本发明涉及植物提取物的技术领域，特别涉及3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮及其提取方法和应用。
背景技术：
恶性肿瘤是一种严重危害人类健康和生命的疾病，也是世界医学界的重大难题。2008年，全球恶性肿瘤患者1270万人，死亡人数高达760万。世界范围内因恶性肿瘤死亡的人数，比艾滋病、疟疾和结核病加起来还要多。如果不采取有效措施，预计到2030年，每年将出现2600万新增恶性肿瘤病例，死亡人数将达到1700万。我国每年恶性肿瘤的发病人数约为200万，死亡人数超过140万，并有逐年上升的趋势。攻克恶性肿瘤难关已成为医药工作者和化学工作者当务之急的任务。
近年来中药及其有效成分抗肿瘤研究工作取得了一系列的成果，从植物中得到的抗肿瘤成分主要包括生物碱类、萜类、黄酮类、植物多糖类、多酚类、有机酸类和木脂素类等化合物。当今国际上常用的抗肿瘤植物药和辅助化疗的中药主要包括紫杉醇、喜树碱、长春花碱、白藜芦醇、鬼臼毒素等。这些植物药基本上已用于所有种类的癌症的治疗或辅助治疗，如紫杉醇已用于喉癌、卵巢癌，黄芪等用于肝癌，五加多糖用于胃癌，魔芋用于腹水肿瘤，山豆根等用于治疗消化道癌等。
目前，世界上对抗肿瘤药用植物的研究工作已经涉及300余科植物，从植物中筛选出的抗癌活性成分已达617万种。美国国立癌症研究所自1957年以来，每年筛选出1500～5000种植物提取物的抗癌活性成分。中国的中医药具有2500多年的历史，它们在治疗各种疑难杂症中显现出了神奇的疗效。但我国对植物有效成分的提取分离工作开展较晚，目前约对3000余种(占我国植物总数的10％左右)植物进行了有效成分的研究工作，发现不足300种植物有效成分具有抗癌活性，研究较多的有200余种。因此，我们必须加大对中医药的研究力度和深度，力争从植物中获得毒性低而抗肿瘤作用显著的新衍生物。
牡荆属植物是马鞭草科乔木或灌木，全世界约250种，主要分布于热带和温带地区。我国有14种，7变种，3变型，主要分布在长江以南地区，少数种类在西北、东北、华北等地也有分布。本属的许多种植物为传统的药用植物，在我国有7种药用，其中，黄荆被收入中国药典。
牡荆属植物含有多种化学成分，迄今从该属植物中获得的天然产物类型有黄酮类、二帖类、甾类、环烯醚萜类、三萜类、苯丙素类、倍半萜类等。现代药理研究表明，本属植物所含成分具有多种药理活性，如抗肿瘤、调节内分泌、解热镇痛、抗炎作用、保肝作用、抗氧化作用、抗菌作用、杀虫作用以及呼吸系统活性等。自从1993年sliutz等报道淡花牡荆提取物抑制鼠垂体细胞泌乳素分泌以后，国内外许多研究机构对牡荆属的抗肿瘤作用产生了浓厚的兴趣，抗肿瘤活性成为该属植物目前研究的热点之一。该属植物提取物可以通过多种途径抑制肿瘤增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡，发挥抗肿瘤活性。
长序荆(vitexrotundifolia)为牡荆属植物，具有抗炎、疏散风热等功效。目前，国内外尚没有对长序荆的化学成分和抗肿瘤活性的研究报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明目的在于提供3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮及其提取方法和应用。本发明从长序荆树叶中提取得到一种新化合物，名称为3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮，该化合物具有优异的抗癌活性，具有广阔应用的前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮，具有式i所示结构：
本发明提供了上述方案所述3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对长序荆树叶粉碎物进行乙醇提取，得到流浸膏；
(2)将流浸膏分散于水中后依次使用石油醚和氯仿进行萃取，将得到的氯仿萃取液浓缩，得到氯仿部位浸膏；
(3)将所述氯仿部位浸膏进行第一硅胶柱层析分离；
所述第一硅胶柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系；所述第一硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱；所述各梯度洗脱剂中石油醚和丙酮的体积比依次为10:0、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0:1，每一梯度洗脱剂的体积为与氯仿部位浸膏的质量之比为3000ml：45～55g；
以每一梯度洗脱剂体积的1/3为一流份，将第11到第15流份浓缩后合并，得到粗提取物；
(4)将所述粗提取物进行第二硅胶柱层析分离；
所述第二硅胶柱层析分离的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯体系；所述第二硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱；所述各梯度洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0:1，每一梯度洗脱剂的体积与粗提取物的质量之比为2000ml：3～3.5g；
以每一梯度洗脱剂体积的1/2为一流份，将第10到第11流份浓缩后合并，将溶剂挥干后得到3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮。
优选的，所述长序荆树叶粉碎物的粒度≤100目。
优选的，所述乙醇提取为回流提取。
优选的，所述乙醇提取包括依次进行的第一提取、第二提取和第三提取；
所述第一提取用乙醇的体积和所述长序荆树叶粉碎物的质量之比为10～12ml:1g，第一提取的时间为2～2.5h；
所述第二提取用乙醇的体积和所述长序荆树叶粉碎物的质量之比为8～9ml:1g，第二提取的时间为1.5～1.8h；
所述第三提取用乙醇的体积和所述长序荆树叶粉碎物的质量之比为6～6.5ml:1g，第三提取的时间为1～1.2h。
优选的，所述第一硅胶柱层析分离用硅胶柱的规格为1500g，100～200mesh，ф75mm×l1100mm。
优选的，所述第二硅胶柱层析分离用硅胶柱的规格为300g，100～200mesh，ф45mm×l900mm。
本发明提供了上述方案所述的3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮或上述方案所述方法提取到的3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮在制备抗宫颈癌药物和抗肝癌药物中的应用。
本发明提供了一种名称为3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮的化合物，该化合物是一种新型化合物，具有优异的抗肿瘤活性，在制备抗癌药物方面具有广阔的应用前景。实施例结果表明，3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮浓度为0.10μg/ml时，对人宫颈癌hela细胞和人肝癌hepg2细胞生长抑制率分别为89％和72％。
本发明提供了3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮的提取方法。本发明以长序荆树叶为原料，经过乙醇提取、石油醚和氯仿萃取以及两次硅胶柱层析分离即可得到本发明所述的3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮。本发明提供的提取方法步骤简单，成本低，且原料来源广泛，容易进行产业化生产。
具体实施方式
本发明提供了一种名称为3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮的化合物，结构式如式i所示：
本发明提供了3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮的提取方法，包括以下步骤：
(1)对长序荆树叶粉碎物进行乙醇提取，得到流浸膏；
(2)将流浸膏分散于水中后依次使用石油醚和氯仿进行萃取，将得到的氯仿萃取液浓缩，得到氯仿部位浸膏；
(3)将所述氯仿部位浸膏进行第一硅胶柱层析分离；
所述第一硅胶柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系；所述第一硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱；所述各梯度洗脱剂中石油醚和丙酮的体积比依次为10:0、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0:1，每一梯度洗脱剂的体积与氯仿部位浸膏的质量之比为3000ml：45～55g；
以每一梯度洗脱剂体积的1/3为一流份，将第11到第15流份浓缩后合并，得到粗提取物；
(4)将所述粗提取物进行第二硅胶柱层析分离；
所述第二硅胶柱层析分离的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯体系；所述第二硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱；所述各梯度洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0:1，每一梯度洗脱剂的体积与粗提取物的质量之比为2000ml：3～3.5g；
以每一梯度洗脱剂体积的1/2为一流份，将第10到第11流份浓缩后合并，将溶剂挥干后得到3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮。
本发明对长序荆树叶粉碎物进行乙醇提取，得到流浸膏。在本发明中，所述长序荆树叶粉碎物的粒度优选≤100目；所述长序荆树叶粉碎物由长序荆树叶干燥后粉碎、过筛得到。
在本发明中，所述乙醇提取优选为回流提取；所述乙醇提取用乙醇的质量分数优选为95％；所述乙醇提取包括依次进行的第一提取、第二提取和第三提取；所述第一提取用乙醇的体积和所述长序荆树叶粉碎物的质量之比优选为10～12ml:1g，更优选为10ml:1g，第一提取的时间优选为2～2.5h，更优选为2h；所述第二提取用乙醇的体积和所述长序荆树叶粉碎物的质量之比优选为8～9ml:1g，更优选为8ml:1g，第二提取的时间优选为1.5～1.8h，更优选为1.5h；所述第三提取用乙醇的体积和所述长序荆树叶粉碎物的质量之比优选为6～6.5ml:1g，更优选为6ml:1g，第三提取的时间优选为1～1.2h，更优选为1h。
在本发明的具体实施例中，第一乙醇提取完成后，本发明优选将提取剩余物再次加入乙醇，进行第二提取，依次类推，最终将得到的提取液合并。在本发明中，所述每次提取时乙醇的用量均以初始长序荆树叶粉碎物的质量为基准进行计算。
乙醇提取完成后，本发明优选将提取液中的乙醇回收至无醇味，得到流浸膏。本发明对所述回收乙醇的方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法即可。
得到流浸膏后，本发明将所述流浸膏分散于水中后依次使用石油醚和氯仿进行萃取，将得到的氯仿萃取液浓缩，得到氯仿部位浸膏。在本发明中，所述流浸膏质量和水的体积比优选为600g：2000～2400ml，更优选为600g：2200ml；本发明将所述流浸膏分散于水中，得到均匀的流浸膏分散液，以便于后续的提取。本发明对所述分散的具体方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的技术手段进行分散即可，如超声分散。
得到流浸膏分散液后，本发明对流浸膏分散液依次进行石油醚萃取和氯仿萃取。在本发明中，所述石油醚萃取时石油醚和流浸膏分散液的体积比优选为0.9～1.1:1，更优选为1:1；所述石油醚萃取的次数优选为2～3次，更优选为3次；单次萃取的时间优选为15～25min，更优选为20min。本发明通过石油醚萃取去除提取液中的低极性脂溶性杂质。
石油醚萃取完成后，本发明将石油醚萃取后的萃余液进行氯仿萃取。在本发明中，所述氯仿萃取时氯仿和石油醚萃余液的体积比优选为0.8～1.0:1，更优选为0.9:1；所述氯仿萃取的次数优选为2～3次，更优选为3次；单次萃取的时间优选为10min～20min，更优选为15min。
氯仿萃取完成后，本发明将所述氯仿部位浸膏进行第一硅胶柱层析分离。在本发明中，所述第一硅胶柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系；所述第一硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱；所述各梯度洗脱剂中石油醚和丙酮的体积比依次为10:0、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0:1，每一梯度洗脱剂的体积与氯仿部位浸膏的质量之比为3000ml：45～55g，更优选为3000ml：50g。
在本发明中，所述第一硅胶柱层析分离用硅胶柱的规格优选为1500g，100～200mesh，ф75mm×l1100mm；本发明优选干法拌样，湿法装柱；所述湿法装柱用溶剂优选为二氯甲烷。
本发明以每一梯度洗脱剂体积的1/3为一流份，将第11到第15流份浓缩后合并，得到粗提取物。
在本发明的具体实施例中，优选将流份浓缩后进行tlc分析，将相似组份合并，本发明通过第一硅胶柱层析分离可依次得到8个组份，按照极性由小到大依次记为a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8，其中a3组份即为本发明所述的粗提取物。
得到粗提取物后，本发明将所述粗提取物进行第二硅胶柱层析分离。在本发明中，所述第二硅胶柱层析分离的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯体系；所述第二硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱；所述各梯度洗脱剂中二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0:1，每一梯度洗脱剂的体积与粗提取物的质量之比为2000ml：3～3.5g，更优选为2000ml：3.1g。
在本发明中，所述第二硅胶柱层析分离用硅胶柱的规格优选为300g，100～200mesh，ф45mm×l900mm；本发明优选干法拌样，湿法装柱；所述湿法装柱用溶剂优选为二氯甲烷。
本发明以每一梯度洗脱剂体积的1/2为一流份，将第10到第11流份浓缩后合并，将溶剂挥干后得到3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮。
在本发明的具体实施例中，优选将流份浓缩后进行tlc分析，将相似组份合并，本发明通过第二硅胶柱层析分离可依次得到7个组份，按照极性由小到大依次记为b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7，其中b5组份的溶剂挥干后即可得到本发明所述的3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮。
本发明提供了上述方案所述的3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮或上述方案所述方法提取到的3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮在制备抗宫颈癌药物和抗肝癌药物中的应用。本发明对所述应用没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法将所述3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮制备成抗癌药物即可。
下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)将长序荆干燥树叶粉碎，过100目筛，在常温下用95％(g/g)的乙醇提取三次，采用回流法提取，第一次用10倍(g/ml)于原材料的乙醇提取2小时，第二次用8倍于原材料的乙醇提取1.5小时，第三次用6倍于原材料的乙醇提取1小时，之后回收乙醇至无醇味，得流浸膏。
(2)将提取所得流浸膏600g分散于2200ml水中，依次用石油醚、氯仿进行系统溶剂萃取，萃取液分别浓缩得石油醚部位浸膏32.50g、氯仿部位浸膏67.36g。
(3)取氯仿部位浸膏50g，进行硅胶柱层析分离，干法拌样50g硅胶，湿法装柱(湿法装柱用溶剂为二氯甲烷)，硅胶柱的规格为1500g，100～200mesh，ф75mm×l1100mm，以石油醚:丙酮＝10:0-10:1-9:1-8:1-7:1-6:1-5:1-4:1-3:1-2:1-1:1-0:1为洗脱剂梯度洗脱，每一梯度用洗脱剂的用量为3000ml，以1000ml为一流份，分别收集、浓缩，通过tlc分析，将组成相似组分合并，得到8个组分，按照极性由小到大依次记为a1～a8，其中a3组份为粗提取物，是第11～第15流份浓缩后混合得到。
(4)将a33.1g干法拌样3.1g硅胶，湿法装柱(湿法装柱用溶剂为二氯甲烷)，硅胶柱的规格为300g，100～200mesh，ф45mm×l900mm，以石油醚:乙酸乙酯＝10:1-9:1-8:1-7:1-6:1-5:1-4:1-3:1-2:1-1:1-0:1为洗脱剂梯度洗脱，每一梯度用洗脱剂的用量为2000ml，以1000ml为一流份，分别收集、浓缩，通过tlc分析，将组成相似组分合并，得到7个组分，按照极性由小到大依次为b1-b7，其中b5组分为第10到第11流份浓缩后混合得到，将b5组份的溶剂挥干，得到3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮。
对所得产物进行hr-esi-ms、红外光谱测试、核磁共振碳谱和核磁共振氢谱测试，同时进行hmbc谱测试，对碳谱、氢谱和hmbc谱结果进行分析，可知产物确实为3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮。
实施例2
其他条件和实施例1相同，仅将步骤(1)中乙醇提取条件改为：第一次用10.5倍(g/ml)于原材料的乙醇提取2.5小时，第二次用8.5倍于原材料的乙醇提取2小时，第三次用6.5倍于原材料的乙醇提取1小时。
按照实施例1中的方法进行结构鉴定，鉴定结果和实施例1一致，所得产物即为3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮。
实施例3
对实施例1所得产物的抗癌活性进行测试，步骤如下：
实验细胞株：宫颈癌hela细胞、肝癌hepg2细胞；
试验药物与试剂：dmem高糖培养基、胎牛血清(fbs)、pbs、0.25％胰蛋白酶-edta消化液、青霉素、链霉素，cck-8试剂盒，实施例1制备的3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮；
实验仪器：
re-2000a旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，zf7三用紫外分析仪(巩义市予华仪器有限责任公司)，-80℃冰箱(海尔)，超净台工作台，co2培养箱，酶标仪。al104电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，b—220型恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)，dzf26021型真空干燥箱(上海精密实验设备有限公司)。
实验步骤：
从-80℃冰箱内取出需要复苏的细胞，置于提前预热的恒温水浴锅内37℃快速解冻，用移液器迅速将冻存管内的解冻后的细胞液移至含有10％fbs和1％双抗(青霉素、链霉素)dmem完全培养液中，1000r/min离心6min，弃去上清液，加入5mldmem完全培养液，混匀后将细胞液移至25cm培养瓶中，晃动培养瓶，使细胞液均匀分散，置于含5％co2，37℃培养箱内培养。细胞培养3～4天传代1次。
待培养细胞生长到对数生长期后，将细胞消化，制成细胞悬液，细胞计数后，在96孔板中按100μl/孔的比例接种细胞悬液，将培养板放在37℃，5％co2培养箱中培养24h。
从培养箱中取出培养板，吸出旧培养液，每孔加入100μl无血清含双抗的dmem培养液，饥饿12h后去掉培养液，加入0.1μg/ml药物(实施例1制备的3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮)的dmem完全培养液，溶剂对照组加入完全培养液，每孔100μl，置于培养箱中继续培养24h。
24h后，取出培养板，弃去每孔中的细胞培养液，在适当避光条件下加入cck-8溶液与含双抗dmem培养液以1∶10比例新鲜配制的显色液，每孔100μl，置于培养箱中孵育0.5h，置于酶联免疫检测仪中，在波长为450nm处检测其吸光度(od)值。
根据每组测得的od值，按照式i计算出药物对受试细胞的生长抑制率。
细胞生长抑制率＝1-(实验组od值/对照组od值)×100％式i。
实验结果显示，3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮浓度为0.1μg/ml时，对对人宫颈癌hela细胞和人肝癌hepg2细胞生长抑制率分别为89％和72％。
由以上实施例可以看出，本发明提供的3,4,3’-三羟基-2,2’,5’-三甲氧基查尔酮具有明显的抗肿瘤活性，且提取方法简单，容易实施，在制备抗癌药物方面具有广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。