一种灰树花小肽铁螯合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种灰树花小肽铁螯合物及其制备方法和应用。

背景技术：

灰树花(grifolafrondosa)是珍稀食药两用菌之一，属担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌科，树花菌属真菌，又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、重菇、云覃、莲花菌等，日本称之舞茸(maitake)。野生灰树花多生长于亚热带至温带森林中，日本、俄罗斯、北美及中国长白山地区、河北、四川等地广泛分布。灰树花子实体味道鲜美、具有松茸的浓香，同时具有很高的营养和保健价值。灰树花中糖类含量最高，其中的蛋白含量仅次于多糖，且蛋白含量比香菇、金针菇、木耳等菌类中的更高。子实体中含17种氨基酸，其中7种人体必需氨基酸，占灰树花氨基酸总量的40.0％。灰树花子实体中异亮氨酸(ile)、天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)含量较高，对保持浓郁的鲜味、促进与金属离子的螯合、缓解疲劳、保护人脑神经等具有重要作用。

灰树花不仅营养丰富，而且具有一定的保健功能。但是对于灰树花的研究多停留在多糖提取及其生物学功能方面，而灰树花多肽具有抗氧化、免疫增强、抗肿瘤等功能活性，目前关于灰树花蛋白质及其衍生物的研究鲜见报道。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种灰树花小肽铁螯合物及其制备方法，本发明以灰树花子实体提取灰树花蛋白，通过酶解获得小肽，分离纯化后与铁盐螯合制得灰树花肽铁螯合物，该肽铁螯合物的铁生物利用度优于无机盐铁，并具有较强的免疫活性。

本发明还提供灰树花小肽铁螯合物的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种灰树花小肽铁螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:

(1)灰树花子实体蛋白提取：

将干燥的灰树花子实体粉碎制成灰树花子实体超微粉，加入蒸馏水，搅拌均匀后，恒温搅拌提取，结束后，冷却至室温，离心，取上清液，低温静置过夜，离心倾去上清液，沉淀洗涤，真空干燥粉碎，过筛，即得灰树花子实体蛋白粉；

(2)灰树花蛋白酶解：

称取灰树花子实体蛋白粉，加入蒸馏水，再加入蛋白酶，进行酶解，结束反应后水解液离心，取上清液经透析，冻干得到粗灰树花蛋白肽，保存；

(3)灰树花蛋白肽的分离纯化：

对得到的粗灰树花蛋白肽通过超滤进行第一步纯化；超滤纯化后通过葡聚糖凝胶柱进行分离纯化得到灰树花多肽；

(4)灰树花小肽铁螯合物的制备：

称取灰树花多肽，加入蒸馏水溶解后，再加入的抗坏血酸溶液，再加入fecl2溶液，振荡反应，反应结束后离心，取上清加入无水乙醇，过夜沉淀，离心取沉淀，洗涤后干燥，得到灰树花小肽铁螯合物。

其中，步骤(1)所述取上清液后先将上清液蒸发至原体积的1/2，用调ph值至3.5灰树花蛋白等电点。

其中，步骤(2)所述蛋白酶为风味酶、复合蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶中的一种。

其中，步骤(2)所述蛋白酶的加入量为1600-2100u/g灰树花子实体蛋白粉。

作为优选，步骤(2)所述酶解时间为1-3.5h。

最优选的，采用碱性蛋白酶水解灰树花蛋白最佳工艺条件为ph9、加酶量1800u/g灰树花子实体蛋白粉、酶解温度55℃、灰树花蛋白浓度0.5g/100ml、酶解时间2.5h。本发明在最佳酶解条件下，亚铁螯合能力为(1.854±0.025)mg/g，水解度为(6.14±0.05)％。

其中，步骤(3)所述粗灰树花蛋白肽通过超滤进行第一步纯化为粗灰树花蛋白肽配制成溶液，过滤，得到上清液，将溶液经超滤后透析，冻干得到大于5kda,1-5kda和小于1kda的灰树花多肽组分。

其中，步骤(3)所述超滤纯化后通过葡聚糖凝胶柱进行分离纯化为通过将葡聚糖凝胶粉加入蒸馏水中充分溶胀，去除悬浮颗粒进行脱气处理；将脱气处理的葡聚糖凝胶溶液加入到层析柱中，用pbs缓冲液作为流动相，将超滤后不同分子量灰树花多肽进行上样洗脱，从而得到纯化组分灰树花多肽。

其中，步骤(4)中每100mg灰树花多肽，加入100-120μl抗坏血酸溶液；加入100-120μlfecl2溶液；振荡反应温度为20-25℃、反应4-5min。

最优选的，螯合反应的最佳工艺条件为：每100mg灰树花多肽，当ph为5、反应体系总体积为10ml，加入1mol/l的100μl氯化亚铁、温度为20℃、反应5min，在此条件下得到的螯合物铁含量最高，为(31.51±1.32)mg/g。

本发明所述的灰树花小肽铁螯合物的制备方法所制备的灰树花小肽铁螯合物。

本发明所述的灰树花小肽铁螯合物的制备方法所制备的灰树花小肽铁螯合物在制备生物活性补铁剂中的应用。

本发明中的试剂均市售可得，碱性蛋白酶(200u/mg)、中性蛋白酶(14000u/g)、胃蛋白酶(15000u/g)、复合蛋白酶(120u/mg)、风味蛋白酶(20u/mg)购买于上海源叶生物有限公司；胰蛋白酶(2500u/g)阿拉丁试剂公司；sephadexg-25、sephadexg-15北京索莱宝科技有限公司。

双抗：(青霉素100u/ml,链霉素0.1mg/ml)；非必需氨基酸:(l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-天(门)冬酰胺、l-天(门)冬氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸和甘氨酸)；胎牛血清、非必需氨基酸溶液、mem培养液购于美国gibco公司；青霉素-链霉素混合溶液购于碧云天生物技术有限公司。

本发明所用材料为灰树花，其蛋白含量仅次于多糖。灰树花子实体蛋白中含17种氨基酸，其中7种人体必需氨基酸，占灰树花氨基酸总量的40.0％。灰树花子实体中异亮氨酸(ile)、天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)含量较高，对保持浓郁的鲜味、促进与金属离子的螯合、缓解疲劳、保护人脑神经等具有重要作用。酶解灰树花蛋白得到的灰树花多肽通常具有一定的生物活性，且易于被人体消化吸收、抗原性较低等特质。利用灰树花多肽合成的多肽铁螯合物为棕色粉末，无异味，无游离铁离子，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，性质稳定。该多肽铁螯合物可被动物体以分子形式吸收，并靶向到特定组织释放铁元素，补铁的同时也减少了游离铁离子产生的内源性自由基对细胞膜造成损伤的情况。此外，人体免疫系统与铁缺乏息息相关，该灰树花多肽铁可有效促进机体免疫系统的增强。该发明所制备的灰树花小肽铁螯合物性质稳定，安全性高，易于吸收且具有一定的生物活性。

本发明不仅为促进药食同源菌类的产业和资源高效利用提供了新的研究方向，也为肽铁螯合物的制备提供了原料。本发明探究了灰树花蛋白肽铁螯合物的制备工艺、基本结构以及其吸收机制，并研究了灰树花多肽及其铁螯合物的免疫活性，为灰树花蛋白肽铁作为安全有效的具有一定生物活性的功能性食品添加剂提供了依据，同时提升了灰树花的经济和社会价值。

本发明对灰树花蛋白肽及其铁螯合物进行紫外和红外光谱扫描，图谱表明，灰树花蛋白肽及其铁螯合物均具有氨基酸的特征吸收。但螯合物紫外最大吸收峰发生蓝移，且红外光谱中峰数、峰强和峰的位置均发生改变并出现n-fe吸收峰，表明生成了灰树花肽铁螯合物，同时阐明了其螯合机制为：铁与氨基和羧基均有结合。

本发明通过体外消化实验表明，gfp-fe可在胃肠道中保持较高的溶解度和稳定性。且在肠道环境中,gfp-fe溶解度比feso4更高可更好促进小肠对gfp-fe的吸收。细胞毒性实验结果证明，gfp-fe与feso4相比毒性较低。通过caco-2细胞模型法对灰树花肽铁螯合物的吸收效果与吸收机制研究表明，gfp-fe吸收好于feso4，寡肽转运蛋白(pept1)介导了gfp-fe的主动转运，同时存在多药耐药性蛋白介导的外排作用。

在免疫活性实验中，cgfp、gfp-2、cgfp-fe、gfp-fe对小鼠脾细胞和巨噬细胞的增殖具有显著的增强作用，表明灰树花蛋白肽及其铁螯合物对特异性免疫和非特异性免疫过程均有促进作用，其中灰树花肽铁螯合物的促进作用更强。同时，灰树花蛋白肽及其铁螯合物能促进巨噬细胞分泌no，也能在一定程度上增强il-6和tnf-α细胞因子的释放。

有益效果：与现有技术比，本发明具有以下优点：

1、本发明制得的灰树花小肽铁螯合物性质稳定，易溶于水，该小肽铁螯合物较传统的口服铁剂硫酸亚铁对胃肠道的损伤小，且能够被更好地吸收，可以作为新型的补铁剂。

2、本发明制得的灰树花多肽铁螯合物具有一定的免疫活性，强化机体免疫系统，对铁缺乏造成机体免疫系统的损伤有一定的恢复作用。

3、本发明以酶解法制备灰树花多肽，与传统的化学法相比，酶解法更好保留产物结构和活性，反应条件温和，选择性高。

4、本发明通过超滤和葡聚糖凝胶法对粗灰树花蛋白肽纯化，超滤广泛应用于多肽液的分离纯化，较传统的分离方法，如离子交换色谱法和高效色谱分析法，其能耗低、设备小、选择性好、温度低且分离速度快，分离效率高。

5、本发明以化学法制备灰树花小肽铁螯合物，该法简便快捷，且合成的多肽铁螯合物效率高，螯合的铁含量高。

附图说明

图1为gfpu-2经过sephadexg-25洗脱曲线示意图；

图2为gfpu-3经过sephadexg-15洗脱曲线示意图；

图3为sephadexg-15测定标准物质分子量示意图；

图4为灰树花蛋白肽及其铁螯合物紫外光谱图；

图5为灰树花蛋白肽红外光谱图；

图6为灰树花小肽铁螯合物红外光谱图；

图7为体外模拟胃部环境对灰树花小肽铁螯合物的消化情况示意图；

图8为体外模拟肠道对灰树花小肽铁螯合物的消化情况示意图；

图9为mtt法测定灰树花小肽铁螯合物和硫酸亚铁对caco-2细胞的影响示意图；其中，a、b、c分别为干预12h、24h、48hmtt结果。*和**分别表示与空白组相比，p<0.05和p<0.01；

图10为灰树花蛋白肽及其铁螯合物对小鼠脾细胞增殖的影响示意图；

图11为灰树花蛋白肽及其铁螯合物对小鼠巨噬细胞增殖的影响示意图；

图12为灰树花蛋白肽及其铁螯合物对巨噬细胞生成no的影响示意图；

图13为灰树花蛋白肽及其铁螯合物对巨噬细胞生成il-6的影响示意图；

图14为灰树花蛋白肽及其铁螯合物对巨噬细胞生成tnf-α的影响示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)将干燥的灰树花子实体用超微粉碎机粉碎后经300目筛分，制成灰树花子实体超微粉，称取90g灰树花子实体粉，按照料液比为1:50(g/ml)加入蒸馏水，搅拌均匀后用1mol/lnaoh溶液调节ph值至9，放入70℃恒温水浴锅中搅拌提取3h，期间用1mol/lnaoh溶液保持体系ph值恒定。结束后，冷却至室温，4000r/min离心20min。上清液旋转蒸发至原体积的1/2，用2mol/lhcl溶液调ph值至3.5(灰树花蛋白等电点)，低温静置过夜，4000r/min离心25min，倾去上清液，沉淀用95％乙醇溶液洗涤一次，真空干燥。粉碎，过60目筛，即得灰树花子实体蛋白粉。

(2)准确称取一定量灰树花子实体蛋白粉，按比例加入蒸馏水，溶解灰树花子实体蛋白使得溶液的质量浓度为0.5g/100ml，调节碱性蛋白酶的最适ph值9.0后于最适温度55℃保温10min，按照加酶量为1800u/g灰树花子实体蛋白粉加入碱性蛋白酶，55℃下酶解2.5h，期间保持体系ph值恒定，95℃灭酶10min结束反应，水解液4000r/min离心25min，上清液定容至250ml，得到粗灰树花蛋白肽(cgfp)4℃保存。

(3)利用超滤法对得到的粗灰树花蛋白肽(cgfp)进行第一步的纯化，将cgfp配制成10mg/ml的溶液，并经过0.45μm水系滤膜，得到上清液。随后，在常温、压力为0.3mpa下，将溶液依次通过5kda和1kda的超滤膜，得到>5kda,5kda～1kda和<1kda的三种组分，分别命名为gfpu-1,gfpu-2,gfpu-3，保留gfpu-2，gfpu-3进行葡聚糖凝胶柱进行分离纯化。首先将20g葡聚糖凝胶粉加入500ml蒸馏水中充分溶胀，去除悬浮颗粒进行脱气处理；其次将脱气处理的葡聚糖凝胶溶液加入到层析柱(1.6×60cm)中，避免断层和气泡；然后用0.05mol/l的pbs(ph6.8)缓冲液作为流动相，平衡5个柱体积；最后进行上样洗脱，从而得到纯化组分。

(4)根据gfpu-2和gfpu-3分子量不同，分别使用sephadexg-25和sephadexg-15层析柱进一步纯化，sephadexg-25的色谱条件为：上样量为15mg/ml；流动相为0.05mol/l的pbs(ph6.8)缓冲液；流速为0.2ml/min；每管收集5ml。sephadexg-15的色谱条件为：上样量为25mg/ml；流动相为0.05mol/l的pbs(ph6.8)缓冲液；流速为0.4ml/min；每管收集6ml，分别得到gfp-1和gfp-2灰树花多肽。流出物均在220nm处测定，并收集主要组分(gfp-1和gfp-2)进行蛋白含量和亚铁螯合能力测定。

(5)分别准确称取0.1g灰树花多肽(gfp-2)和粗灰树花蛋白肽(cgfp)，分别加入10ml蒸馏水溶解后，再加入100μl0.2g/l的抗坏血酸溶液，调节体系ph为5.0，再加入100μl的1mol/l的fecl2溶液，振荡反应温度为20℃、反应5min。反应结束后，4000r/min离心10min，取上清按1:5(v:v)的比例加入无水乙醇，4℃过夜沉淀。4000r离心15min，取沉淀，用25ml95％(v/v)乙醇洗涤一次，50℃真空干燥箱中干燥8h，得紫色固体为灰树花小肽铁螯合物(gfp-fe)和粗灰树花蛋白肽铁螯合物(cgfp-fe)。

实施例2

实施例2与实施例1制备方法相同，不同之处在于步骤(2)按照加酶量为2100u/g灰树花子实体蛋白粉加入碱性蛋白酶，酶解1h；步骤(5)中0.1g灰树花蛋白肽，加入120μl0.2g/l抗坏血酸溶液；加入120μl1mol/lfecl2溶液；振荡反应温度为25℃、反应4min。

实施例3

实施例3与实施例1制备方法相同，不同之处在于步骤(2)按照加酶量为1600u/(g灰树花子实体蛋白粉)加入碱性蛋白酶，酶解3.5h。

实施例4

实施例4与实施例1制备方法相同，不同之处在于步骤(2)碱性蛋白酶分别替换成风味酶、复合蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶或胰蛋白酶，调节各个酶的最适ph分别为7.0、7.0、2.0、7.0、8.0，最适酶解温度50℃、45℃、37℃、50℃、37℃。

实施例5

采用实施例1的步骤(2)准确称取一定量灰树花子实体蛋白粉，按比例加入蒸馏水，溶解灰树花子实体蛋白使得溶液的质量浓度为0.5g/100ml，调节各个酶的最适ph值后于最适温度保温10min。按照加酶量为1800u/g分别加入6种蛋白酶(风味酶、复合蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶)，分别酶解0.5、1、2、3、4、5h，期间保持体系ph值(7.0、7.0、2.0、7.0、9.0、8.0)恒定，在每个酶的最适温度(50℃、45℃、37℃、50℃、55℃、37℃)下水解，95℃灭酶10min结束反应。水解液4000r/min离心25min，上清液定容至250ml，4℃保存。每组酶解反应做3次平行试验，亚铁螯合能力和水解度测定实验平行进行3次。

结果表明采用碱性蛋白酶水解灰树花子实体蛋白最佳，最佳工艺条件为ph9、加酶量1800u/g、酶解温度55℃、底物质量浓度0.5％、酶解时间2.5h。在最佳酶解条件下，亚铁螯合能力为(1.854±0.025)mg/g，水解度为(6.14±0.05)％。

采用实施例1的步骤(3)利用超滤法对得到的粗灰树花蛋白肽(cgfp)进行第一步的纯化，将cgfp配制成10mg/ml溶液，并经过0.45μm水系滤膜，得到上清液。随后，在常温、压力为0.3mpa下，将溶液依次通过5kda和1kda的超滤膜，得到>5kda,5kda～1kda和<1kda的三种组分，分别命名为gfpu-1，gfpu-2，gfpu-3，双缩脲法测定各组分的蛋白含量，同时测定其亚铁螯合能力，结果见表1。

表1超滤组分蛋白含量及亚铁螯合能力测定

由表1可知，超滤得到的三个组分的蛋白含量，＞5kda组分的蛋白含量最低，并且一般具有较好螯合活性的蛋白肽均为小分子肽，故舍弃该组分，所以实施例1中对另两个组分gfpu-2，gfpu-3进行进一步研究。

采用实施例1的步骤(3)在葡聚糖凝胶柱对gfpu-2，gfpu-3进行分离纯化。首先将20g葡聚糖凝胶粉加入500ml蒸馏水中充分溶胀，去除悬浮颗粒；其次将脱气处理的葡聚糖凝胶溶液加入到层析柱(1.6×60cm)中，避免断层和气泡；然后用0.05mol/l的pbs(ph6.8)缓冲液作为流动相，平衡5个柱体积；最后进行上样洗脱，从而得到纯化组分。

根据gfpu-2和gfpu-3分子量不同，分别使用sephadexg-25和sephadexg-15层析柱进一步纯化，sephadexg-25的色谱条件为：上样量为15mg/ml；流动相为0.05mol/l的pbs(ph6.8)缓冲液；流速为0.2ml/min；每管收集5ml。sephadexg-15的色谱条件为：上样量为25mg/ml；流动相为0.05mol/l的pbs(ph6.8)缓冲液；流速为0.4ml/min；每管收集6ml，分别得到gfp-1和gfp-2灰树花多肽。流出物均在220nm处测定，并收集主要组分(gfp-1和gfp-2)进行蛋白含量和亚铁螯合能力测定。

gfpu-2经过sephadexg-25层析柱洗脱曲线如图1所示。由图1可见，gfpu-2经过sephadexg-25之后，流出三个色谱峰，但由于第二、三个峰较第一个峰小很多，即超过20管后蛋白含量较低，故只收集第一个峰的样品溶液。收集液50℃减压蒸馏，透析完成后冻干得到淡黄色gfp-1固体粉末。

gfpu-3经过sephadexg-15层析柱洗脱曲线如图2所示。如图2所示得到的色谱峰为单一的对称峰，说明得到的灰树花蛋白肽为较为均一的小肽。对该组分收集浓缩透析后冻干，得到白色gfp-2固体粉。

用sephadexg-15层析柱对gfp-2进行灰树花蛋白肽分子量测定。以维生素b12(1350da)，氧化型谷胱甘肽(613da)，还原型谷胱甘肽(307da)以及马尿酸(178da)作为标准品，根据分子量对数与洗脱体积呈线性关系做标准曲线，根据样品的洗脱体积进行测定，结果如图3所示。

标准物质的洗脱体积与分子量线性关系为y＝-0.0144x+3.7612，r2＝0.9965。根据gfp-2的洗脱体积计算得到gfp-2的分子量大小为963da，推测其由7～8个氨基酸构成。

通过超滤、sephadexg-25和sephadexg-15对水解产物进行纯化，得到亚铁螯合能力最强的组分为gfp-2，其螯合能力为(269.7±3.9)μg/g。通过凝胶色谱法进行分子量测定，得到gfp-2相对分子量为963da。灰树花蛋白氨基酸组成分析表明，天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸含量较高，在与亚铁离子螯合中发挥着主要的作用。

实施例6

灰树花小肽铁螯合物(gfp-fe)紫外光谱和红外光谱分析

采用紫外光谱对实施例1中纯化灰树花蛋白肽组分(gfp-2)及其铁螯合物(gfp-fe)进行扫描，定性观察样品紫外吸收光谱变化情况。分别称取一定量的gfp-2和gfp-fe，用蒸馏水溶解配制成浓度为0.2mg/ml的样品溶液，在190～400nm的波长范围内进行紫外光谱的扫描。

采用kbr压片法对gfp-2和gfp-fe进行红外光谱分析。将kbr置于红外干燥箱中干燥至恒重，分别准确称取1.5mg的gfp-2和gfp-fe样品，分别与150mgkbr的粉末充分研磨。研磨均匀后，通过压片机将其压制成薄片。再准确称取150mg的kbr作为背景对照。将样品在傅里叶变换红外光谱仪进行扫描并测定，扫描的范围4000～400cm^-1，扫描次数32次，分辨率2cm^-1。

灰树花蛋白肽组分(gfp-2)及其灰树花小肽铁螯合物(gfp-fe)紫外吸收光谱图如图4所示，特征氨基酸残基的紫外吸收主要在280nm处，而肽键(蛋白断裂处的酰胺键)的紫外吸收主要在190～220nm处，可见样品中主要表现的是蛋白质断裂后的肽键的紫外吸收，因此可以说，此样品含有较多的肽段蛋白质。

比较灰树花蛋白肽组分(gfp-2)和灰树花小肽铁螯合物(gfp-fe)紫外吸收光谱可知，螯合后，最高吸收峰由194nm变成192nm，吸收峰发生蓝移，这是由于羰基上的氧原子参与fe²⁺的络合作用，fe²⁺的加入发生了电荷迁移跃迁、配位场跃迁，导致羰基的电荷发生改变，吸收带蓝移。以此说明，螯合物与未螯合前是两种不同的物质。

图5和图6分别为灰树花蛋白肽组分(gfp-2)及其灰树花小肽铁螯合物(gfp-fe)红外光谱图。

图5中3377.97cm^-1处的吸收峰为n-h的伸缩振动峰，属于氨基酸的特征吸收峰。1654.15cm^-1出现的强吸收峰属于酰胺i带，是由蛋白多肽骨架的c＝o不对称伸缩振动所引起的；1547.95cm^-1和1259.66cm^-1处的吸收峰分别归属酰胺ⅱ带和酰胺ⅲ带，分别是n-h的弯曲振动、c-h的伸缩振动引起的吸收峰，由此推断灰树花蛋白肽结构可能是β折叠。1400.58cm^-1的吸收峰，是羧酸根的对称伸缩振动峰。同时，1068.53cm^-1处出现了(pt-nh2)较强吸收峰，在517.34cm^-1(pr-nh2)的特征吸收峰明显。

图5和图6对比可知，螯合物红外光谱中仍保留了蛋白肽类物质的特征吸收峰，但灰树花蛋白肽和灰树花小肽铁螯合物的红外光谱在吸收峰数目、强度和位置上有很明显的的不同，表明二者在结构上的差异。n-h的伸缩振动峰由低波数向高波数移动且强度减弱，酰胺i带峰强度减弱，pt-nh2吸收峰出现在1053.41cm^-1处且为强吸收峰，可以推断fe²⁺与-nh2有较强结合。c＝o对称伸缩振动峰和不对称伸缩振动峰强度均有较大程度地变弱，说明fe²⁺与-cooh也有较强结合。螯合后800cm^-1～500cm^-1的指纹区的峰消失，一个新的峰526.85cm^-1出现，是因为n-fe的伸缩振动产生。

试验例1

灰树花小肽铁螯合物体外模拟胃部环境消化

模拟胃液：准确称量0.2g氯化钠和3g胃蛋白酶(酶活15000u/g)，量取80ml的水，于100ml的烧杯中，搅拌该混合液使其充分溶解，再用1mol/lhcl调节该混合液的ph至2.0并于100ml容量瓶中定容。分别配制5mg/ml的cgfp-fe、gfp-fe水溶液，为实施例1最后得到的粗灰树花蛋白肽铁螯合物(cgfp-fe)、灰树花小肽铁螯合物(gfp-fe)和0.5mg/mlfeso4水溶液。分别吸10ml上述溶液至50ml锥形瓶中，用0.5mol/l盐酸调节ph值到2.0，将锥形瓶放入37℃恒温振荡培养箱中预热5min，各再加模拟胃液10ml并混匀，于37℃恒温振荡箱中150rpm分别反应0、10、30、60、120、180min，取出95℃水浴灭酶10min，静置冷却，4000r/min离心10min，收集上清，用邻菲罗啉比色法测定样品溶液中铁的浓度。

如图7所示，总体来看，feso4、cgfp-fe和gfp-fe在胃部环境中均可保持一个较为稳定的溶解状态。由此说明，灰树花蛋白肽铁螯合物可以在酸性环境中稳定存在，且可以抵制胃蛋白酶的消化。

试验例2

灰树花小肽铁螯合物体外模拟肠道环境消化

模拟肠液：准确称量0.68g磷酸二氢钾溶于25ml水中，后加入0.2mol/l的氢氧化钠溶液7.7ml以及水50ml，均匀混合，再加入牛胆盐6.0g和胰蛋白酶(2500u/mg)1.0g，搅拌使其溶解完全，最后用0.2mol/l氢氧化钠溶液调节该混合液的ph值至7.5，定容至100ml。分别配制5mg/ml粗灰树花蛋白肽铁螯合物(cgfp-fe)、灰树花小肽铁螯合物(gfp-fe)水溶液和0.5mg/mlfeso4水溶液。分别取10ml上述三种溶液至50ml锥形瓶中，用0.5mol/l盐酸调节ph值到2.0，将锥形瓶放入37℃恒温振荡培养箱中预热5min，各再加试验例1中配置的模拟胃液10ml并混匀，于37℃恒温振荡箱中150rpm反应1h后取出，用0.9mol/lnahco3调样品ph值至5.3，再用2mol/lnaoh调ph至7.5，加模拟肠液1ml，将烧杯置于37℃恒温振荡箱中150rpm分别反应0.5、1、2、4、6h。反应结束后95℃灭酶10min，4000r/min离心10min，收集上清，用邻菲罗啉比色法测定溶液中的铁含量，得到溶解度。

如图8所示，将胃液消化后的灰树花蛋白肽铁经由模拟肠液消化一段时间后，gfp-fe较feso4相比可保持更高的溶解度，从而更好促进小肠对gfp-fe吸收。由于灰树花蛋白肽铁中没有游离的fe²⁺，且灰树花蛋白肽的存在对铁元素起到一定的保护和缓冲的作用，可减少由于肠道碱性环境形成的铁不溶物造成铁溶解度的降低，从而保证可溶性铁能被肠道更好吸收。cgfp-fe在肠道中随时间变化铁浓度逐渐下降最后达到稳定状态，是由于粗灰树花蛋白肽中其他杂质的存在对螯合物的稳定性有影响，从而影响了螯合物中铁的溶解性。

本发明通过体外消化实验表明，gfp-fe可在胃肠道中保持较高的溶解度和稳定性。且在肠道环境中，gfp-fe溶解度比feso4更高可更好促进小肠对gfp-fe的吸收。

试验例3

灰树花小肽铁螯合物caco-2细胞毒性实验

caco-2细胞培养于含20％(v/v)fbs(胎牛血清)、1％(v/v)双抗(青霉素-链霉素)和1％(v/v)非必需氨基酸的mem完全培养基中，在37℃，5％co2和相对湿度90％的细胞培养箱内培养，培养基隔两天更换，待细胞长至80％左右用胰酶消化后进行实验。将caco-2细胞悬浮液接种于96孔板中，每孔为5×10³个细胞，置5％co2，37℃培养箱中培养72h。待细胞长至70～80％左右，分别加入150μl含浓度为0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，5.0mg/l的实施例1中步骤(5)制备的灰树花小肽铁螯合物(gfp-fe)和feso4的mem培养基(10％fbs)分别干预12h、24h、48h，每个浓度设6个复孔，随行空白组。之后加入5mg/mlmtt溶液，继续置于培养箱中培养4h。弃去细胞上清，加入二甲基亚砜dmso(150μl/孔)，震摇，酶标仪上于492nm处测定每孔的吸光度。细胞存活率计算方法如下：

其中，a实验组为样品吸光度；a对照组为空白组的吸光度。

mtt实验结果如图9所示，gfp-fe和feso4对细胞的毒性呈现时间依赖性；同时，实验结果显示：24h和48hgfp-fe的毒性低于feso4，这提示gfp-fe可以成为安全的新型补铁剂。

试验例4

测定跨上皮细胞电阻

按照传代培养的方法将细胞以10⁵/ml接种到transwell小室上室侧，在上室侧每孔加0.5ml细胞悬液，下室侧每孔加1.5ml新鲜培养基，前7天每隔一天更换培养液，之后每天换液，培养至21天。用细胞电阻仪测量跨膜上皮细胞电阻值(teer)，大于300ω·cm²的细胞单层膜可用于转运实验。首先，将电极放入预热至37℃的hbss中，平衡20min；移走培养板中的培养基，上室侧加入预热的hbss0.5ml，下室侧加入1.5ml，37℃平衡20min，同时洗去细胞表面的杂质；移走hbss，重新加入预热的hbss，测定跨膜电阻值；用1个空白载体重复上述步骤以获得空白值；按照如下公式计算细胞的跨膜电阻值

teer＝(测得电阻值-空白小室电阻值)×培养小室面积(1.12cm²)

选取caco-2单层细胞跨膜电阻值超过300ω·cm²的细胞开展后续实验。

试验例5

灰树花小肽铁螯合物转运实验

细胞培养如试验例4所示，当测定的细胞电阻值(teer)大于300ω·cm²时，用hbss(ph7.4)缓冲液小心冲洗上室细胞3次，第3次在37℃培养箱中孵育30min后轻轻吸去孔内hbss。

灰树花小肽铁螯合物(gfp-fe)和feso4药物从上室到下室侧的转运：上室侧分别加入0.5ml不同浓度(0.5，1.0，2.0mg/l)的gfp-fe和feso4溶液作为供给池，在下室侧加入1.5mlhbss作为接收池。下室侧到上室侧的转运：将相同浓度药物溶液1.5ml加到下室侧作为供给池，在上室侧加入0.5mlhbss作为接收池。把加好药物溶液和空白的transwell培养板置于37℃培养箱中，分别在30，60，90，120min时吸取接收池溶液500μl，同时补足同体积预热至37℃的hbss溶液。采用aas法测定样品中铁的含量。药物转运速率采用表观渗透系数(apparentpermeabilitycoefficient，papp)表示。

不同浓度的gfp-fe和feso4在caco-2细胞单层中的跨细胞转运中的表观通透系数见表2。如表2所示，gfp-fe在不同浓度下上室→下室的表观通透系数均比feso4有一定程度的提高，且2mg/l的浓度下，上室→下室的表观通透系数显著高于feso4，下室→上室的表观通透系数显著低于feso4。由此可见，gfp-fe肠道吸收效果好于feso4。同时，在各个浓度下gfp-fe的papp均大于国际上规定的吸收良好药物的10^-6cm/s，表明gfp-fe具有良好的吸收效果。

另一方面，从上室面到下室面的表观通透系数明显大于从下室面到上面的，说明gfp-fe很可能被小肠顶侧的转运载体所摄取。同时由下室→上室与上室→下室的比值可知，gfp-fe的吸收受到外排的影响较小，进一步说明gfp-fe良好的吸收效果。

表2不同浓度的gfp-fe和feso4在caco-2细胞转运过程的表观通透系数papp(×10^-6cm/s)

注：*表示在相同实验条件，相同浓度下gfp-fe与feso4比较具有显著性差异(p<0.05)

通过上述试验体外模拟胃肠道消化和caco-2细胞模型转运对灰树花蛋白肽铁螯合物的消化和吸收效果进行评价。同时，通过caco-2细胞模型对灰树花蛋白肽铁螯合物的吸收机制进行研究。实验结果表明，在胃部环境下gfp-fe和feso4均具有较好的稳定性，且在肠道环境下，gfp-fe比feso4溶解度更高。细胞毒性实验显示，gfp-fe与feso4相比毒性较低，且通过构建成功的caco-2细胞模型转运实验发现gfp-fe的上室→下室的表观通透系数大于feso4，表明其吸收好于feso4，说明gfp-fe可以开发成为一种安全、生物利用率高的新型补铁剂。吸收机制的研究显示，靶向寡肽转运蛋白(pept1)介导gfp-fe的主动转运，同时存在多药耐药性蛋白介导的外排作用。

试验例5

灰树花小肽铁螯合物对小鼠脾细胞增殖和巨噬细胞增殖的影响

用rpmi-1640完全培养基将实施例1中步骤(2)制备的粗灰树花蛋白肽(cgfp)、实施例1中步骤(4)制备的灰树花多肽(gfp-2)、实施例1中步骤(5)制备的粗灰树花蛋白肽铁螯合物(cgfp-fe)和灰树花小肽铁螯合物(gfp-fe)各自配置成50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的样品溶液。在96孔板中每孔加入5×10⁶个/ml细胞浓度的脾细胞或者2×10⁶个/ml细胞浓度的巨噬细胞悬液100μl，再分别加入100μlcgfp、gfp、cgfp-fe和gfp-fe样品，使样品终浓度分别为50、100、200μg/ml。每个样品的每个浓度做3个复孔。阴性对照组加入100μlrpmi-1640完全培养基代替样品溶液。lps对照组加入100μl终浓度为10μg/ml的lps溶液。刀豆蛋白a(cona)对照组加入100μl用rpmi-1640完全培养基配制的cona溶液，终浓度为5μg/ml。将96孔板放置于37℃下5％co2培养箱中培养44h。取出，每孔加入20μl5mg/mlmtt溶液，继续放入培养箱中继续培养4h，每孔去上清液，加入100μldmso，振荡10min后至每孔中形成的紫色结晶溶解,用酶标仪在490nm波长下测定吸光度(od值)，计算增殖率。公式如下：

灰树花小肽铁螯合物对小鼠脾细胞增殖和巨噬细胞增殖的影响结果如图10-11所示，脾脏作为重要的免疫器官，是人体的第二道免疫屏障，在人体特异性免疫中发挥着重要作用。亚铁螯合物组的增值率分别高于灰树花蛋白肽组的，显示出灰树花蛋白肽铁螯合物良好的免疫活性。巨噬细胞是哺乳动物体内最原始的免疫细胞，同时也是生物体内对抗病原体的第一道免疫屏障。当病原体进入人体内，巨噬细胞将其吞噬，随后巨噬细胞将发挥抗原呈递细胞的作用，将t淋巴细胞激活，从而参与非特异性免疫和特异性免疫过程，调节生物体的免疫应答活动。cgfp-fe和gfp-fe组的增殖率高达29.14％和27.75％，优于lps对照组。由此可见，灰树花蛋白肽铁螯合物较灰树花蛋白肽而言，对小鼠巨噬细胞的增殖更具有促进作用。

试验例6

灰树花小肽铁螯合物对小鼠巨噬细胞生成no、il-6和tnf-α的影响

细胞和样品加入方法同试验例5。细胞培养48h后吸取细胞培养上清(50μl)加入96孔培养板中，再并加入等体积的no检测试剂，反应10min后用酶标仪检测od540nm。以nano2溶液作为标准品来绘制标准曲线，计算出样品孔所对应的no含量。根据elisa试剂盒测定il-6和tnf-α。

灰树花小肽铁螯合物对小鼠巨噬细胞生成no、il-6和tnf-α的影响的结果如图12-14所示，灰树花蛋白肽及其铁螯合物能够显著增加巨噬细胞分泌no的含量，也能在一定程度上增强il-6和tnf-α细胞因子的释放。因此，灰树花蛋白肽和灰树花蛋白肽铁螯合物均具有良好的免疫增强活性。

通过上述试验对灰树花蛋白肽及其铁螯合物的免疫活性研究表明，cgfp、gfp-2、cgfp-fe、gfp-fe对小鼠脾细胞和巨噬细胞的增殖具有显著的增强作用，说明在调节免疫应答过程中对特异性免疫和非特异性免疫过程均有促进。相比较而言，灰树花蛋白肽铁螯合物的促进作用更强。同时，灰树花蛋白肽及其铁螯合物能够显著增加巨噬细胞分泌no的含量，也能在一定程度上增强il-6和tnf-α细胞因子的释放。因此，灰树花蛋白肽和灰树花蛋白肽铁螯合物均具有良好的免疫增强活性。