本公开涉及生物
技术领域：
，具体地，涉及一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
背景技术：
：真菌属于真核生物，广泛存在于自然界中，绝大部分真菌对人类是有利的，少数感染人类则会导致严重的疾病。根据感染部位的不同，真菌感染分为浅部真菌感染和深部真菌感染，绝大部分的侵袭性真菌感染属于深部真菌感染。近30年来，随着实体器官及造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation，hsct)等技术的广泛开展、免疫抑制剂、放疗化疗的大量应用、导管介入及留置技术的广泛开展使患者机体免疫功能受损，侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection，ifi)的发病率及死亡率在全球范围内显著上升,严重威胁人类健康。流行病学研究显示，院内真菌感染率7.5％，肿瘤病人发病率为8％，严重烧伤及创伤病人感染率达16％，病死率高达55％-70％。在美国，酵母菌血症已跃居院内血源性感染的第4位，而在中国ifi已成为院内感染第2位的重要组成。hiv病毒感染者，器官移植等免疫机制受损的患者感染肺孢子虫的概率大大增加，且容易出现混合感染。肺部常见的真菌感染有念珠菌、曲霉菌、新型隐球菌、毛霉菌及肺孢子虫感染。需要注意的是，绝大部分的侵袭性真菌在人体内均存在定植的情况，健康人体内也存在大量的真菌病原体，只有当人体免疫机制紊乱或者受到严重损害时，定植的真菌会转换为具有侵袭血管、消化道等器官的侵袭性真菌，从而引发多功能的损害，危及患者生命。因此，侵袭性真菌的诊断对于免疫功能受损的患者具有较大的临床价值。诊断侵袭性真菌病临床病原体的常规方法主要有镜检、培养、组织病理学检查、血清学方法及分子生物学方法。经典的培养法存在着检测周期长、敏感度低、技术条件要求高、操作人员专业要求高及检测目标单一的问题，难以应用于临床早期诊断及指导治疗。侵袭性真菌病的非培养实验室检测方法主要包括真菌抗原检测、真菌抗体血清学检测以及分子生物学检测。真菌抗原检测包括(1,3)-β-d-葡聚糖检测、半乳甘露聚糖检测、隐球菌荚膜多糖抗原检测以及念珠菌甘露聚糖抗原检测等。不同的抗原用于诊断不同的真菌感染。抗真菌抗体的血清学检测主要包括荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌/副球孢子菌以及皮炎芽生菌的相应血清抗体的检测。特殊检测中的血清学检测可以判断是否存在真菌感染，但是不能实现种水平的区分。面对如此严峻的感染现状，诊断及治疗面临挑战：新病原体的不断出现、病情恶化快、院感感染率和死亡率高、临床和实验室诊断率低造成超过95％的患者延迟治疗；由于抗真菌的药的广泛使用，一些病原体出现了耐药的现象，常见的抗真菌药物对不同属或者种治疗效果不同。因此实现早期快速多目标诊断有利于指导合理用药，提高患者生存率，对于监测病原谱的变化具有很大的意义。目前国内临床进行病原体检测方法大多数为常规检测及特殊检测。常规检测为镜检、培养基组织病理学检查，这几种方法阳性率低、假阴性无法排除；特殊检测中的血清学检测可以判断是否存在真菌感染，但是不能实现种水平的区分。近年来，聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)技术已成为诊断侵袭性真菌体最常用的一种方法，而多重实时荧光pcr技术(real-timepcr，rt-pcr)成为被广泛应用的侵袭性真菌的分型技术。目前，国内外均建立了采用基于pcr技术对侵袭性真菌进行快速检测的方法。例如，中国专利申请号为201410820825.8的发明专利申请公开了使用taqman探针法检测15项侵袭性真菌的方法：8种假丝酵母菌(白色念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母)，4种曲霉菌(黑曲霉、黄曲霉、土曲霉、烟曲霉)以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉，该方法具有较高的灵敏度和特异性，对于侵袭性真菌感染的早期诊断和治疗具有重大意义。再如，中国专利申请号为201510586315.3的发明专利申请公开了使用rt-pcr检测烟曲霉的方法：建立了一种针对烟曲霉进行特异性检测的荧光定量pcr方法(探针法)，该pcr检测体系的检测敏感性方面，线性检测范围的下限可至102copies/ml，上限可达108copies/ml，敏感性、特异性和稳定性均较好。需要注意的是，上述两个发明专利申请中核酸的提取是通过人工操作实现的，且对于结果的判断是通过说明书进行人工判断的，存在一定的主观性。常用的pcr检测需要前期复杂的样本处理过程、繁琐的试验程序及复杂的结果判断。其中曲霉属的检测方案均与青霉菌有99％的序列相似性，因此利用荧光pcr技术无法区分青霉菌，存在假阳性的风险。此外，rt-pcr所能覆盖的检测目标有限，需要通过多体系的设置才能实现多目标的检测，增加了操作的复杂性。技术实现要素：本公开的目的是提供一种快速、准确的检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的seqidno.1-10所示的引物和seqidno.15-23所示的探针。可选地，相对于1μm的seqidno.1所示的引物，分别由seqidno.2-10所示的引物的含量各自为0.3-0.5μm、0.9-1.1μm、0.3-0.5μm、0.9-1.1μm、0.2-0.4μm、0.9-1.1μm、0.1-0.3μm、0.9-1.1μm和0.1-0.3μm，分别由seqidno.15-23所示的探针的含量各自为0.1-0.3μm、0.1-0.3μm、0.1-0.3μm、0.2-0.3μm、0.1-0.3μm、0.1-0.3μm、0.1-0.3μm、0.1-0.3μm和0.1-0.3μm。可选地，所述核酸试剂还包括阳性内质控和阴性内质控；所述阳性内质控含有seqidno.11-12所示的引物和seqidno.24所示的探针；所述阴性内质控含有seqidno.13-14所示的引物和seqidno.25所示的探针。可选地，所述核酸试剂包括a管、b管、c管和d管；a管含有seqidno.1-2所示的引物和seqidno.15-18所示的探针；b管含有seqidno.3-8所示的引物和seqidno.19-21所示的探针；c管含有seqidno.9-10所示的引物和seqidno.22-23所示的探针；d管含有seqidno.11-14所示的引物和seqidno.24-25所示的探针。可选地，seqidno.15,19,22,24所示的探针具有第一荧光标记；seqidno.16,20,23所示的探针具有第二荧光标记；seqidno.17,21所示的探针具有第三荧光标记；seqidno.18,25所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自fam荧光标记、joe荧光标记、cy5荧光标记、rox荧光标记、hex荧光标记、vic荧光标记和quasar670荧光标记中的一种。可选地，所述侵袭性真菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、曲霉菌属、毛霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子虫和卡氏肺孢子虫中的至少一种。本公开第二方面：提供一种用于检测侵袭性真菌的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、dna聚合酶、镁离子、dntp和水中的至少一种。本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测侵袭性真菌的试剂盒中的用途。本公开第四方面：提供一种用于检测侵袭性真菌的系统，该系统包括具有a管检测器、b管检测器、c管检测器和d管检测器的pcr仪、计算装置和输出装置，所述a管检测器、b管检测器、c管检测器和d管检测器分别为装载有如上所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为fam荧光通道、joe荧光通道、cy5荧光通道、rox荧光通道、hex荧光通道、vic荧光通道或quasar670荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：若a管第一荧光通道有tm值为65℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为白色念珠菌阳性；若a管第二荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为热带念珠菌阳性；若a管第三荧光通道有tm值为56℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为光滑念珠菌阳性；若a管第四荧光通道有tm值为52℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为近平滑念珠菌阳性；若b管第一荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为曲霉属阳性；若b管第二荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为毛霉菌阳性；若b管第三荧光通道有tm值为56℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为新型隐球菌阳性；若c管第一荧光通道有tm值为59℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为耶氏肺孢子虫阳性；若c管第二荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为卡氏肺孢子虫阳性。本公开第五方面：提供一种用于检测侵袭性真菌的方法，其中，该方法包括：采用如上所述的核酸试剂，对待测样本的dna进行pcr扩增；进行所述pcr扩增的pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为fam荧光通道、joe荧光通道、cy5荧光通道、rox荧光通道、hex荧光通道、vic荧光通道或quasar670荧光通道；并且进行如下的判别：若a管第一荧光通道有tm值为65℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为白色念珠菌阳性；若a管第二荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为热带念珠菌阳性；若a管第三荧光通道有tm值为56℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为光滑念珠菌阳性；若a管第四荧光通道有tm值为52℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为近平滑念珠菌阳性；若b管第一荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为曲霉属阳性；若b管第二荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为毛霉菌阳性；若b管第三荧光通道有tm值为56℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为新型隐球菌阳性；若c管第一荧光通道有tm值为59℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为耶氏肺孢子虫阳性；若c管第二荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为卡氏肺孢子虫阳性。本公开的有益效果在于：本公开建立的通过paradna及hybeacon探针技术检测侵袭性真菌白色念珠菌(ca)、热带念珠菌(ct)、光滑念珠菌(cg)、近平滑念珠菌(cp)、曲霉菌属(asp)、毛霉菌(muc)、新型隐球菌(cn)、耶氏肺孢子虫(pnj)以及卡氏肺孢子虫(pnc)的多重系统检测方法，能够实现形态学、免疫学及rt-pcr检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：(一)较高的多重检测能力近几年关于侵袭性真菌的检测报道中大多采用rt-pcr的方法进行检测，该方法虽然可以实现多目标的检测，但是受荧光通道数目的限制，需要多个扩增体系联检才能实现，增加了操作的复杂性。本公开所建立的检测方法可以只需4个体系一次性的检测侵袭性真菌白色念珠菌(ca)、热带念珠菌(ct)、光滑念珠菌(cg)、近平滑念珠菌(cp)、曲霉菌属(asp)、毛霉菌(muc)、新型隐球菌(cn)、耶氏肺孢子虫(pnj)以及卡氏肺孢子虫(pnc)10种目标，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和物力成本。(二)简易的操作环节临床样本可通过采样器直接放置于paradna的反应器中直接检测即可获得可靠的结果，避免了昂贵费时的样本提取步骤，实现了除专业实验室外的应急检测。(三)较高程度的检测一体化本公开针对侵袭性真菌检测的需求，提供了一套全面、快速、准确及操作简便的检测侵袭性真菌的一体化解决方案，包括了核酸的快速提取、荧光pcr扩增及自动化结果的判定，(四)特异性好hybeacon探针可识别引物结合区的snp，使得其对非检测目标有极强的辨识能力。本公开所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性：所有引物探针都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、巨细胞病毒、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、百日咳杆菌等其他病原体，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。(五)最低检出限本公开所建立的检测方法的最低检出限可达到10拷贝/反应。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开第一方面：提供用于检测侵袭性真菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的seqidno.1-10所示的引物和seqidno.15-23所示的探针。本公开通过paradna及hybeacon探针技术检测侵袭性真菌，避免了涂片、培养及rt-pcr检测等方法操作时间长及操作繁琐，能够快速、准确、高通量的并行检测多种侵袭性真菌。hybeacon探针技术对探针的要求较高，探针的tm值尤为重要；此外，探针与引物的组合效果对扩增效果也有重要的影响。上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针在一个反应体系内共扩增的问题，即评估tm值、目标对应探针的tm值的差值、gc含量、避免出现发夹结构及二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖多种侵袭性真菌，特异性良好并且覆盖度高。进一步地，相对于1μm的seqidno.1所示的引物，分别由seqidno.2-10所示的引物的含量各自可以为0.3-0.5μm、0.9-1.1μm、0.3-0.5μm、0.9-1.1μm、0.2-0.4μm、0.9-1.1μm、0.1-0.3μm、0.9-1.1μm和0.1-0.3μm，分别由seqidno.15-23所示的探针的含量各自可以为0.1-0.3μm、0.1-0.3μm、0.1-0.3μm、0.2-0.3μm、0.1-0.3μm、0.1-0.3μm、0.1-0.3μm、0.1-0.3μm和0.1-0.3μm。根据本公开，为做好质量控制，所述核酸试剂还可以包括阳性内质控和阴性内质控。进一步地，所述阳性内质控可用于检测真菌通用(fungi)，其可以含有seqidno.11-12所示的引物和seqidno.24所示的探针，所述阳性内质控。所述阴性内质控选用人内源性核糖核酸基因，其可以含有seqidno.13-14所示的引物和seqidno.25所示的探针。这时，相对于1μm的seqidno.1所示的引物，分别由seqidno.11-14所示的引物的含量各自可以为0.9-1.1μm、0.2-0.4μm、0.9-1.1μm和0.1-0.3μm，由seqidno.24-25所示的探针的含量各自可以为0.1-0.3μm和0.05-0.15μm。通过加入所述阴性内质控和阳性内质控，既能够准确鉴定结核分枝杆菌，避免造成假阳性的耐药结果；同时可以有效地提示因为操作失误、pcr抑制物等原因造成的假阴性检测结果。根据本公开，为了增强检测结果的准确性，所述核酸试剂可以分为四管，即所述核酸试剂可以包括a管、b管、c管和d管。其中，a管可以含有seqidno.1-2所示的引物和seqidno.15-18所示的探针；b管可以含有seqidno.3-8所示的引物和seqidno.19-21所示的探针；c管可以含有seqidno.9-10所示的引物和seqidno.22-23所示的探针；d管可以含有seqidno.11-14所示的引物和seqidno.24-25所示的探针。进一步地，可以根据探针各自的tm值进行荧光标记的排列组合，使得同一体系中的不同探针的扩增被分别识别。例如，作为一种实施方式，seqidno.15,19,22,24所示的探针可以具有第一荧光标记；seqidno.16,20,23所示的探针可以具有第二荧光标记；seqidno.17,21所示的探针可以具有第三荧光标记；seqidno.18,25所示的探针可以具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自fam荧光标记、joe荧光标记、cy5荧光标记、rox荧光标记、hex荧光标记、vic荧光标记和quasar670荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，seqidno.15,19,22,24所示的探针具有fam荧光标记；seqidno.16,20,23所示的探针具有joe荧光标记；seqidno.17,21所示的探针具有cy5荧光标记；seqidno.18,25所示的探针具有rox荧光标记。为了增强溶解峰效果，上述目标探针均可为双标记探针。探针中fam为6-羧基荧光素，joe为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，cy5为5h-吲哚菁，rox为6-羧基-x-罗丹明。根据本公开，所述侵袭性真菌可以包括白色念珠菌(ca)、热带念珠菌(ct)、光滑念珠菌(cg)、近平滑念珠菌(cp)、曲霉菌属(asp)、毛霉菌(muc)、新型隐球菌(cn)、耶氏肺孢子虫(pnj)和卡氏肺孢子虫(pnc)中的至少一种。本公开第二方面：提供一种用于检测侵袭性真菌的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、dna聚合酶、镁离子、dntp和水中的至少一种。本公开的试剂盒能够实现快速、准确、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对多种侵袭性真菌进行检测的敏感性、特异性和简便性。本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测侵袭性真菌的试剂盒中的用途。本公开第四方面：提供一种用于检测侵袭性真菌的系统，该系统包括具有a管检测器、b管检测器、c管检测器和d管检测器的pcr仪、计算装置和输出装置，所述a管检测器、b管检测器、c管检测器和d管检测器分别为装载有上述包括a管、b管、c管和d管的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为fam荧光通道、joe荧光通道、cy5荧光通道、rox荧光通道、hex荧光通道、vic荧光通道或quasar670荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：若a管第一荧光通道有tm值为65℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为白色念珠菌阳性；若a管第二荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为热带念珠菌阳性；若a管第三荧光通道有tm值为56℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为光滑念珠菌阳性；若a管第四荧光通道有tm值为52℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为近平滑念珠菌阳性；若b管第一荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为曲霉属阳性；若b管第二荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为毛霉菌阳性；若b管第三荧光通道有tm值为56℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为新型隐球菌阳性；若c管第一荧光通道有tm值为59℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为耶氏肺孢子虫阳性；若c管第二荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为卡氏肺孢子虫阳性。本公开第五方面：提供一种用于检测侵袭性真菌的方法，其中，该方法包括：采用如上所述包括a管、b管、c管和d管的核酸试剂，对待测样本的dna进行pcr扩增；进行所述pcr扩增的pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为fam荧光通道、joe荧光通道、cy5荧光通道、rox荧光通道、hex荧光通道、vic荧光通道或quasar670荧光通道；并且进行如下的判别：若a管第一荧光通道有tm值为65℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为白色念珠菌阳性；若a管第二荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为热带念珠菌阳性；若a管第三荧光通道有tm值为56℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为光滑念珠菌阳性；若a管第四荧光通道有tm值为52℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为近平滑念珠菌阳性；若b管第一荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为曲霉属阳性；若b管第二荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为毛霉菌阳性；若b管第三荧光通道有tm值为56℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为新型隐球菌阳性；若c管第一荧光通道有tm值为59℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为耶氏肺孢子虫阳性；若c管第二荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线、d管第一荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管第四荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为卡氏肺孢子虫阳性。其中，所述待测样本可以为肺泡灌洗液(balf)，所述pcr扩增的条件可以为：45-55℃，7-10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，30-40个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。本公开的方法能快速敏感特异地实现多种侵袭性真菌的系统筛检，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和试剂成本。以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在biosearch(usa)公司合成。实施例1、引物、探针合成按照表1所示的引物序列和表2所示的探针序列，进行序列合成。序列中y代表简并碱基t/c；r代表简并碱基a/g。探针中fam为6-羧基荧光素，joe为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，cy5为5h-吲哚菁，rox为6-羧基-x-罗丹明。表2的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。表1表22、样本处理使用与paradna配套的采样器采集处理后的肺泡灌洗液(balf)后，直接置于paradna的反应器中即可扩增。3、构建hybeacon探针技术检测体系聚合酶phirehotstartiidnapolymerase(货号f122l)，mg2+、dntps购自thermofisher公司；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；荧光检测仪为paradna。按照如下操作配制反应体系：总体系30μl，5×pcrbuffer5μl，氯化镁溶液3-4mm，dntps为1-1.5mm，上游引物0.8-1.0μm，下游引物0.2-0.5μm，hybeacon探针100-300nm，逆转录酶1-2μl，具体引物和探针含量见表3，剩余用水补足。表3seqidno终浓度(μm)seqidno终浓度(μm)11140.220.4150.231160.240.4170.251180.2560.3190.271200.280.2210.291220.2100.2230.2111240.2120.3250.1131试剂盒含有5×pcrbuffer、phirehotstartiidnapolymerase，10×引物探针混合液a管、10×引物探针混合液b管、10×引物探针混合液c管、10×引物探针混合液d管、纯水。a管含有上表1中seqidno.1-2所示的引物和上表2中seqidno.15-18所示的探针；b管含有上表1中seqidno.3-8所示的引物和上表2中seqidno.19-21所示的探针；c管含有上表1中seqidno.9-10所示的引物和上表2中seqidno.22-23所示的探针；d管含有上表1中seqidno.11-14所示的引物和上表2中seqidno.24-25所示的探针。将pcr管放入荧光定量pcr仪中，选择fam、joe、cy5和rox作为报告基团，反应程序如下：50℃，10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，35个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。反应结果判断：阴阳性对照成立，否则视实验结果无效；若a管fam荧光通道有tm值为65℃对应的溶解峰曲线、d管fam荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管rox荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为白色念珠菌阳性；若a管joe荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线、d管fam荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管rox荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为热带念珠菌阳性；若a管cy5荧光通道有tm值为56℃对应的溶解峰曲线、d管fam荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管rox荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为光滑念珠菌阳性；若a管rox荧光通道有tm值为52℃对应的溶解峰曲线、d管fam荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管rox荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为近平滑念珠菌阳性；若b管fam荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线、d管fam荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管rox荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为曲霉属阳性；若b管joe荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线、d管fam荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管rox荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为毛霉菌阳性；若b管cy5荧光通道有tm值为56℃对应的溶解峰曲线、d管fam荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管rox荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为新型隐球菌阳性；若c管fam荧光通道有tm值为59℃对应的溶解峰曲线、d管fam荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管rox荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为耶氏肺孢子虫阳性；若c管joe荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线、d管fam荧光通道有tm为57℃对应的溶解峰曲线、d管rox荧光通道有tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为卡氏肺孢子虫阳性。4、特异性验证选择青霉菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、巨细胞病毒、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、百日咳杆菌等其他病原的临床样本(上述样本均来源于中国疾病预防控制中心细菌病预防控制所)作为特异性评估样本，采用系统检测中的采样器采集痰液(液化)样本后，利用前期建立和优化的反应条件在paradna上进行检测。结果显示在阳性对照成立的条件下，待检目标均无特异性的溶解峰，表明本公开的核酸试剂能够有效区分检测目标与非检测目标，具有较好的特异性。5、最低检出限验证评估用检测样本：选取初始浓度为105拷贝/μl的侵袭性真菌通用(fungi)、白色念珠菌(ca)、热带念珠菌(ct)、光滑念珠菌(cg)、近平滑念珠菌(cp)、曲霉菌属(asp)、毛霉菌(muc)、新型隐球菌(cn)、耶氏肺孢子虫(pnc)以及卡氏肺孢子虫(pnj)核酸梯度稀释为104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、100拷贝/μl，作为最低检出限评估的模板。结果显示本公开试剂盒检测目标耐药基因的最低检出限均可达到10拷贝/反应。6、覆盖度验证选择120株评价用阳性肺泡灌洗液样本作为覆盖度评估用模板。按照以上所述反应体系及反应程序进行试验。结果显示对所有样本均可覆盖检测出。7、试剂盒的保存期试验以100拷贝/μl的真菌通用(fungi)、白色念珠菌(ca)、热带念珠菌(ct)、光滑念珠菌(cg)、近平滑念珠菌(cp)、曲霉菌属(asp)、毛霉菌(muc)、新型隐球菌(cn)、耶氏肺孢子虫(pnj)以及卡氏肺孢子虫(pnc)肺泡灌洗液作为评估用样本。在第0天时，分装成10份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为一年。对比例1、引物、探针合成按照表4和表5所示的引物、探针序列，进行序列合成。探针中fam为6-羧基荧光素，joe为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，cy5为5h-吲哚菁，rox为6-羧基-x-罗丹明。表5的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。表4表5目标名称探针代码探针序列tm(℃)seqidnocaca-p1agcgaaat(fam)gcgat(fam)acgtaatatg6548ctct-p1taagt(joe)gggtggtaaat(joe)tccatctaa6049cgcg-p1ttt(joe)cgctgcgt(joe)tcttcatcgatgcga5650cpcp-p1aaattt(rox)atttgtt(rox)aagtaacaagacca5251aspasp-p1aagcacggct(fam)tgtgt(fam)gttgggtcgt6752mucmuc-p1ttataat(joe)tgtaacataagcgt(joe)aaa6353cncn-p1tcaat(cy5)ccct(cy5)cgggttttattacc5654pnjpnj-p1taggt(fam)atagcact(fam)gagtatctcg5955pncpnc-p1tgttctt(joe)cgatcct(joe)ccctacgaat6056fungifu-p1agaact(fam)gccat(fam)gcacca5757iacrp-p1atggt(rox)gactt(rox)ccacccacaagg60582、特异性验证按照实施例的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针的反应结果均为阴性。3、最低检出限验证按照实施例的方法进行最低检出限验证。实施例与对比例的最低检出限对比如下表6。表6由表6可知，对于样本中痕量的真菌通用(fungi)、白色念珠菌(ca)、热带念珠菌(ct)、光滑念珠菌(cg)、近平滑念珠菌(cp)、曲霉菌属(asp)、毛霉菌(muc)、新型隐球菌(cn)、耶氏肺孢子虫(pnj)以及卡氏肺孢子虫(pnc)核酸核酸，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。4、覆盖度验证按照实施例的方法进行覆盖度验证。实施例与对比例的覆盖度对比如下表7。表7检测目标实施例对比例白色念珠菌1010热带念珠菌1010光滑念珠菌109近平滑念珠菌109毛霉菌109曲霉菌108新型隐球菌108耶氏肺孢子虫1010卡氏肺孢子虫1010真菌通用107由表7可知，本公开试剂盒的检测覆盖度远远大于对比例的检测覆盖度。由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以检测出真菌通用(fungi)、白色念珠菌(ca)、热带念珠菌(ct)、光滑念珠菌(cg)、近平滑念珠菌(cp)、曲霉菌属(asp)、毛霉菌(muc)、新型隐球菌(cn)、耶氏肺孢子虫(pnj)以及卡氏肺孢子虫(pnc)核酸，特异性高，最低检出限更低，覆盖度更广。以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。序列表<110>北京卓诚惠生生物科技股份有限公司<120>用于检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法<130>12634abt<160>58<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tctcttggttctcgcatcgatga23<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgtgcgttcaaaaattcgatg21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aacctgcggaaggatcattac21<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ccattgttgaaagttttaactgatt25<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tggcctttgctagttttctagcgaat26<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aagttgttttataagttttttacgct26<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7atgaatgtaatcttattataacaat25<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ccgacgtcctttgcaggtcgcggca25<210>9<211>3<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10acatagtctgattatttatttt22<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11caacacggggaaactcac18<210>12<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ccagcacgacrgagtt16<210>13<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13cgaggcggttctcggtgggggccgag26<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14caccaacggacgtgaagccggtgag25<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ctcgcatcgatgaagaacgcag22<210>16<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16tctttgggtctggctcttgtctatgt26<210>17<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gtgtgcgtggatctctctattccaaa26<210>18<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18aaattatcttttgataataagatcgtcg28<210>19<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19ccgccggtagacaccacgaactctg25<210>20<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20cctggtatcctattaattatt21<210>21<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21cagtgaatcatcgaatctttgaac24<210>22<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22atctcagatatttaatctcaaaa23<210>23<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23tgtagactgtcggcgagaaggtt23<210>24<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24agtacggccatgcacca17<210>25<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25ccgccgattcttccccccgagcggctc27<210>26<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26tggcggtgggcccagcc17<210>27<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27tgagggagaaacgacgctca20<210>28<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28atcaataagcggaggaaaagaaacca26<210>29<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29atctttccatcactgtacttgt22<210>30<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30actacacacagtggagtttacttta25<210>31<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31caacacaagatttcttttagtagaa25<210>32<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32cctttagctcttgctatctgaattatg27<210>33<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33attaagtaccattacaggaaccc23<210>34<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34atcgagtctttgaacgcacattgcgc26<210>35<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gacgcggtgccgccgctgcctttggg26<210>36<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36ttgctagttttctagcgaatggtt24<210>37<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37ttatcgcactttgctacgttcttca25<210>38<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38tggcttccacatcgatgaagaacg24<210>39<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39acgtcctttgcaggtcgcggcaaac25<210>40<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40aatcggactaggatatagctg21<210>41<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41tgttctgggctgtttccctttcga24<210>42<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42gctggttttctgcgaaactt20<210>43<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43tctcgccgacagtctgacaatt22<210>44<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44ggraawctcaccaggtcca19<210>45<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45gcyctatccccagcacga18<210>46<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46attggcccgaggcctccgaagtacatcac29<210>47<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47tcccctcctggtcccctctctga23<210>48<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>48agcgaaatgcgatacgtaatatg23<210>49<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>49taagtgggtggtaaattccatctaa25<210>50<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>50tttcgctgcgttcttcatcgatgcga26<210>51<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>51aaatttatttgttaagtaacaagacca27<210>52<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>52aagcacggcttgtgtgttgggtcgt25<210>53<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>53ttataattgtaacataagcgtaaa24<210>54<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>54tcaatccctcgggttttattacc23<210>55<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>55taggtatagcactgagtatctcg23<210>56<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>56tgttcttcgatcctccctacgaat24<210>57<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>57agaactgccatgcacca17<210>58<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>58atggtgacttccacccacaagg22当前第1页12