一种游离DNA提取试剂盒的制作方法

本实用新型属于医学免疫领域，尤其涉及一种游离DNA提取试剂盒。

背景技术：

DNA是遗传信息的载体，是主要的分子生物学研究对象之一，随着分子生物学研究的不断深入及基因测序技术的快速发展，基因测序所需的时间及成本快速下降，在基因水平上对疾病进行诊断已经成为临床诊断的一项基本技术手段，基于基因测序的精准医疗正逐渐成为重大疾病诊断、个性化医疗、胎儿遗传病学分析以及个体识别等领域的重要方式。

正常细胞、肿瘤细胞或胎儿组织细胞分裂后，细胞中的DNA会释放到人体体液中，游离在细胞之外，其中进入到血液的这部分DNA统称为血液游离DNA，也称作血浆游离 DNA，即cell free DNA，简称cfDNA。cfDNA片段长度主要集中在100～240bp之间，大部分在160～200bp之间。游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA一蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。健康人外周血也存在cfDNA，但肿瘤患者的外周血cfDNA含量与健康人外周血cfDNA相比较有显著性的增高，且肿瘤患者外周血DNA中存在基因突变、重组、缺失等。肿瘤患者外周血游离DNA主要为肿瘤细胞的坏死或凋亡、微转移灶或循环肿瘤细胞的裂解和增殖旺盛的肿瘤细胞所释放。

肿瘤基因检测最直接的对象是患者原代组织标本，但对于那些未进行过手术的肿瘤患者，肿瘤标本不易获取，而活检穿刺的技术虽已较为成熟，但患者接受度相对较低，尤其对那些已发生多处转移的患者。即便之前留有标本，但往往是几个月前甚至是几年前保存的局部标本，鉴于肿瘤基因组的动态性与异质性，它们反映的信息已经是过时的或者代表的信息不全。临床研究表明，cfDNA能良好地反映患者整体的肿瘤负荷、恶性程度、转移能力以及实时的基因突变信息，与肿瘤组织的基因信息具有较好的一致性。血浆cfDNA提取的质量是对DNA突变检测的保障，目前提取cfDNA的方法主要有酚氯仿异戊醇法，柱提法，磁珠法。传统的酚氯仿异戊醇法对血浆cfDNA的提取是将血浆中所有DNA提取出来，不能将血浆中大小片段分离，提取效率低，需借助其他手段提高其效率。柱提法提取效率高，但也不能将不同大小的DNA片段分离开。磁珠法是利用纳米级磁珠微珠表面的功能团吸附核酸，利用磁珠与溶液的体积比来对不同大小 DNA进行分选，既可得到较高的回收率，又可以对cfDNA进行分选。研究提示肿瘤患者外周游离DNA片段较正常人游离DNA小，结肠癌患者血浆中80％以上的游离DNA 片段均小于145bp，这提示肿瘤细胞释放的游离DNA可能小片段比例较大，因此将肿瘤患者外周游离DNA大小片段分离，对进一步基于外周循环肿瘤细胞细胞DNA监测肿瘤基因信息具有重要意义。

技术实现要素：

本实用新型针对现有技术的不足，提供了一种游离DNA提取试剂盒，包括：盒体、盒盖、试管座、控制器、固定架、温度传感器、取物盖、振荡装置、加热装置、凸起、活动板、顶块、滑轨、支撑单元。

所述的盒体的上端面设置有盒盖，并且所述的盒盖上设置有与试管位置相对应的取物口，且取物口内旋接有取物盖。所述的盒体内设有固定架，所述的固定架上开设有四个上下通透的空腔，每个空腔的内壁上设有四条竖直布置的凸起；每一个空腔里设有用于放置试管的试管座，所述的试管座上设有若干用于放置试管的盲孔；并且所述的试管座侧边设置有振荡装置，其中所述的振荡装置与控制器电性连接。所述的试管座底部设置有加热装置，其中所述的加热装置与控制器电性连接，所述的盒体内还设置有温度传感器。所述的盒体内位于固定架的下方设有活动板，所述的活动板的上端面设有两个能够将试管座顶起的顶块。所述的活动板的宽度与盒体的宽度相等，活动板的长度大于盒体的长度，所述的盒体位于固定架下方对应活动板长边的内侧壁上对称设有两条滑轨。此外，所述的试管座的底部还设有支撑单元。盲孔里的试管分别放置有磁珠预处理液、细胞裂解结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液。

所述的试管座的侧壁上成型有与凸起配合的凹槽。

所述的加热装置为加热管。

所述的温度传感器的信号端与控制器连接。

所述的其活动板为长方体。

所述的顶块的高度小于活动板与加热装置底部的距离。

有益效果:

本实用新型一种游离DNA提取试剂盒，利用调节活动板的位置，实现试管座在盒体的空腔里上下滑动，可以将试管座连同试管直接送出固定层的空腔内，便于操作人员取用试管，操作简单。设置有加热装置和振荡装置，分别控制温度和振荡频率，保证了试剂盒的高效性。此外，试剂成分简单，协同作用强，稳定性好，产物纯度高，适用于血清或血浆等无细胞体液中快速分离DNA。

附图说明：

图1是本实用新型一种游离DNA提取试剂盒的立体结构示意图；

图2是本实用新型盒盖的结构示意图；

图3是本实用新型一种游离DNA提取试剂盒的结构示意图；

图4是本实用新型游离DNA提取的流程图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例，对本实用新型的技术方案做进一步的详细描述。

如图1至图4所示为所述的一种游离DNA提取试剂盒，包括：盒体1、盒盖2、试管座3、控制器4、固定架6、温度传感器7、取物盖8、振荡装置9、加热装置10、凸起11、活动板16、顶块17、滑轨18、支撑单元19。

所述的盒体1的上端面设置有盒盖2，并且所述的盒盖2上设置有与试管位置相对应的取物口，且取物口内旋接有取物盖8。所述的盒体1内设有固定架6，所述的固定架6上开设有四个上下通透的空腔，每个空腔的内壁上设有四条竖直布置的凸起11；每一个空腔里设有用于放置试管的试管座3，所述的试管座3的侧壁上成型有与凸起11 配合的凹槽，所述的试管座3上设有若干用于放置试管的盲孔；并且所述的试管座3侧边设置有振荡装置9，其中所述的振荡装置9与控制器4电性连接，通过控制器4控制振荡装置9。所述的试管座3底部设置有加热装置10，其中所述的加热装置10与控制器4电性连接，所述的盒体1内还设置有温度传感器7，并且在所述的温度传感器7的信号端与控制器4连接。通过控制器4控制所述的热装置10的温度，并且通过温度传感器7将检测的温度通过信号传输回控制器4。所述的盒体1内位于固定架3的下方设有活动板16，其中所述的活动板16为长方体，所述的活动板16的上端面设有两个能够将试管座3顶起的顶块17。所述的顶块17的高度小于活动板16与加热装置10底部的距离，所述的活动板16的宽度与盒体1的宽度相等，活动板16的长度大于盒体1的长度，所述的盒体1位于固定架6下方对应活动板16长边的内侧壁上对称设有两条滑轨18，所述的活动板16可以沿滑轨18滑动。此外，所述的试管座3的底部还设有支撑单元19。盲孔里的试管分别放置有磁珠预处理液、细胞裂解结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液。

所述的磁珠预处理液包括：500ppm的非极性氨基酸和1000ppm的低聚果糖，其中非极性氨基酸由亮氨酸和缬氨酸按1：0.5的重量比组成。

所述的细胞裂解结合液主要包括：异硫氰酸胍、柠檬酸钠、去垢剂、异丙醇。其中去垢剂为Triton 100。在高盐条件以及合适浓度异丙醇条件下，血浆中的游离DNA可以高效地与磁珠结合，同时去除部分蛋白、多糖、血脂等血浆中含有的杂质；所述的细胞裂解结合液中异硫氰酸胍、柠檬酸钠、Triton 100、异丙醇的含量分别为50％(W/V)、2-3％(W/V)、10％(W/V)、2％(W/V)。

所述的洗涤液Ⅰ主要包括：Licl、乙醇，其中所述的洗涤液中Licl和乙醇的含量为5mol/L、40％(W/V)。

所述的洗涤液Ⅱ包括：75％的乙醇；

所述的洗脱液包括：15mmol/LTris-Hcl和1mmol/L EDTA，pH为8.0；

实施列游离DNA提取方法

步骤一：将所述基化磁珠通过所述磁珠预处理液进行处理，处理时间为5min，备用；

步骤二：取离心管，加入新鲜分离的血浆或血清，加入细胞裂解结合液，上下颠倒混匀，加入上述经预处理后的羧基化磁珠，涡旋混匀，65℃水浴5min；

步骤三：待冷却至室温，放置10分钟。

步骤四：进行磁珠分离，移去上清，保留磁珠

步骤五：往离心管中加入洗涤液Ⅰ，涡旋混匀，离心，弃去上清；

步骤六：往离心管中加入洗涤液Ⅱ，涡旋混匀，离心，弃去上清；

步骤七：开盖，室温干燥10min；

步骤八：加入洗脱液，涡旋混匀，进行加热洗脱，使磁珠分散与溶液中，室温静置 5min；瞬时离心，吸取上清液体，-20℃或-80℃保存，此液体即为提取的血浆或血清游离DNA。

综上所述，本实用新型的内容并不局限在上述的实施例中，本领域的技术人员可以在本发明的技术指导思想之内提出其他的实施例，但这些实施例都包括在本发明的范围之内。