一种吡喹酮人工抗原的合成方法与流程

本发明涉及一种吡喹酮人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术：

吡喹酮（praziquantel）为一种用于人类及动物的驱虫药，专门治疗绦虫及吸虫。对于血吸虫、中华肝吸虫、广节裂头绦虫特别有效。吡喹酮为世界卫生组织基本药物标准清单上的药物，为世界上对于基本公共卫生最重要的药物之一。吡喹酮目前也用于防治水产动物的寄生虫感染，但长期使用会产生严重的抗药性，目前国内外对吡喹酮的报道大部分是研究其抗虫机制以及治疗方法，而对吡喹酮的残留量检测以仪器检测为主。农业部985公告规定吡喹酮的仪器检出限为10μg/kg；国家标准gb/t22956-2008规定在河豚鱼、鳗鱼、烤鳗中吡喹酮残留量的检出限为5μg/kg。近年来，人们对长期低水平摄入兽药残留所致的各种慢性疾病和诱导病原菌产生耐药性等问题特别关注。为保障水产品质量安全和消费者身体健康，促进水产养殖业的健康、可持续发展，有必要对水产品中的药物残留进行监控。因此，建立快速有效的检测吡喹酮含量的方法具有重要意义及市场价值。

酶联免疫法（elisa）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，可实现大量样品的快速检测；然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种吡喹酮人工抗原的合成方法，所制备的产品用于吡喹酮免疫分析方法研究，为今后的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案，一种吡喹酮人工抗原的合成方法，其由吡喹酮通过硝化反应以及还原反应得到具有氨基的产物，即半抗原pqt-hs，用重氮法将半抗原pqt-hs与载体蛋白偶联，即得到吡喹酮人工抗原。

吡喹酮人工抗原的制备步骤为：

（1）半抗原pqt-hs的合成：

合成路线如下：

称取化合物pqt吡喹酮1.5g（4.8mmol）置于冰上冷却，加入浓硫酸(4.71g,2.57ml,48mmol)，然后缓慢加入浓硝酸(1.52g,1.06ml,24mmol)，将反应混合物在室温下搅拌16小时。加入水（60ml）并将混合物置于冰上冷却，然后缓慢地加入固体碳酸氢钠直至水层的ph达到8。向混合物中加入乙酸乙酯（60ml），分离各层并萃取水层。用乙酸乙酯（3×50ml）洗脱。将合并的有机层用盐水（50ml）洗涤，并用na2so4干燥，真空浓缩，得到稻草黄色固体，通过快速柱色谱法进行纯化，得到淡黄色固体（730mg，2.04mmol，收率42.54％），即化合物1。

将sncl2•h2o(999.4mg,4.43mmol,2.8eq)加入到化合物1（565mg，1.58mmol）的甲醇溶液中（20ml）。将混合物在65℃下回流8小时。真空除去甲醇，用10％nahco3溶液将残余物调节至ph8，用乙酸乙酯（3×30ml）萃取。将合并的有机层用盐水（30ml）洗涤，用na2so4干燥，过滤并真空浓缩，得到浅黄色固体，将其通过快速柱色谱法纯化。得到黄色固体（435mg，1.33mmol，收率84.04％），即半抗原pqt-hs。

（2）完全抗原的制备：采用重氮法将步骤（1）获得的半抗原pqt-hs与牛血清白蛋白bsa偶联，得到偶联物完全抗原pqt-hs-bsa。

所述完全抗原pqt-hs-bsa的制备方法如下：

a、称取步骤（1）获得的半抗原pqt-hs5.5mg，pqt-hs与牛血清白蛋白bsa摩尔比为60︰1，溶解于600μln,n-二甲基甲酰胺dmf中，加入50μl1mhcl，冰浴避光反应30min后，再加入5.56μl30%的nano2溶液（现配现用），继续冰浴避光活化30min，称为a液；取10mgbsa，用ph=8.6、2ml0.01m碳酸盐缓冲溶液cb溶解，称为b液；再逐滴将a液缓慢加入到b液中，4℃反应4-6h；即得偶联物pqt-hs-bsa混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物pqt-hs-bsa混合液放入透析袋，并用0.01m磷酸盐缓冲溶液（pbs,ph=7.2）透析3天，每天换三次透析液，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原pqt-hs-bsa，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。

吡喹酮人工抗原的鉴定：

（1）采用核磁共振和液质联用方法鉴定半抗原。

（2）采用紫外法鉴定人工抗原的偶联效果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的分子的摩尔浓度与蛋白的摩尔浓度的比确定偶联比的。

偶联比=偶联物中小分子的摩尔浓度/偶联物中蛋白的摩尔浓度。

本发明的有益效果：本发明成功合成吡喹酮的人工抗原，合成步骤简单、安全、有效，完全可用于免疫分析中，为以后的研究提供了必需的人工抗原。

附图说明

图1半抗原pqt-hs的nmr鉴定图。

图2-a半抗原pqt-hs的lc鉴定图。

图2-b半抗原pqt-hs的ms鉴定图。

图3pqt-hs-bsa人工抗原的免疫原紫外鉴定图。

具体实施方式

实施例1半抗原pqt-hs的合成

称取化合物pqt吡喹酮1.5g（4.8mmol）置于冰上冷却，加入浓硫酸(4.71g,2.57ml,48mmol)，然后缓慢加入浓硝酸(1.52g,1.06ml,24mmol)，将反应混合物在室温下搅拌16小时。加入水（60ml）并将混合物置于冰上冷却，然后缓慢地加入固体碳酸氢钠直至水层的ph达到8。向混合物中加入乙酸乙酯（60ml），分离各层并萃取水层。用乙酸乙酯（3×50ml）洗脱。将合并的有机层用盐水（50ml）洗涤，并用na2so4干燥，真空浓缩，得到稻草黄色固体，通过快速柱色谱法进行纯化，得到淡黄色固体（730mg，2.04mmol，收率42.54％），即化合物1。

将sncl2•h2o(999.4mg,4.43mmol,2.8eq)加入到化合物1（565mg，1.58mmol）的甲醇溶液中（20ml）。将混合物在65℃下回流8小时。真空除去甲醇，用10％nahco3溶液将残余物调节至ph8，用乙酸乙酯（3×30ml）萃取。将合并的有机层用盐水（30ml）洗涤，用na2so4干燥，过滤并真空浓缩，得到浅黄色固体，将其通过快速柱色谱法纯化。得到黄色固体（435mg，1.33mmol，收率84.04％），即半抗原pqt-hs。

半抗原pqt-hs的nmr鉴定图如图1所示，lc鉴定图如图2-a所示，ms鉴定图如图2-b所示。

实施例2完全抗原pqt-hs-bsa制备方法如下：

a、称取步骤（1）获得的半抗原pqt-hs5.5mg，pqt-hs与牛血清白蛋白bsa摩尔比为60︰1，溶解于600μln,n-二甲基甲酰胺dmf中，加入50μl1mhcl，冰浴避光反应30min后，再加入5.56μl30%的nano2溶液（现配现用），继续冰浴避光活化30min，称为a液；取10mgbsa，用ph=8.6、2ml0.01m碳酸盐缓冲溶液cb溶解，称为b液；再逐滴将a液缓慢加入到b液中，4℃反应4-6h；即得偶联物pqt-hs-bsa混合液，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物pqt-hs-bsa混合液放入透析袋，并用0.01m磷酸盐缓冲溶液（pbs,ph=7.2）透析3天，每天换三次透析液，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原pqt-hs-bsa。所述pqt-hs-bsa免疫原的紫外鉴定图如图3所示。

实施例3吡喹酮人工抗原的鉴定

（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。

pqt-hs扫紫外时的浓度为125μg/ml，其分子量为327.2g/mol，计算其摩尔浓度为3.820×10^-4mol/ml。pqt-hs在特征峰297nm处的吸光值a1=0.78024，可以得到ε=a1/3.820×10^-4=2043。

pqt-hs-bsa免疫原偶联物在297nm处的吸光值a2=0.39212，bsa在该波长下吸光值a3=0.05535，则偶联物中pqt-hs的摩尔浓度为（a2-a3）/ε=1.648×10^-4mol/ml，即为1.648×10^-4mol/ml×327.2g/mol×10³=53.92μg/ml。

bsa的分子量为67000g/mol，扫紫外的浓度为500μg/ml，由此可计算偶联物中bsa的浓度为500μg/ml-53.92μg/ml=446.08μg/ml，其摩尔浓度为446.08μg/ml×10^-3/67000g/mol=6.66×10^-6mol/ml。

偶联比=3.820×10^-4mol/ml/6.66×10^-6mol/ml=57.36。