一种非变性II型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法与流程

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种非变性ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法。

背景技术：

现有胶原蛋白与硫酸软骨素联产的技术基本都是变性的胶原蛋白，即水解获得的小分子肽，很少有非变性胶原蛋白和硫酸软骨素联产的技术，而以软骨为原料生产非变性ⅱ型胶原蛋白的技术，基本上只提取非变性ⅱ型胶原蛋白，软骨中的硫酸软骨素未能利用，均作为废弃物排掉，造成了很大资源浪费同时，又增加了企业有机废水处理成本以及后续可能的环境污染风险。另外，现有的非变性ⅱ型胶原蛋白的提取工艺，由于工艺的限制，多会对胶原蛋白的结构产生破坏，进而破坏胶原蛋白活性；同时生产硫酸软骨素工艺多数为将软骨进行高温蒸煮，冷却后再进行酶解、超滤、树脂吸附、树脂转型等，存在耗能高，提取率低，步骤繁琐的弊端。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术存在的不足，提供一种非变性ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种非变性ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)软骨预处理：动物软骨清洗剔肉后，以1～5倍体积无水乙醚或丙酮浸泡6～72h脱脂，脱脂后的软骨用1～10倍体积1～6m盐酸胍去除杂蛋白，用质量浓度0.1～10％过氧化氢浸泡18～24h消毒，用捣碎机将处理后的软骨捣碎；(2)碱液浸提：将捣碎后的软骨在0.1～

4m碱液中于12-30℃下浸泡6～24h浸提，通过离心机或过滤分离得到沉淀和清液；(3)生产产品一：将沉淀用粉碎机粉碎，冻干得到非变性ⅱ型胶原蛋白；(4)生产产品二：将清液过阴离子树脂或大孔吸附树脂后，树脂用步骤(2)碱液阳离子对应的氯化物洗脱得到含硫酸软骨素盐的洗脱液，洗脱液用无水乙醇沉淀，脱水，过滤收集沉淀，烘干可得到硫酸软骨素盐。

进一步的，步骤(1)脱脂时间为24～72h，步骤(2)中的碱液为氢氧化钙，步骤(4)中的氯化物为氯化钙，硫酸软骨素盐为硫酸软骨素钙盐。

进一步的，步骤(2)中的碱液为氢氧化钾，步骤(4)中的氯化物为氯化钾，硫酸软骨素盐为硫酸软骨素钾盐。

进一步的，离心机的操作条件为5000rpm，4℃，10分钟以上。

进一步的，动物软骨为猪、牛、鸡、鸭的关节软骨或胸部软骨。

本发明主要以动物软骨为原料，采用低温碱液浸提工艺，同时生产非变性ⅱ型胶原蛋白和硫酸软骨素盐，取得了以下的技术效果：(1)首次实现非变性ⅱ型胶原蛋白和硫酸软骨素盐两种高附加值产品的联合生产，提高了原料利用率和产品的附加值。(2)使用低温碱液浸提工艺，避免了常规工艺因温度过高造成非变性ⅱ型胶原蛋白的变性。(3)使用低温碱液浸提工艺，避免了硫酸软骨素生产常规工艺中高温耗能和生产步骤繁琐等弊端，软骨素几乎全部进入浸提液中，提取率较高。(4)现有硫酸软骨素产品主要以钠盐为主，使用者使用量大时有潜在的引发高血压的风险，本发明硫酸软骨素钾盐或者钙盐的快速、低耗能制备工艺，弥补了现有硫酸软骨素钾盐和钙盐的市场稀缺，拓宽了产品应用开发范围。

附图说明

图1为实施例1产品中的非变性ⅱ型胶原蛋白扫描电镜图。

具体实施方式

以下结合实施例，详细说明本发明一种非变性ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法。

实施例1

一种非变性ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法，包括以下步骤：

(1)软骨预处理：将鸡软骨清洗剔肉后，以1～5倍体积无水乙醚或丙酮浸泡24～72h脱脂，脱脂后的软骨用1～10倍体积1～6m盐酸胍去除杂蛋白，用质量浓度0.1～10％过氧化氢浸泡18～24h消毒，用捣碎机将处理后的软骨捣碎；

(2)碱液浸提：将捣碎后的软骨在0.1～4m氢氧化钙中于12℃下浸泡6～24h浸提，通过离心机分离得到沉淀和清液；(3)生产产品一：将沉淀用粉碎机粉碎，冻干得到非变性ⅱ型胶原蛋白；(4)生产产品二：将清液过阴离子树脂或大孔吸附树脂后，树脂用氯化钙洗脱得到含硫酸软骨素钙盐的洗脱液，洗脱液用无水乙醇沉淀，脱水，过滤收集沉淀，烘干可得到硫酸软骨素钙盐。离心机的操作条件为5000rpm，4℃，10分钟以上。

实施例2

一种非变性ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法，包括以下步骤：

(1)软骨预处理：将鸡软骨清洗剔肉后，以1～5倍体积无水乙醚或丙酮浸泡24～72h脱脂，脱脂后的软骨用1～10倍体积1～6m盐酸胍去除杂蛋白，用质量浓度0.1～10％过氧化氢浸泡18～24h消毒，用捣碎机将处理后的软骨捣碎；

(2)碱液浸提：将捣碎后的软骨在0.1～4m氢氧化钙中于20℃下浸泡6～24h浸提，通过离心机分离得到沉淀和清液；(3)生产产品一：将沉淀用粉碎机粉碎，冻干得到非变性ⅱ型胶原蛋白；(4)生产产品二：将清液过阴离子树脂或大孔吸附树脂后，树脂用氯化钙洗脱得到含硫酸软骨素钙盐的洗脱液，洗脱液用无水乙醇沉淀，脱水，过滤收集沉淀，烘干可得到硫酸软骨素钙盐。离心机的操作条件为5000rpm，4℃，10分钟以上。

实施例3

一种非变性ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法，包括以下步骤：(1)软骨预处理：将鸡软骨清洗剔肉后，以1～5倍体积无水乙醚或丙酮浸泡24～72h脱脂，脱脂后的软骨用1～10倍体积1～6m盐酸胍去除杂蛋白，用质量浓度0.1～10％过氧化氢浸泡18～24h消毒，用捣碎机将处理后的软骨捣碎；(2)碱液浸提：将捣碎后的软骨在0.1～4m氢氧化钙中于30℃下浸泡6～24h浸提，通过离心机分离得到沉淀和清液；(3)生产产品一：将沉淀用粉碎机粉碎，冻干得到非变性ⅱ型胶原蛋白；(4)生产产品二：将清液过阴离子树脂或大孔吸附树脂后，树脂用氯化钙洗脱得到含硫酸软骨素钙盐的洗脱液，洗脱液用无水乙醇沉淀，脱水，过滤收集沉淀，烘干可得到硫酸软骨素钙盐。离心机的操作条件为5000rpm，4℃，10分钟以上。

实施例4

一种非变性ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法，包括以下步骤：(1)软骨预处理：将猪软骨清洗剔肉后，以1～5倍体积无水乙醚或丙酮浸泡6～72h脱脂，脱脂后的软骨用1～10倍体积1～6m盐酸胍去除杂蛋白，用质量浓度0.1～10％过氧化氢浸泡18～24h消毒，用捣碎机将处理后的软骨捣碎；(2)碱液浸提：将捣碎后的软骨在0.1～4m氢氧化钾中于12℃下浸泡6～24h浸提，通过过滤分离得到沉淀和清液；(3)生产产品一：将沉淀用粉碎机粉碎，冻干得到非变性ⅱ型胶原蛋白；(4)生产产品二：将清液过阴离子树脂或大孔吸附树脂后，树脂用氯化钾洗脱得到含硫酸软骨素钾盐的洗脱液，洗脱液用无水乙醇沉淀，脱水，过滤收集沉淀，烘干可得到硫酸软骨素钾盐。

实施例5

一种非变性ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法，包括以下步骤：(1)软骨预处理：将猪软骨清洗剔肉后，以1～5倍体积无水乙醚或丙酮浸泡6～72h脱脂，脱脂后的软骨用1～10倍体积1～6m盐酸胍去除杂蛋白，用质量浓度0.1～10％过氧化氢浸泡18～24h消毒，用捣碎机将处理后的软骨捣碎；(2)碱液浸提：将捣碎后的软骨在0.1～4m氢氧化钾中于20℃下浸泡6～24h浸提，通过过滤分离得到沉淀和清液；(3)生产产品一：将沉淀用粉碎机粉碎，冻干得到非变性ⅱ型胶原蛋白；(4)生产产品二：将清液过阴离子树脂或大孔吸附树脂后，树脂用氯化钾洗脱得到含硫酸软骨素钾盐的洗脱液，洗脱液用无水乙醇沉淀，脱水，过滤收集沉淀，烘干可得到硫酸软骨素钾盐。

实施例6

一种非变性ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的联合制备方法，包括以下步骤：(1)软骨预处理：将猪软骨清洗剔肉后，以1～5倍体积无水乙醚或丙酮浸泡6～72h脱脂，脱脂后的软骨用1～10倍体积1～6m盐酸胍去除杂蛋白，用质量浓度0.1～10％过氧化氢浸泡18～24h消毒，用捣碎机将处理后的软骨捣碎；(2)碱液浸提：将捣碎后的软骨在0.1～4m氢氧化钾中于30℃下浸泡6～24h浸提，通过过滤分离得到沉淀和清液；(3)生产产品一：将沉淀用粉碎机粉碎，冻干得到非变性ⅱ型胶原蛋白；(4)生产产品二：将清液过阴离子树脂或大孔吸附树脂后，树脂用氯化钾洗脱得到含硫酸软骨素钾盐的洗脱液，洗脱液用无水乙醇沉淀，脱水，过滤收集沉淀，烘干可得到硫酸软骨素钾盐。

实施例产品性能测试

图1为实施例1产品中的非变性ⅱ型胶原蛋白扫描电镜图，表1为各实施例产品一中非变性ⅱ型胶原蛋白含量及产品二的硫酸软骨素提取率和硫酸软骨素盐纯度情况表，其中非变性ⅱ型胶原蛋白含量以elisa方法进行检测，硫酸软骨素盐纯度以usp41的cpc滴定法测定。硫酸软骨素提取率为进入硫酸软骨素盐的硫酸软骨素量与原软骨中硫酸软骨素量的比例。

表1各实施例产品情况表

由表1可以看出，各实施例产品一中的非变性ⅱ型胶原蛋白含量在30～40％左右，相比其他生产方法，生产的非变性ⅱ型胶原蛋白纯度较高，且非变性ⅱ型胶原蛋白结构与活性均未造成破坏。同时产品二的硫酸软骨素的提取率在88％以上，产品二中的硫酸软骨素盐纯度均在90％以上，收率与纯度均较其他生产方法高，且提取工艺方法简单，避免了硫酸软骨素生产常规工艺中高温耗能和生产步骤繁琐等弊端。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。