-1f：5’-gtaattctgacgtctgtttg-3’；ms-1r：5’-acacagaaaagggctgctatagg-3’，对步骤a)中的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；pcr扩增条件为：98℃预变性1min；98℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，35个循环；72℃延伸5min。pcr扩增体系：2xprimestarmaxpremix12.5μl，10μm/l的ms-1f/ms-1r引物各1μl，dna模板1μl(浓度50ng/μl)，ddh2o补足至25μl。

c)利用步骤b)中获得的扩增产物鉴定所述待测样品。对获得的扩增产物琼脂糖凝胶电泳方法进行鉴定；琼脂糖凝胶电泳方法：pcr产物6μl+1μl10xloadingbuffer，电压110v，时间35min；鉴定六妹羊肚菌特征在于，可以获得大小为100-250bp唯一条带。结果如图9所示。其中，1.新疆虫草，2.金水宝胶囊，3.百令胶囊，4.白草，5.凉山虫草，6.蛹虫草，7.蝉花，8.戴氏虫草，9.亚香棒虫草，10.马草，11.中华被毛孢，12.水黑草，13.虫草花，14.牛樟芝，15.花脸蘑，16.松茸，17.草菇，18.黄菇，19.灰树花，20.紫丁香蘑，21.姬松茸，22.六妹羊肚菌，23.阴性对照，m.500dlmarker。

结果：用不同属的样品与六妹羊肚菌在同一pcr程序扩增，非六妹羊肚菌无条带，仅六妹羊肚菌在100-250bp左右呈现单一均匀条带，说明该特异性引物对ms-1f/1r可用于属间鉴别。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

sequencelisting

<110>广东东阳光药业有限公司

乳源南岭好山好水冬虫夏草有限公司

<120>鉴定六妹羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用

<130>20181204

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