骨质疏松特异性miRNA、组合物及其诊疗用途的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及骨质疏松相关的mirna、组合物及其诊疗用途，更具体的涉及mir-1468-5p、mir-629-5p及其组合物在制备骨质疏松诊断和治疗制剂中的应用。
背景技术：
：骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的代谢性骨病，可分为原发性和继发性两类，原发性者又可分为i型和ii型两类，i型即绝经后骨质疏松，发生于绝经后女性；ii型多见于60岁以上的老年人，女性的发病率是男性的2倍以上。随着全世界人口老年化的发展趋势，骨质疏松症患者群体将会愈发庞大，骨痛、骨折甚至丧失生活自理能力等骨质疏松并发症所带来的一些社会经济问题也愈发明显。研究骨质疏松症的发生发展、治疗预防等分子机理具有重要意义。micrornas(mirna)是一类短小(长度约为22个核苷酸)的非编码rna分子，通过破坏mrna的稳定结构或通过抑制翻译调节基因的表达而发挥作用。有报道显示mirna参与成骨细胞的生成过程，也有一些mirna促进破骨细胞的增殖和分化。申请人之前的研究发现有的mirna和骨肉瘤密切相关并申请了相关专利，如zl2016102726021、zl2016102717978、zl2016100658937，但是mirna和骨质疏松的关系研究较少，有待进一步探索。本研究中，申请人通过高通量测序，并运用生物信息学方法进行分析，发现了几个之前从未被报道过的与骨质疏松相关的mirna，其中，mir-1468-5p在患病组中表达低于对照组，mir-629-5p在患病组表达量高于对照组，进一步，荧光定量pcr实验结果验证了高通量测序的分析，表明mir-1468-5p、mir-629-5p很有可能成为新的绝经后骨质疏松诊断标志物，进一步通过细胞实验研究mir-1468-5p、mir-629-5p对成骨分化的影响，本发明为临床绝经后骨质疏松的精准诊断提供了潜在的分子标志物。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种骨质疏松诊断试剂，所述骨质疏松诊断试剂检测样本中mirna和/或其前体的转录情况，或者mirna调控的靶基因的表达，检测所述mirna选自下列中的一种或几种：mir-1468-5p、mir-629-5p。优选的，所述mirna为mir-629-5p和/或mir-1468-5p的组合。所述mir-1468-5p序列见序列表seqidno1，其前体mir-1468序列见序列表seqidno2；所述mir-629-5p序列见序列表seqidno3，其前体mir-629-5p序列见序列表seqidno4。所述骨质疏松为绝经后骨质疏松。所述的样本为外周血。进一步，骨质疏松诊断试剂采用高通量测序方法和/或定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测样本中mirna和/或其前体的转录或基于免疫方法检测样本中其成熟mirna调控的靶基因的表达情况。优选采用northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中mirna和/或其前体的转录。优选的，所述的用于定量pcr方法包括特异性扩增mirna和/或其前体的引物；所述的基于探针杂交方法包括与mirna和/或其前体的核酸序列杂交的探针。进一步，扩增mir-1468-5p的引物为序列seqidno5；扩增mir-629-5p的引物为序列seqidno6。mir-1468-5p调控的靶基因为derl2、mtrnr2l3、mtrnr2l8、mtrnr2l6、mtrnr2l9、sema3d、brix1、satb2、srsf2、c12orf73、mmab、plxdc1、lyrm7、rpl27a、syk、psors1c2、akr1a1。mir-629-5p调控的靶基因为hnf4a、hist1h2ac、atp5g2、zcchc6、tp53inp2、perp、cflar、rassf8、tnfrsf10d、ptprb、card8、rab12、zeb1、aktip、zbtb18、hoxc8、zbtb47、sdcbp、tfdp1、papd7、or2a4、rsrc2、irf2bp2、eif1ad、rtkn、hoxb13、hist1h1c、txnip、hist1h3b、hist1h3d、hist1h2bh、hist1h2be、hist1h2bb、csnk1e、rab3b、dmxl1、gpr82、dyrk2、aak1、rab3ip、syngap1、riok3、six1、sgcd、znf175、erap2、cmbl、ergic2、pard3、dhfr2、ptpn14、nfya、mtrf1l、trim33、agap1、elf3、gpr107、onecut3、zbtb7a、ano8、mief1、ncdn。本发明的目的还在于提供上述mirna和/或其前体在制备骨质疏松诊断工具中的应用。优选的，骨质疏松为绝经后骨质疏松。本发明的目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：(a)化合物或组合物，所述化合物下调mir-629-5p的转录和/或抑制mir-629-5p成熟mirna的活性；(b)药剂学上能接受的载体。进一步，采用反义寡核苷酸、antagomirs、mirna海绵、mirnaerasers、targetmasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-629-5p或的转录和/或阻断mir-629-5p或的活性。本发明的目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：(a)化合物或组合物，所述化合物上调mir-1468-5p的转录和/或促进mir-1468-5p成熟mirna的活性；(b)药剂学上能接受的载体。进一步，采用基于rna的microrna功能获得性技术和/或基因特异性mirnamimics技术上调mir-1468-5p的转录和/或促进其成熟mirna的活性。优选的，通过人工合成mir-1468-5p模拟物或成熟mirna的短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)或通过调控启动子上调mir-1468-5p。上述药物组合物在制备预防、治疗骨质疏松药物中的应用。优选的，骨质疏松为绝经后骨质疏松。定义：现阶段检测mirna的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于pcr的mirna检测方法。基于探针杂交技术的mirna检测方法是一种直接检测法，不需要对样本rna进行预扩增，包括northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。(1)northern杂交又称rna印迹技术为最经典的检测真核生物rna大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定mirna样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶mirna序列互补的dna探针，然后与经过标记的样本mirna杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。(2)mirna表达谱芯片原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上mirna基因及内参序列，可精确分析出样品中相应mirna的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又称多功能悬浮点阵(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。(3)核酶保护分析技术(rpa)mirna的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测rna样本混合，热变性后杂交，未杂交的rna和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的rna分子，最后通过变性page电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知mirna。(4)rake法rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)是在mirnamicroarray的基础上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna与固定的dna探针杂交的方法。rake可以敏感特异地检测mirna，适用于大量快速的筛选所有己知的mirna。能够在特定的细胞中检测mirna表达谱情况。不仅如此，rake法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出mirna并对其进行分析，为从存档标本中分析mirna开启了希望之门。(5)原位杂交(insituhybridization)原位杂交技术可直观了解mirna表达方式，是观测mirna时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是当前应用较多的探针方式。(6)基于微球的流式细胞术(bead-basedflowcytometry)是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。(7)实时荧光定量pcr技术(real-timepcr，rt-pcr)荧光检测pcr仪可对整个pcr过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的pcr循环数(一般用特定阈值循环数ct来表达)越少。由于mirna长度仅为22nt，传统的qrt-pcr不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于mirna的实时定量pcr方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的mirna检测qrt-pcr方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测mirna为模板逆转录合成cdna第一链，该cdna一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cdna的长度，随后以合成的cdna为模板设计引物进行实时定量pcr扩增。qrt-pcr具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。(8)测序法大部分已知的mirna都是通过cdna克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建mirna的cdna文库，再进行pcr扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。takada开发了一种改进的扩增克隆法(mirnaamplificationprofiling，mrap)，mrap法先在mirna的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cdna链的3’末端。当5’端接头与cdna链的poly(c)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cdna的pcr扩增。由于mrap高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中mirna的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(sage)技术的基础上发展了检测效率更高的mirage(mirnasage)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个mirna，明显提高了检测效率。高通量测序(high-throughputsequencing)又称下一代测序技术(nextgenerationsequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有mirna的序列信息，解密mirna图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(roche)的454测序仪(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因组分析仪(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid测序仪(abisolidsequencer)。基于rna的microrna功能获得性技术即通过外源性补充mirnas合成的前体物质来升高mirnas的水平。例如，可以人工合成与内源性mirna序列一致的短发夹样rna(shorthairpinrna，shrna)，由聚合酶ii或iii做启动子，以病毒为载体转染细胞，被dicer酶修饰后载入risc发挥作用，相当于升高pre-mirna的水平，作用效果稳定而持久。基因特异性mirmimics技术该技术避免了mirna与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’utr互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与mirna相同的转录后调节作用。包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methylcellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearicacidmagnesium)及矿物油(mineraloil)等，但并非局限于此。本发明的药剂学组合物根据本发明所属
技术领域：
的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。附图说明说明书附图图1是mir-1468-5p-mrna靶向关系网络图图2是mir-629-5p-mrna靶向关系网络图图3是mir-629-5p和mir-1468-5p差异表达图图4是检测mir-629-5p和mir-1468-5p对hmscs成骨能力的影响图具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。实施例1与绝经后骨质疏松相关的mirna的筛选1、样本收集各收集30例健康人和绝经后骨质疏松患者的血液样本。edta抗凝管静置10min，离心分离血清，-20℃保存备用。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。取5例样本进行mirna表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在全部30例样本中进行大样本验证实验。排除标准：过早绝经者；如内分泌病、血液病、结缔组织病、药物和营养性疾病等引起的继发性骨质疏松症患者；代谢性骨病、慢性肝肾疾病等干扰骨代谢疾病者；近期服用雌激素、钙剂、二磷酸盐和维生素d等药物的患者；糖尿病患者；高血压患者；合并严重的心脑血管疾病者。2、样本总rna的提取使用invitrogen公司的血液rna提取试剂盒提取总rna。3、rna样品的质量分析(nanodrop1000分光光度计)nanodrop1000分光光度计检测rna样品，rna-seq测序的样品要求：od260/od280为1.8-2.2。将上述提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳，agilenttechnologies2100bioanalyzer检测rna样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28s:18s≥2可以初步判定总rna质量较好。4、mirna文库的构建1)富集smallrna使用5μg-10μgrna样品，然后用聚丙烯酰胺凝胶分离不同片段大小的rna，选择18-30nt(14-30ssrnaladdermarker，takara)条带回收。2)加接头5’连接接头反应体系：反应条件：20℃，6h；聚丙烯酰胺凝胶分离不同片段大小的rna；选择40-60nt条带回收。3’连接接头反应体系：反应条件：20℃，6h；用聚丙烯酰胺凝胶分离不同片段大小的rna；选择60-80ntnt条带回收。3)反转录反应条件：65℃，10min；48℃，3min；42℃，1h；70℃，15min。4)pcr扩增反应条件：98℃,30s；12-15循环(98℃，10s，72℃，15s)；72℃，10min；4℃保存。5)纯化pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶进行纯化，分离110bp左右的条带eb溶解，胶回收产物即为最终文库。6)文库质检使用agilent2100bioanalyzer和qpcr对文库质量进行检测。5、上机测序使用hiseq4000测序仪进行上机检测，具体操作按说明书进行。6、高通量转录组测序数据分析1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；2)用bowtie把readsmap到基因组上。成熟mirna和mirna前体序列下载自mirbase，参考基因组为grch38；3)用mirdeep2定量已知mirna的表达；4)在r环境下用deseq2包比较两组的表达差异，当p值<0.05，|log2fc|>1时，认为基因显著差异表达。7、结果：用以上标准筛选得到差异表达mirna有33个，其中表达上调mirna有18个，表达下调的mirna有15。经过检索，mir-629-5p和mir-1468-5p未见过相关绝经骨质疏松的报道，进行后续验证实验研究。生物信息学分析中，通过mirtarbase数据库，得到6820对已经验证的mirna-mrna靶向关系，分析mir-629-5p和mir-1468-5p的mirna-mrna靶向关系，mir-1468-5p靶基因有17个，mir-629-5p靶基因有62个，分别绘制他们的靶向关系网络图(具体见图1和图2)。实施例2qpcr验证差异表达的mir-629-5p和mir-1468-5p1、对差异表达的mir-629-5p和mir-1468-5p进行大样本qpcr验证。2、rna提取利用qiagen血液rna提取试剂盒提取血清中的rna，具体步骤参考说明书。3、逆转录：1)将10pg-1μg的总rna模板与2μl10×缓冲液、2μldatp(10mm)、0.5μlpolya多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂和无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。2)反应管中加入1μl0.5μg/μloligo(dt)特异性rt引物，70℃孵育5min。3)立即冰上孵育至少2min，打断rna和引物的二级结构。4)将上述20μl反应混合物与4μl5×缓冲液、1μldntp(10mm)，0.5μlm-mlv逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂，10μlpolya反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，42℃孵育1h。4、q-pcr反应：1)引物设计扩增mir-1468-5p的引物正向引物：ctccgtttgcctgtttcgctg(seqidno.5)扩增mir-629-5p的引物引物：tgggtttacgttgggagaact(seqidno.6)扩增u6snrna的引物正向引物：ctcgcttcggcagcaca(seqidno.7)反向引物：aacgcttcacgaatttgcgt(seqidno.8)2)按照表1配制pcr反应体系：其中，sybrgreen聚合酶链式反应体系购自invitrogen公司。表1pcr反应体系体积sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl正向引物1μl反向引物1μlcdna模板2μlddh2o8.5μl总体积25μl3)pcr反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，以t6snrna作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。5、结果如图3所示，与健康人相比，绝经后骨质疏松患者外周血中mir-629-5p表达量显著升高，约为对照组的2.4倍，30例骨质疏松患者组中，22例有显著的高表达，6例差异表达无显著性差异，2例低表达；mir-1468-5p表达量显著降低，约为对照组的0.37倍，30例骨质疏松患者组中，24例有显著的低表达，5例差异表达无显著性差异，1例高表达，提示mir-629-5p和mir-1468-5p可能作为检测靶标应用于骨质疏松的诊断。实施例3mir-629-5p和mirna-1468-5p对成骨分化的影响培养人的骨髓间充质干细胞(hmscs)，将mir-629-5p的抑制物has-mir-629-5pmirvanatmmirnainhibit(美国lifetechnologies)、模拟物has-mir-629-5pmirvanatmmirnamimic(美国lifetechnologies)，mir-1468-5p的抑制物has-mir-1468-5pmirvanatmmirnainhibit(美国lifetechnologies)、模拟物has-mir-1468-5pmirvanatmmirnamimic(美国lifetechnologies)，借助载体lipofectaminernaimaxreagent转染hmscs，观察mir-629-5p和mir-1468-5p对hmscs诱导分化为成骨样细胞的影响。1、细胞的培养人的骨髓间充质干细胞(hmscs)以含以含10％胎牛血清和1％p/s的专用培养基在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用含edta的0.25％胰蛋白酶常规消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。2、细胞转染将细胞浓度按3×105/孔接种到6孔细胞培养板中，在37℃、5％co2培养箱中细胞培养24h，待细胞密度在70％时更换培养基，按照转染说明书进行转染培养，3天换液一次，成骨诱导14天后进行ars(茜素红)染色。将每种mirna(mir-629-5p、mirna-1468-5p)的实验分成三组(对照组、模拟物组和抑制物组)，每组设三个平行实验孔，具体分组情况如下：a.对照组(con)：含10％胎牛血清的专用培养基+成骨诱导剂；b.模拟物组1(m1)：含10％胎牛血清的专用培养基+成骨诱导剂+mir-629-5pmimic；c.模拟物组2(m2)：含10％胎牛血清的专用培养基+成骨诱导剂+mir-1468-5pmimic；d.抑制物组1(i1)：含10％胎牛血清的专用培养基+成骨诱导剂+mir-629-5p的抑制物；e.抑制物组2(i2)：含10％胎牛血清的专用培养基+成骨诱导剂+mir-1468-5p的抑制物。3、ars染色细胞弃掉培养液，4％多聚甲醛固定15～20min，pbs液冲洗3遍。加入茜素红染液，于染色时加入培养板中，培养箱内放置15分钟，弃染色液，pbs液冲洗3遍，沥干，置于差像显微镜下拍照。在染色后的6孔板加入氯化十六烷基毗淀溶液(100mmol/l)，每孔500μl，等其充分溶解后按照一定比例取等量的溶解液，使用分光光度计测量各吸光度数值用于定量。4、结果结果如图4所示，加入mir-629-5p的抑制物组和mir-1468-5p模拟物组能够促进ars阳性标记，加入mir-629-5p模拟物组和mir-1468-5p抑制物组则减少ars阳性标记，说明mir-629-5p和mir-1468-5p可以影响成骨能力，提示mir-629-5p和mirna-1468-5p可以应用于骨质疏松疾病的治疗。虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。序列表<110>固安博健生物技术有限公司<120>骨质疏松特异性mirna、组合物及其诊疗用途<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cuccguuugccuguuucgcug21<210>2<211>86<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggugggugguuucuccguuugccuguuucgcugaugugcauucaacucauucucagcaaa60auaagcaaauggaaaauucguccauc86<210>3<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3uggguuuacguugggagaacu21<210>4<211>86<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggugggugguuucuccguuugccuguuucgcugaugugcauucaacucauucucagcaaa60auaagcaaauggaaaauucguccauc86<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ctccgtttgcctgtttcgctg21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tgggtttacgttgggagaact21<210>7<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctcgcttcggcagcaca17<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aacgcttcacgaatttgcgt20当前第1页12