本发明属于微生物基因工程技术领域。具体地，涉及一种优化的鸡α干扰素肽链及其重组表达工程菌株。
背景技术：
目前中国是世界上最大的养禽国，病毒一直是困扰着中国养禽业发展的重大难题，近年来家禽肿瘤和病毒感染引起的鸡马立克病、新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、脑脊髓炎、流感、鸭肝炎等烈性传染性病毒性疾病成为地方性流行趋势，导致养禽业每年数十亿元的经济损失，是当前养禽业发展的大敌。因此，如何有效治疗家禽肿瘤和病毒感染性疾病一直是困扰禽病防治的重大难题。
目前一些禽类病毒性疾病仍然缺乏有效的治疗手段，化学药物的使用易使动物产生耐药性，容易引起动物体内药物残留而影响人类健康；疫苗的研制则须考虑病毒变异和多样性；使用抗生素容易导致动物产生不良反应，甚至导致动物体内菌群失调、出现耐药性菌株。干扰素是一类能诱导人及动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的类激素蛋白，具有抗病毒抗肿瘤和免疫调节等生物学活性。毕赤酵母（pichiapastoris）是近年发展起来的一种以甲醇为碳源的真核表达体系，毕赤酵母可对异源蛋白进行修饰。当采用有信号肽的质粒时，蛋白能被正确折叠和加工，然后分泌到培养基中，所得蛋白除具有哺乳动物细胞表达蛋白的一些优点外，还具有操作简便、营养要求低、培养价格低廉、便于高密度发酵、能够高产量分泌表达外源蛋白以及表达产物易于纯化等优点。
与哺乳动物干扰素相比，禽类干扰素研究相对滞后，鸡作为禽类的代表，鸡α干扰素的研究对于禽病防治具有重要意义，现有的鸡α干扰素分泌表达菌株具有表达效率低下，抗病毒效价差的缺点，目前尚未见有关能够有效提高鸡α干扰素分泌表达水平和活性的改良氨基酸序列的报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种优化的鸡α干扰素肽链，优化后的肽链在受体细胞中表达后，其蛋白具有高活性、高稳定性，能够用于禽类各种病毒性疾病的防治，提高鸡群的健康水平。
本发明的另一个目的是提供优化的鸡α干扰素肽链的重组表达工程菌株。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种优化的鸡α干扰素多肽，所述多肽的氨基酸序列如seqidno：1所示。
一种优化的鸡α干扰素基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno：2示。
如上所述优化的鸡α干扰素多肽的制备方法，通过将天然的鸡α干扰素氨基酸成熟肽序列第123位氨基酸残基由丝氨酸突变为苏氨酸，第132位氨基酸残基由丝氨酸突变为天冬酰胺得到。所述天然鸡α干扰素氨基酸序列如seqidno：3所示。
同时，本发明还请求保护上述重组鸡α干扰素多肽在制备重组鸡α干扰素的毕赤酵母工程菌株中的应用。
另外，本发明还请求保护一种重组鸡α干扰素的毕赤酵母工程菌株的制备方法，具体包括以下步骤：
s1.根据毕赤酵母密码子的偏好性，将如上所述重组鸡α干扰素多肽对应的核苷酸序列替换为毕赤酵母的偏爱密码子，然后将替换后的核苷酸序列连入毕赤酵母表达载体ppic9k中，再利用重叠延伸pcr技术去除重组质粒的5＇非翻译区多余的八个核苷酸ggatccaa，即得重组质粒；
s2.将上述重组质粒转化入毕赤酵母smd1168中，经抗生素筛选即得重组鸡α干扰素的毕赤酵母工程菌株。
优选地，步骤s1中，所述重组质粒与毕赤酵母醇氧化酶aox1的5＇非翻译区序列完全一致。
优选地，步骤s2中，所述抗生素的浓度为1.5～2mg/ml。
本发明还请求保护由上述方法制备得到的重组鸡α干扰素的毕赤酵母工程菌株。
同时，上述重组鸡α干扰素的毕赤酵母工程菌株在制备禽类病毒性疾病药物中的应用也是本发明请求保护的范围。
发明人通过创造性的劳动利用毕赤酵母密码子的偏好型和遗传简并性，将鸡α干扰素优化基因片段连入毕赤酵母表达载体ppic9k，再经重叠延伸pcr方法去除重组质粒的5＇非翻译区多余的八个核苷酸ggatccaa，使其与毕赤酵母aox1（醇氧化酶）的5＇非翻译区序列完全一致，并运用易错pcr扩增并筛选到抗病毒活性较强的鸡α干扰素肽链序列，使其与毕赤酵母aox1（醇氧化酶）的5＇非翻译区序列完全一致，再将重组质粒转化入毕赤酵母smd1168中，通过高浓度的抗生素筛选高拷贝重组菌株，得到能够高效表达抗病毒活性的鸡α干扰素的毕赤酵母工程菌株。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
通过本发明所述方法成功制备得到了重组鸡α干扰素多肽，与天然未改造的肽链相比，其抗病毒活性大大提高；重组毕赤酵母表达的优化鸡α干扰素的抗病毒活性为7.40×106u/ml，天然鸡α干扰素的抗病毒活性为1.76×105u/ml，鸡α干扰素优化蛋白表达量是鸡α干扰素天然蛋白表达量的2倍，抗病毒活性是鸡α干扰素天然肽链抗病毒活性的42倍。与天然干扰素基因序列重组菌株相比，重组鸡α干扰素的毕赤酵母工程菌株表达的上清中，鸡α干扰素蛋白纯度高达80%，分离纯化工艺简单，透析超滤除菌后即可使用。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1鸡α干扰素成熟肽优化基因的设计与扩增
天然的鸡α干扰素cifn-α1的氨基酸序列如seqidno：3所示，发明人经过多年探索到的活性更高的优化的鸡α干扰素肽链是由天然的鸡α干扰素cifn-α1氨基酸序列的第123位氨基酸残基由丝氨酸突变为苏氨酸，第132位氨基酸残基由丝氨酸突变为天冬酰胺，得到如seqidno：1所示的优化的鸡α干扰素肽链。
为了提高鸡α干扰素的表达量，在转录水平上将cifn-α基因进行了适当的改造。在保持其氨基酸序列不变的前提下，根据毕赤酵母密码子使用的偏好型和遗传简并性，将稀有密码子替换为毕赤酵母的偏爱密码子，得到如seqidno：2所示的优化的鸡α干扰素肽链所对应的核苷酸序列。全基因合成cifn-α2基因序列，在5’端加入酶切位点ecori，3’端终止密码子后加入酶切位点noti，在目的基因前面加入kex2和ste13蛋白酶裂解位点，使外源基因表达产物具有天然的n端，并利用载体上的α信号肽序列得到分泌表达。
实施例2鸡α干扰素成熟肽优化基因真核表达载体的构建与改造
将鸡α干扰素成熟肽优化基因cifn-α2和毕赤酵母表达载体ppic9k，分别用ecori和noti进行双酶切，回收酶切产物，t4dna连接酶连接过夜，连接产物转化大肠杆菌dh5α，用菌落pcr鉴定阳性克隆，并将阳性克隆进行测序，测序完全正确的阳性载体即为构建好的含有鸡α干扰素成熟肽优化基因的真核表达载体，命名为ppic9k-cifn-α2。
根据ppic9k表达载体的非翻译区序列与毕赤酵母全基因序列中aox1基因序列进行比较，发现ppic9k质粒5＇非翻译区多出了8个核苷酸序列ggatccaa，本实验通过设计4条引物应用pcr方法去除表达重组载体信号肽mrna的5＇-utr序列中的ggatccaa序列。首先在载体上改造位点（ggatccaa）的上游找到saci酶切位点，在目的基因下游找到noti酶切位点，设计3条引物e1、e2、e3，其中e1含有酶切位点saci，e2、e3有互补序列，且内部人为去除ggatccaa序列，分别以e1、e2以及e3、p12为引物，以ppic9k-cifn-α2质粒为模板进行pcr扩增，可扩增得到长度分别为732bp和824bp左右的片段a和b，再将片段a和b切胶回收后，用引物e1和p12利用重叠延伸pcr方法扩增得到片段c，大小为1532bp；将片段c回收后和ppic9k质粒经saci和noti双酶切后连接，即得到重组5＇utr区改造质粒ppic9k-cifn-α2-e，并进行序列测定验证结果，最终达到去掉5’-utr多余8个碱基，使得经过改造过的质粒ppic9k的5’-utr与酵母基因组的aox1完全相同，减少可能引起表达降低或者不表达的可能性，将筛选测序序列正确的重组质粒命名为ppic9k-cifn-α2-e。
实施例3毕赤酵母smd1168感受态细胞的制备
从毕赤酵母smd1168平板上挑取单菌落，接种入35mlypd液体培养基中，28℃，225rpm摇床生长至od600＝0.8～1.0，4℃4000rpm离心10min，加入10ml含0.02mhepes的ypd，逐滴加入0.25ml1mdtt，30℃振荡培养15min，加冰冷的无菌水至35ml，4℃、4000rpm离心10min，用35ml冰冷的无菌水重悬，4℃4000rpm离心10min，用18ml冰冷的无菌水重悬，4℃、4000g离心10min，用2ml冰冷的1m的山梨醇重悬，4℃4000rpm离心10min，用200μl1m的山梨醇重悬细胞，每管80μl分装至1.5ml离心管，液氮速冻，-80℃冻存。
实施例4重组质粒ppic9k-cifn-α2-e电击转化毕赤酵母smd1168
把电转化杯从75%的酒精中拿出，超净台风干，同时紫外照射20分钟，之后把转化杯放入-20℃冰箱预冷，同时离心管枪头也放-20℃冰箱预冷。取80μl上述感受态菌，与5～10μg（约20μl）线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm预冷好的电转化杯中，冰浴5min，擦干水汽，置电转仪上，选择酵母参数（bio-rad电击仪的电击参数1500v、200欧、25μf）进行电转化。电击完成后迅速加入500μl预冷的1mol/l山梨醇，冰浴10min；加入500μl新鲜ypd，30℃，振荡培养1h，离心后用500μl新鲜ypd重悬菌体后取100μl涂布含100μg∕ml的g418的ypds平板，置于28℃恒温培养2～4d，将在ypds平板上生长的重组酵母菌落进行阳性鉴定。
实施例5毕赤酵母转化子的阳性鉴定
提取ypds平板上长出的毕赤酵母重组菌株的基因组dna，以酵母基因组dna为模板，用来阳性鉴定的通用引物为α-factor和3’aox引物，进行pcr扩增，获得扩增片段为760bp的条带，即为含有重组质粒ppic9k-cifn-α2-e的阳性毕赤酵母菌株，命名为smd1168-ppic9k-cifn-α2-e。
实施例6高拷贝毕赤酵母阳性菌株的筛选
将ypds平板长出的重组酵母阳性菌株，以影印法依次接种至含g418抗生素浓度分别为200μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml的ypds平板上，筛选的能在高浓度g418抗性平板上长出的菌株即为含有重组鸡α干扰素基因的高拷贝菌株。
实施例7含有重组鸡α干扰素基因的高拷贝菌株的诱导表达
将ypds平板长出的高拷贝酵母重组菌株接种于10mlypd培养基中，于28℃220rpm培养24h至od600达2.0～6.0，将培养好的ypd摇瓶菌液，以2%接种量接至50mlypd培养基中，于28℃220rpm培养72h后，将摇瓶菌液于12000rpm离心10min收集发酵上清进行纯化。
实施例8smd1168-ppic9k-cifn-α2-e菌株表达产物鸡α干扰素的纯化
将smd1168-ppic9k-cifn-α2-e菌株表达上清用pbs缓冲液进行透析除盐离子，然后分别用100kd和10kd的超滤膜进行分段超滤，最后收集浓缩液即为表达的重组鸡α干扰素。
实施例9重组鸡α干扰素生物活性的测定
采用微量细胞病变抑制法进行测定：取孵化9～10天的spf鸡胚，去头、四肢及内脏，无菌状态下用pbs洗3遍后剪碎，用0.25%的胰酶、37℃消化后，用无血清营养液洗去胰酶，并用大孔吸管吹打成单个细胞后上96孔板，生长约12小时使细胞全部贴壁生长至单层后，去除生长液，每孔加入10倍倍比稀释的干扰素（用无血清营养液稀释）共100μl，每个稀释度设六孔平行样，孵育12小时后用100tcid50的剂量的口泡炎病毒（vsv）进行攻毒，同时设立阳性对照孔（不加干扰素，只加病毒），阴性对照孔（只加干扰素，不加病毒），空白对照孔（不加干扰素，不加病毒），大约12～24小时后在倒置显微镜下观察结果，在阳性对照孔出现75%以上病变的时候判断结果，以能抑制50%细胞病变的样品的干扰素稀释度定义为一个单位干扰素。
病毒抑制法测定酵母表达产物的抗病毒活性结果：攻毒24小时后观察可见阳性对照孔完全出现100%病变，阴性对照孔中是正常的鸡胚成纤维细胞。
以含有天然的鸡α干扰素基因重组质粒转化毕赤酵母进行诱导表达作为对照，优化后的鸡α干扰素基因表达肽链的抗病毒活性如下表：
表1cifn-α1与cifn-α2的表达量和抗病毒活性比较
从上表结果得出，重组质粒ppic9k-cifn-α2-e表达的优化鸡α干扰素的抗病毒活性为7.40×106u/ml，天然鸡α干扰素的抗病毒活性为1.76×105u/ml，鸡α干扰素优化蛋白表达量是鸡α干扰素天然蛋白表达量的2倍，抗病毒活性是鸡α干扰素天然肽链抗病毒活性的42倍，说明序列优化的鸡α干扰素蛋白表达量和活性高于未优化的天然基因表达的蛋白。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>广州市微生物研究所
广东广微检测股份有限公司
广州科盛生物科技有限公司
<120>一种优化的鸡α干扰素肽链及其重组表达工程菌株
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>162
<212>prt
<213>human
<400>1
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