一种海胆主要卵黄蛋白的制备方法与流程

本发明涉及食品加工
技术领域：
，具体地说，涉及一种海胆主要卵黄蛋白的制备方法。
背景技术：
：在海胆加工过程中，海胆卵黄加工产品单一，黄海胆、虾夷马粪海胆和大连紫海胆卵黄蛋白质含量丰富，可达68.55％、60.21％、62.24％左右(以干重计)，但其高值化利用度却比较低。制备黄海胆、虾夷马粪海胆和大连紫海胆卵黄中主要卵黄蛋白，提高黄海胆卵黄的利用率，具有较高的社会、经济价值，应用于食品领域，将拥有良好的应用前景。技术实现要素：本发明的目的在于公开一种海胆主要卵黄蛋白的制备方法，提高海胆卵黄在加工过程中的利用率；另外，根据海胆卵黄本身蛋白质含量丰富的特点，开发一种利用黄海胆、虾夷马粪海胆和大连紫海胆卵黄制备海胆主要卵黄蛋白的方法，同时，保证该方法具有条件温和、工艺简单、生产效率高等特点。为达到上述目的，本发明提供了一种海胆主要卵黄蛋白的制备方法，包括如下步骤：s1、制备海胆卵黄脱脂粉：在0～4℃条件下，将新鲜海胆破壳，取卵黄，均浆成无颗粒状物的卵黄匀浆液，添加正己烷/无水乙醇混合液进行搅拌，之后去除正己烷和无水乙醇，干燥得卵黄脱脂粉；优选方式下，步骤s1所述脱脂具体为：在0～4℃条件下，所述卵黄匀浆液与正己烷/无水乙醇混合液按1:(8～12)(m/v)的比例混合，搅拌4～8h，抽滤去除正己烷和无水乙醇，得滤饼；再次将滤饼与正己烷/无水乙醇混合液按照1:(8～12)(m/v)的比例混合，搅拌4～8h，抽滤去除正己烷和无水乙醇，得滤饼，置于常温下自然风干，获得海胆卵黄脱脂粉；所述正己烷/无水乙醇混合液中，正己烷和无水乙醇体积比为(4～2):1；所述海胆为黄海胆、虾夷马粪海胆或紫海胆；所述脱脂目的在于去除海胆卵黄中的脂质成分，提高海胆卵黄中的蛋白纯度；s2、碱溶：将步骤s1制备的海胆卵黄脱脂粉溶解于去离子水中，调节ph为碱性，搅拌后收集上清液；优选方式下，步骤s2所述碱溶具体为：10～40℃条件下，将步骤s1中制得的海胆卵黄脱脂粉与去离子水按重量比1:5～100的比例混合，使用0.1～5.0mol/l的naoh溶液调节ph10.5～12.5，搅拌0.5～2h，3000～6000g离心10～60min，收集上清液，即碱溶蛋白溶液；所述碱液溶解的目的在于分离海胆卵黄中可溶性蛋白，以去除不溶性蛋白和杂质，提高蛋白纯度。s3、酸沉：将步骤s2所得溶液ph调至酸性，收集沉淀，即酸沉蛋白；优选方式下，步骤s3所述酸沉具体为：将步骤s2获得的碱溶蛋白溶液，使用0.1～5.0mol/l的盐酸溶液调节ph2～6，于5000～15000g离心10～30min，收集沉淀，得到酸沉蛋白；所述酸溶液沉淀目的在于将溶解的蛋白质聚集并与水分离，收集海胆卵黄酸沉蛋白沉淀。s4、透析法低温除盐：将步骤s3所得酸沉蛋白溶于其重量10～80倍去离子水中，使用0.1～5.0mol/l的naoh溶液调节ph7，得酸沉蛋白溶液；对所述酸沉蛋白溶液进行透析，得海胆主要卵黄蛋白溶液；优选方式下，步骤s4所述透析具体为：0～4℃下，将酸沉蛋白溶液转移至1～10kda透析袋，使用去离子水对酸沉蛋白溶液进行透析，透析时间为6～10h/次，共重复1～3次，每次透析使用的去离子水为酸沉蛋白溶液的10～100倍；所述透析除盐的目的在于去除海胆酸沉蛋白中的盐离子，获得海胆主要卵黄卵黄蛋白溶液。s5、冻干：将步骤s4所得海胆主要卵黄蛋白溶液冻干成粉，得海胆主要卵黄蛋白。优选方式下，步骤s5所述冻干具体为：0.1～5pa，-25℃～-50℃条件下，干燥60～72h。优选方式下，所述海胆主要卵黄蛋白的制备方法，包括如下步骤：s1、海胆卵黄脱脂处理：在4℃条件下，将海胆破壳，取卵黄，匀浆至没有颗粒状物的卵黄匀浆液，将所述卵黄匀浆液按1:10(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝3:1)混合，磁力搅拌6h，抽滤去除有机试剂，得滤饼；将所得滤饼按1:10(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝3:1)混合，磁力搅拌6h，抽滤去除有机试剂，得滤饼；将所得滤饼用正己烷/无水乙醇混合液冲洗后打散，置于常温下自然风干，获得海胆卵黄脱脂粉；s2、碱溶：25℃条件下，将步骤s1中制得的海胆卵黄脱脂粉在与去离子水按重量体比1:20的比例混合，使用4.0mol/l和0.5mol/l的naoh溶液调节ph11.5，搅拌2h，4000g离心20min，收集上清液，即碱溶蛋白溶液；s3、酸沉：将步骤s2获得的碱溶蛋白溶液，使用4.0mol/l的盐酸溶液调节ph3.2，于10000g离心15min，收集沉淀，得到酸沉蛋白；s4、透析法低温除盐：将步骤s3所得酸沉蛋白溶于其重量10倍去离子水中，使用0.5mol/l的naoh溶液调节ph7，得酸沉蛋白溶液；0～4℃下，将酸沉蛋白溶液转移至3.5kda透析袋，使用去离子水对酸沉蛋白溶液进行透析，透析时间为8h/次，共重复1次，每次透析使用的去离子水为酸沉蛋白溶液的50倍；s5、冻干：将步骤s4所得海胆主要卵黄蛋白溶液在1pa，-40℃条件下真空冷冻干燥65h冻干成粉，得海胆主要卵黄蛋白。本发明的有益效果是：1、本发明以海胆卵黄为原料，提高了海胆卵黄的加工利用率，使其蛋白资源得到充分开发利用，对海胆卵黄资源的开发利用具有重要意义。2、本发明采用食品级的有机试剂正己烷和无水乙醇脱除海胆卵黄脱脂粉，操作方便安全，制备过程简单有效。3、本发明首次利用碱溶酸沉法制备海胆主要卵黄蛋白，使用正己烷/无水乙醇混合液对海胆卵黄进行脱脂，再使用naoh溶液和盐酸溶液溶解和沉淀卵黄脱脂粉中的主要卵黄蛋白，经过中和反应以及透析除盐后，能够保证获得的海胆主要卵黄蛋白。按上述工艺步骤的组合提取主要卵黄蛋白，条件温和，海胆主要卵黄蛋白的功能特性得到极大改善，特别是主要卵黄蛋白的持水性、持油性以及泡沫性较海胆卵黄脱脂粉分别提高了2.7～5.8倍、3.8～16.0倍和2.5～4.2倍。本发明制备的海胆主要卵黄蛋白功能特性显著优于目前市面上常见的乳化剂大豆分离蛋白(详见图1，2，3)，因而，可作为功能基料应用于食品中。4、本发明涉及的操作过程简单，不需要复杂的设备，生产率高，适用于工业化生产。附图说明图1为大连紫海胆海胆主要卵黄蛋白、黄海胆海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪胆海胆主要卵黄蛋白、大豆分离蛋白的持水性；图2为大连紫海胆海胆主要卵黄蛋白、黄海胆海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪胆海胆主要卵黄蛋白、大豆分离蛋白的持油性；图3为大连紫海胆海胆主要卵黄蛋白、黄海胆海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪胆海胆主要卵黄蛋白、大豆分离蛋白的起泡性；图4黄海胆海胆主要卵黄蛋白大豆分离蛋白在不同ph条件下的乳化性。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明的技术方案作详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1s1、海胆卵黄脱脂处理：在4℃条件下，将大连紫海胆破壳，取卵黄，匀浆至没有颗粒状物的卵黄匀浆液，将所述卵黄匀浆液按1:10(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝3:1)混合，磁力搅拌6h，抽滤去除有机试剂，得滤饼；将所得滤饼按1:10(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝3:1)混合，磁力搅拌6h，抽滤去除有机试剂，得滤饼；将所得滤饼用正己烷/无水乙醇混合液冲洗后打散，置于常温下自然风干，获得大连紫海胆卵黄脱脂粉；采用凯式定氮法测定所得大连紫海胆卵黄脱脂粉中蛋白质的含量为62.24％(以干重计)；s2、碱溶：25℃条件下，将步骤s1中制得的大连紫海胆卵黄脱脂粉在与去离子水按重量比1:80的比例混合，使用4.0mol/l和0.5mol/l的naoh溶液调节ph11.5，搅拌2h，4000g离心20min，收集上清液，即大连紫海胆碱溶蛋白溶液；s3、酸沉：将步骤s2获得的大连紫海胆碱溶蛋白溶液，使用4.0mol/l的盐酸溶液调节ph5，于10000g离心15min，收集沉淀，得到大连紫海胆酸沉蛋白；s4、透析法低温除盐：将步骤s3所得大连紫海胆酸沉蛋白溶于其重量10倍去离子水中，使用0.5mol/l的naoh溶液调节ph7，得大连紫海胆酸沉蛋白溶液；0～4℃下，将大连紫海胆酸沉蛋白溶液转移至3.5kda透析袋，使用去离子水对大连紫海胆酸沉蛋白溶液进行透析，透析时间为8h/次，共重复1次，每次透析使用的去离子水为大连紫海胆酸沉蛋白溶液的50倍；s5、冻干：将步骤s4所得大连紫海胆主要卵黄蛋白溶液在1pa，-40℃条件下真空冷冻干燥65h冻干成粉，得大连紫海胆主要卵黄蛋白。采用凯式定氮法测定大连紫海胆主要卵黄蛋白中的蛋白质的含量为75.55％。本实施例制备的大连紫海胆主要卵黄蛋白的持水性为15.67ml/g，持油性为18.75ml/g，起泡性为125.00％。实施例2s1、海胆卵黄脱脂处理：在4℃条件下，将黄海胆破壳，取卵黄，匀浆至没有颗粒状物的卵黄匀浆液，将所述卵黄匀浆液按1:10(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝3:1)混合，磁力搅拌6h，抽滤去除有机试剂，得滤饼；将所得滤饼按1:10(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝3:1)混合，磁力搅拌6h，抽滤去除有机试剂，得滤饼；将所得滤饼用正己烷/无水乙醇混合液冲洗后打散，置于常温下自然风干，获得黄海胆卵黄脱脂粉；采用凯式定氮法测定所得黄海胆卵黄脱脂粉中蛋白质的含量为68.55％(以干重计)；s2、碱溶：25℃条件下，将步骤s1中制得的黄海胆卵黄脱脂粉在与去离子水按重量体比1:20的比例混合，使用4.0mol/l和0.5mol/l的naoh溶液调节ph11.5，搅拌2h，4000g离心20min，收集上清液，即黄海胆碱溶蛋白溶液；s3、酸沉：将步骤s2获得的黄海胆碱溶蛋白溶液，使用4.0mol/l的盐酸溶液调节ph3.2，于10000g离心15min，收集沉淀，得到黄海胆酸沉蛋白；s4、透析法低温除盐：将步骤s3所得黄海胆酸沉蛋白溶于其重量10倍去离子水中，使用0.5mol/l的naoh溶液调节ph7，得黄海胆酸沉蛋白溶液；0～4℃下，将黄海胆酸沉蛋白溶液转移至3.5kda透析袋，使用去离子水对黄海胆酸沉蛋白溶液进行透析，透析时间为8h/次，共重复1次，每次透析使用的去离子水为黄海胆酸沉蛋白溶液的50倍；s5、冻干：将步骤s4所得黄海胆主要卵黄蛋白溶液在1pa，-40℃条件下真空冷冻干燥65h冻干成粉，得黄海胆主要卵黄蛋白。采用凯式定氮法测定黄海胆主要卵黄蛋白中的蛋白质的含量为74.98％。本实施例制备的黄海胆主要卵黄蛋白的持水性为14.83ml/g，持油性为7.57ml/g，起泡性为121.67％。黄海胆主要卵黄蛋白在ph6～9的乳化活性37.96～42.22g/m2。实施例3s1、海胆卵黄脱脂处理：在4℃条件下，将虾夷马粪海胆破壳，取卵黄，匀浆至没有颗粒状物的卵黄匀浆液，将所述卵黄匀浆液按1:10(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝3:1)混合，磁力搅拌6h，抽滤去除有机试剂，得滤饼；将所得滤饼按1:10(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝3:1)混合，磁力搅拌6h，抽滤去除有机试剂，得滤饼；将所得滤饼用正己烷/无水乙醇混合液冲洗后打散，置于常温下自然风干，获得虾夷马粪海胆卵黄脱脂粉；采用凯式定氮法测定所得虾夷马粪海胆卵黄脱脂粉中蛋白质的含量为60.21％(以干重计)；s2、碱溶：25℃条件下，将步骤s1中制得的虾夷马粪海胆卵黄脱脂粉在与去离子水按重量体比1:20的比例混合，使用4.0mol/l和0.5mol/l的naoh溶液调节ph11.5，搅拌2h，4000g离心20min，收集上清液，即虾夷马粪海胆碱溶蛋白溶液；s3、酸沉：将步骤s2获得的虾夷马粪海胆碱溶蛋白溶液，使用4.0mol/l的盐酸溶液调节ph4，于10000g离心15min，收集沉淀，得到虾夷马粪海胆酸沉蛋白；s4、透析法低温除盐：将步骤s3所得虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶于其重量10倍去离子水中，使用0.5mol/l的naoh溶液调节ph7，得虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液；0～4℃下，将虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液转移至3.5kda透析袋，使用去离子水对虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液进行透析，透析时间为8h/次，共重复1次，每次透析使用的去离子水为虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液的50倍；s5、冻干：将步骤s4所得虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白溶液在1pa，-40℃条件下真空冷冻干燥65h冻干成粉，得虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白。采用凯式定氮法测定虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白中的蛋白质的含量为83.23％。本实施例制备的虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白的持水性为9.00ml/g，持油性为15.17ml/g，起泡性为111.67％。实施例4s1、海胆卵黄脱脂处理：在0℃条件下，将虾夷马粪海胆破壳，取卵黄，匀浆至没有颗粒状物的卵黄匀浆液，将所述卵黄匀浆液按1:8(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝4:1)混合，搅拌4h，抽滤去除正己烷和无水乙醇，得滤饼；将所得滤饼按1:8(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝4:1)混合，搅拌6h，抽滤去除正己烷和无水乙醇，得滤饼；将所得滤饼用正己烷/无水乙醇混合液冲洗表面后打散，置于常温下自然风干，获得虾夷马粪海胆卵黄脱脂粉；采用凯式定氮法测定所得虾夷马粪海胆卵黄脱脂粉中蛋白质的含量为55.24％(以干重计)；s2、碱溶：10℃条件下，将步骤s1中制得的虾夷马粪海胆卵黄脱脂粉在与去离子水按重量体比1:5的比例混合，使用5.0mol/l和0.1mol/l的naoh溶液调节ph10.5，搅拌0.5h，3000g离心10min，收集上清液，即虾夷马粪海胆碱溶蛋白溶液；s3、酸沉：将步骤s2获得的虾夷马粪海胆碱溶蛋白溶液，使用0.1mol/l的盐酸溶液调节ph6，于5000g离心10min，收集沉淀，得到虾夷马粪海胆酸沉蛋白；s4、透析法低温除盐：将步骤s3所得虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶于其重量80倍去离子水中，使用0.1mol/l的naoh溶液调节ph7，得虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液；4℃下，将虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液转移至1kda透析袋，使用去离子水对虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液进行透析，透析时间为6h/次，共重复3次，每次透析使用的去离子水为虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液的10倍；s5、冻干：将步骤s4所得虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白溶液在0.1pa，-25℃条件下真空冷冻干燥60h冻干成粉，得虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白。采用凯式定氮法测定虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白中的蛋白质的含量为60.01％。本实施例制备的虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白的持水性为7.50ml/g，持油性为13.41ml/g，起泡性为78.78％。实施例5s1、海胆卵黄脱脂处理：在2℃条件下，将虾夷马粪海胆破壳，取卵黄，匀浆至没有颗粒状物的卵黄匀浆液，将所述卵黄匀浆液按1:12(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝2:1)混合，搅拌8h，抽滤去除正己烷和无水乙醇，得滤饼；将所得滤饼按1:8(m/v)的比例与正己烷/无水乙醇混合液(v正己烷:v乙醇＝2:1)混合，搅拌8h，抽滤去除正己烷和无水乙醇，得滤饼；将所得滤饼用正己烷/无水乙醇混合液冲洗表面后打散，置于常温下自然风干，获得虾夷马粪海胆卵黄脱脂粉；采用凯式定氮法测定所得虾夷马粪海胆卵黄脱脂粉中蛋白质的含量为57.58％(以干重计)；s2、碱溶：40℃条件下，将步骤s1中制得的虾夷马粪海胆卵黄脱脂粉在与去离子水按重量体比1:100的比例混合，使用5mol/l和0.5mol/l的naoh溶液调节ph12.5，搅拌1h，6000g离心60min，收集上清液，即虾夷马粪海胆碱溶蛋白溶液；s3、酸沉：将步骤s2获得的虾夷马粪海胆碱溶蛋白溶液，使用5mol/l的盐酸溶液调节ph2，于15000g离心30min，收集沉淀，得到虾夷马粪海胆酸沉蛋白；s4、透析法低温除盐：将步骤s3所得虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶于其重量40倍去离子水中，使用5mol/l的naoh溶液调节ph7，得虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液；4℃下，将虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液转移至10kda透析袋，使用去离子水对虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液进行透析，透析时间为10h/次，共重复2次，每次透析使用的去离子水为虾夷马粪海胆酸沉蛋白溶液的100倍；s5、冻干：将步骤s4所得虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白溶液在5pa，-50℃条件下真空冷冻干燥72h冻干成粉，得虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白。采用凯式定氮法测定虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白中的蛋白质的含量为70.29％。本实施例制备的虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白的持水性为8.45ml/g，持油性为7.83ml/g，起泡性为95.98％。分别对本发明实施例制备的主要卵黄蛋白的蛋白含量、持水性、持油性、起泡性和乳化性进行测定；其中利用凯氏定氮法检对蛋白质含量进行测定，利用质谱鉴定对主要卵黄卵黄蛋白含量进行测定。本发明制备的主要卵黄蛋白，利用凯氏定氮法检测其蛋白质纯度为75％以上，经过质谱鉴定含量占总蛋白99％以上。如表1所示，本发明制备的蛋白经质谱鉴定，蛋白质中的99.9％均为主要卵黄蛋白。表1序号分子量蛋白名称序列号含量1155958.91da主要卵黄蛋白q3yl9455.6％2155820.86da主要卵黄蛋白a0a1b4z33044.4％对本发明制备的大连紫海胆主要卵黄蛋白、黄海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白的持水性进行测定(图1)，实施例1～3分别表示实施例1～实施例3制备的大连紫海胆主要卵黄蛋白、黄海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白，结果如图1所示，大连紫海胆主要卵黄蛋白、黄海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白的持水性显著优于大豆分离蛋白的持水性。对本发明制备的大连紫海胆主要卵黄蛋白、黄海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白的持油性进行测定(图2)，实施例1～3分别表示实施例1～实施例3制备的大连紫海胆主要卵黄蛋白、黄海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白，结果如图2所示，大连紫海胆主要卵黄蛋白、黄海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白的持油性显著优于大豆分离蛋白的持油性。对本发明制备的大连紫海胆主要卵黄蛋白、黄海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白的起泡性进行测定(图3)，实施例1～3分别表示实施例1～实施例3制备的大连紫海胆主要卵黄蛋白、黄海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白，结果如图3所示，大连紫海胆主要卵黄蛋白、黄海胆主要卵黄蛋白、虾夷马粪海胆主要卵黄蛋白的起泡性显著优于大豆分离蛋白的起泡性。图4为本发明制备的黄海胆主要卵黄蛋白在ph6～9条件下的乳化活性，如图所示，本发明制备的黄海胆主要卵黄蛋白在ph6～9条件下的乳化活性均优于大豆分离蛋白。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12