一种分泌抗克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，其特别适于动物组织、动物尿液、动物血清、饲料等样本中克仑特罗残留量的检测。

背景技术：

克仑特罗(clebuterol)属于β-受体激动剂，具有重新分配机体营养、抑制脂肪沉积、提高蛋白质含量、增加酮体瘦肉率、改善肉质以及促进动物生长的作用。然而，在经济利益的驱使下，大量克仑特罗被滥用于畜牧业和养殖业。人体摄入过量克仑特罗时，会导致一系列不良反应，主要有肌肉震颤、心跳和呼吸加快等，甚至会危害生命。因此，许多国家已经禁止将克仑特罗作为饲料及饲料添加剂使用，我国农业部也于2002年明确将其列入《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》。

目前，检测克仑特罗比较经典的方法有高效液相色谱-质谱联用法(hplc-ms)、气相色谱-质谱联用法(gc-ms)、高效液相色谱法(hplc)，这些都是比较传统的方法，也是目前的确证方法。基层实验室大批量检测样本应用的一般是免疫方法，因此获得一株具有特异性亲和力的抗克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株是非常重要的。本发明制备出一种分泌克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其应用于免疫产品，测定动物组织、动物尿液中克仑特罗药物的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一株对克仑特罗具有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。

本发明提供一株克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对克仑特罗具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立克仑特罗总量的免疫学检测方法，包括酶联免疫试剂盒、胶体金检测试纸条、免疫亲和柱等。

本发明的技术方案：一株克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为g-1-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16687。

克仑特罗单克隆抗体，它由所述保藏编号为cgmccno.16687的克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株g-1-1所分泌产生。

所述的克仑特罗单克隆抗体的应用，用于食品安全中克仑特罗含量的检测。

本发明提供的细胞株g-1-1的制备步骤为：

(1)人工抗原的制备与鉴定：1-(4-氨基-3,5-二氯苯基)乙醇和琥珀酸酐反应，得到克仑特罗半抗原，半抗原与蛋白质偶联，制备出人工抗原，即免疫原、包被原；

(2)单克隆抗体的制备：通过免疫小鼠，得到单克隆抗体；

(3)细胞株g-1-1的制备：通过细胞融合和克隆化，得到克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株g-1-1。

(4)细胞株g-1-1的应用：应用于酶联免疫试剂盒。

(5)细胞株g-1-1的应用：应用于胶体金免疫层析试纸条。

(6)细胞株g-1-1的应用：应用于化学发光免疫检测试剂盒、免疫磁珠分离富集试剂盒、磁颗粒化学发光试剂盒、时间分辨荧光免疫层析试纸条、荧光微球免疫层析试纸条、免疫亲和柱等其他免疫检测产品。

附图说明

图1：克仑特罗半抗原合成路线图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1克仑特罗试剂盒组分的制备

1、克仑特罗半抗原的制备

取1-(4-氨基-3,5-二氯苯基)乙醇1.0g，加20ml吡啶溶解，澄清，加琥珀酸酐0.61g，80℃搅拌5h。停止反应，旋蒸，除去吡啶，得到红色油状物，上硅胶柱，乙酸乙酯/正己烷(v/v，1/1)洗脱分离，得到琥珀酸酐-克伦特罗类似物1.3g，收率87.84％。

2、抗原的制备

免疫原制备——克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白(bsa)偶联得到免疫原。

取琥珀酸酐-克伦特罗类似物半抗原43mg，加dmf7ml溶解，加edc39mg，搅拌3h，加nhs28mg，继续搅拌2h，得到半抗原活化液a液；取牛血清白蛋白(bsa)80mg，加4ml0.05mol/lpb缓冲液溶解，得到b液，将a液滴加到b液中，搅拌24h，0.02mol/lpbs透析三天，得到克伦特罗-bsa免疫原，-20度保存，备用。

包被原制备——克仑特罗半抗原与卵清蛋白(ova)偶联得到免疫原。

取琥珀酸酐-克伦特罗类似物半抗原21mg，加dmf5ml溶解，加edc18mg，搅拌3h，加nhs16mg，继续搅拌2h，得到半抗原活化液a液；取卵清白蛋白(ova)60mg，加4ml0.05mol/lpb缓冲液溶解，得到b液，将a液滴加到b液中，搅拌24h，0.02mol/lpbs透析三天，得到克伦特罗-ova包被原，-20度保存，备用。

3、克仑特罗单克隆抗体的制备

动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1(数量配比)比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

生物材料样品保藏：一株克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株g-1-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.16687。保藏日期为2018年10月29日。

细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

4、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。

5、酶标记抗抗体的制备

将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶(hrp)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗体的摩尔浓度比为4:1，由于辣根过氧化物酶在强氧化作用下产生许多与抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体。为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

(1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少；

(2)降低辣根过氧化物酶与抗体的摩尔浓度比率至2:1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶活性的损失减少。

6、酶标板的制备

用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例2检测克仑特罗的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测克仑特罗的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被克仑特罗偶联抗原的酶标板；

(2)克仑特罗标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/l、0.1μg/l、0.3μg/l、0.9μg/l、2.7μg/l、8.1μg/l；

(3)克仑特罗单克隆抗体工作液；

(4)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(5)底物显色液由a液和b液组成，a液为过氧化脲，b液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/l硫酸；

(7)洗涤液为ph值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

(8)复溶液为ph值为7.0、0.02mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

实施例3动物组织、动物尿液样品中克仑特罗的检测

1、样品前处理

(1)动物组织

称取2.0±0.05g均质后的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中；肝脏样本：加入4ml肝脏样本提取液，用振荡器振荡至均匀，3000g室温(20-25℃/68-77℉)离心5分钟；肌肉样本：加入4ml肌肉样本提取液，用振荡器振荡至均匀，3000g室温离心5分钟；取1ml上清液加入加入330μl样本稀释液混匀，检查ph值是否在7-8之间(用盐酸或氢氧化钠溶液调节ph值)；取20μl用于分析。

(2)动物尿液

取20μl清亮尿样直接测定(如尿样浑浊必须通过过滤或3000g室温离心5min直至清亮)，暂不使用的样本应冷冻保存。

2、用试剂盒检测

加入标准品/样本20μl到对应的微孔中。将抗体工作液和酶标二抗浓缩液按10:1体积比混合并混匀(即10份抗体工作液加入1份酶标二抗浓缩液)。加入抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液80μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干，加入底物液a液50μl/孔，再加入底物液b液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置25℃避光环境中反应15min。加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔od值。

3、检测结果分析

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准品(0标准)的吸光度值的平均值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以克仑特罗标准品浓度(μg/l)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克仑特罗的实际浓度。

实施例4克仑特罗技术参数的确定试验

1、试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，标准曲线的范围为0.1～8.1μg/l，ic50(50％抑制浓度)浮动范围为0.41～0.67μg/l；对20份样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果显示，该方法对动物组织、动物尿液的检测限分别为0.4μg/kg、0.1μg/kg。

2、样本精密度和准确度试验

以回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差(rsd％)作为精密度评价指标。计算公式为：回收率(％)＝实际测定值/理论值×100％，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差rsd％＝sd/x×100％，其中sd为标准偏差，x为测定数据的平均值。

按0.8μg/kg、1.6μg/kg两个浓度的克仑特罗分别对猪肉样品进行添加回收测定，按0.2μg/kg、0.4μg/kg两个浓度的克仑特罗分别对猪尿样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂进行测定，计算样品的平均回收率及精密度结果见下表。

表1精密度及准确度试验

按0.8μg/kg、1.6μg/kg两个浓度的克仑特罗分别对猪肉样品进行添加回收测定，按0.2μg/kg、0.4μg/kg两个浓度的克仑特罗分别对猪尿样品进行添加回收测定，平均回收率在80.6％～89.7％之间；批内、批间相对标准偏差均小于10％。

3、试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、克仑特罗添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。

实施例5胶体金免疫层析试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备喷涂有克仑特罗单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有克仑特罗半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和pvc底板组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、克仑特罗单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)克仑特罗单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/l碳酸钾溶液调胶体金的ph值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg的标准向胶体金溶液中加入克仑特罗单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％bsa，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积分数)，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含酪蛋白0.02％～0.1％(质量分数)、吐温-800.05％～0.2％(质量分数)、ph7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液。

2、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5％)、ph为7.2、0.5mol/l的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用isoflow点膜仪将制备好的克仑特罗单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml克仑特罗单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中(湿度＜20％)60min后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。

3、反应膜的制备

将克仑特罗半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将克仑特罗半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(t线)，包被量为0.8μl/cm；用0.01mol/l、ph7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(c线)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

4、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、ph7.2、0.1mol/l磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

5、试纸条的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在pvc底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与pvc底板的始端对齐，吸水垫的末端与pvc底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线(t线)和质控线(c线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。

实施例6样品中克仑特罗残留的检测

1、用试纸条进行检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应5～10min，判定结果。

2、分析检测结果

阴性(-)：t线和c线都显色，表示样品中克仑特罗浓度低于检测限。

阳性(+)：t线无显色c线显色，表示样品中克仑特罗浓度等于或高于检测限。

无效：未出现c线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

实施例7样品检测实例

1、检测限试验

取空白尿液、鸡肉、猪肉、鱼肉、虾肉、饲料样本，在尿液分别添加克仑特罗至终浓度为1.5、3、6ng/ml，在鸡肉、猪肉、鱼肉、虾肉分别添加克仑特罗至终浓度为2.5、5、10ng/ml，在饲料分别添加克仑特罗至终浓度为7.5、15、30ng/ml，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸条检测尿液、鸡肉、猪肉、鱼肉、虾肉、饲料样本时，根据试纸条显示判断检测限，表明本试纸条对尿液中克仑特罗的检测限为3ng/ml，对鸡肉、猪肉、鱼肉、虾肉中克仑特罗的检测限为5ng/ml，对饲料中克仑特罗的检测限为15ng/ml。

2、假阳性率、假阴性率试验

分别取已知克仑特罗含量大于检测限的尿液、鸡肉、猪肉、鱼肉、虾肉、饲料阳性样本各20份和含量小于检测限的阴性样本各20份，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率。结果见下表。

表2假阳性率、假阴性率试验结果

结果表明：分别用3个批次生产的试纸条检测阳性尿液、鸡肉、猪肉、鱼肉、虾肉、饲料样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100％，假阴性率为0；分别检测20份阴性尿液、鸡肉、猪肉、鱼肉、虾肉、饲料样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测克仑特罗的试纸条可以对尿液、鸡肉、猪肉、鱼肉、虾肉、饲料中克仑特罗残留进行快速检测。

3、特异性试验

用克仑特罗试纸条检测500ng/ml的沙丁胺醇、莱克多巴胺、西马特罗等β-兴奋剂类药物。结果显示，试纸条质控线和检测线均显色，呈阴性。说明本试纸条对500ng/ml的沙丁胺醇、莱克多巴胺、西马特罗等β-兴奋剂类药物无交叉反应。