借助于含有硫酸化或磺化组分的水凝胶，用于区分螯合不同物质组的物质的方法和材料与流程

本发明的应用领域是生物技术和医学领域，其中某些物质在分子水平上选择性地从生物流体中除去并螯合在水凝胶中，而另一方面，其他物质没有被特异性螯合但是选择性地从水凝胶释放到生物流体中。因此，在更广泛的意义上，它是一种分子水平的分离过程。在更广泛的意义上，本发明的应用领域在于分级带负电的水凝胶在技术、生物医学和生物学应用中的用途，例如用于哺乳动物细胞的培养或表面的抗菌整理。具有硫酸化组分的水凝胶，例如星-peg-葡萄糖胺环水凝胶(来自wo2010/060485a1)在领域中是已知的，并且正在研究用于生物技术应用或作为用于再生疗法的植入物或组织替代材料。这些材料的关键特征在于水凝胶组分的聚合物链上的硫酸根基团与可溶性蛋白质之间的相互作用，例如控制代谢、转运和信号传导功能的蛋白质，例如酶和信号分子，其中前者包括例如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，后者包括例如激素、神经递质、细胞因子、生长因子和趋化因子。对这些蛋白质的亲和力至关重要的相互作用主要基于在施用条件下带负电荷的水凝胶的硫酸根或磺酸基团和带正电荷的蛋白质的氨基酸侧链之间的静电力。该原理已经在本领域广泛用于开发含有硫酸化糖(糖胺聚糖＝gag)的水凝胶中，用于持续释放信号分子，例如生长因子vegf(血管内皮生长因子)和fgf-2(成纤维细胞生长因子2)。此外，通过降低下面的星-peg-gag水凝胶中的硫酸化程度，可以逐渐增加fgf-2和vegf的释放。含有磺酸基团的合成聚合物，例如聚苯乙烯磺酸(pss)，j.phys.chem.b[物理化学期刊b],2007,111(13),第3391-3397页,doi:10.1021/jp067707d9.，或2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(美国专利号5,451,617和5,011,275以及美国专利申请号2008/011412)作为磺化组分来产生水凝胶，例如用于隐形眼镜。然而，目前还没有已知的带有磺酸基团的共价交联的含水聚合物网络，即水凝胶，其中聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)的羧基已被用作与含氨基的短交联剂或含氨基的聚合物交联。另一个缺点是经迄今为止的研究，含有硫酸化或磺化组分(或结构单元)的水凝胶和蛋白质之间的相互作用主要仅来自具有一种至两种信号分子的溶液，并且通常不在生理学相关条件下。然而，在相关的生物学上下文中，具有多种不同蛋白质的生物流体以不同浓度存在，其中信号分子仅在100pg/ml-2000ng/ml范围内以低水平存在于生物流体中，而其他蛋白质如白蛋白以约60mg/ml的高浓度存在。这里，信号分子的带正电荷的区域与水凝胶中带负电荷的硫酸根或磺酸根基团之间的主要静电吸引力起重要作用，其中蛋白质的等电点(iep)通常可用于估计这些主要静电吸引力。然而，除了可以基于iep估计的生理条件下的净电荷之外，电荷的分布，例如带正电荷的电荷簇的存在，以及受蛋白质大小和蛋白质结构和受较弱的非离子分子间力(例如疏水相互作用、氢键或偶极相互作用)形成影响的次级相互作用发挥作用，因此迄今为止还不可能预测蛋白质和水凝胶绝对或相对结合。此外，还有另外的竞争过程经常被忽视，例如由于目标蛋白与白蛋白的相互作用(其负责控制渗透压和运输过程的调节)以及白蛋白与水凝胶之间的相互作用。此外，文献中用于预测带电聚合物和蛋白质之间分子相互作用的结合常数仅适用于描述溶液中各个分子-蛋白质复合物的相互作用，而在水凝胶中聚合物网络中的相邻的聚合物链和电荷或亲和中心的三维分布对所产生的相互作用具有强烈影响，因此对水凝胶中蛋白质的结合具有强烈影响。因此，迄今为止还没有阐明含有硫酸化和/或磺化组分(结构单元)的水凝胶与复杂生物流体的分子组分之间的结合选择性。因此，所建立的方法和过程仅能够在有限程度上通过含有应用相关生物流体中的硫酸化或磺化组分(结构单元)的水凝胶选择性地控制信号分子的水平。本发明的目的是提出一种允许有意地影响生物流体中某些物质浓度的方法。该目的通过具有根据独立权利要求的特征的方法和材料来实现。作为适于进行该方法的材料，使用基于聚(4-苯乙烯磺酸共-马来酸)的全合成水凝胶体系作为合成组分，其在生理条件下带负电，因此其对于不同物质群的物质的区分螯合中对于部分带正电的生物分子具有亲和力。在从属权利要求中叙述了该方法和材料的进一步发展。术语“完全合成”是指水凝胶化不需要生物来源的组分。因此，可以排除不良免疫原性反应的风险。在本发明的上下文中，从物质组a和b的物质的螯合是指这些物质(例如信号分子、因子或酶)与水凝胶材料中的亲和中心的结合，从而降低浓度或从与水凝胶直接接触的生物流体中完全去除这些物质。水凝胶由带电或不带电的结构单元组成。作为含有硫酸根和/或磺酸根基团的水凝胶，本发明包括具有下列性质和以下组成的水凝胶：通过共价(化学)交联或物理交联(例如根据wo2014040591a2)在两个水凝胶组分或水凝胶结构单元之间形成聚合物网络。水凝胶的第一结构单元或组分是在生理条件下不带电荷的分子，也称为不带电的结构单元(ugb)，并且优选具有20g/摩尔至100,000g/摩尔的摩尔质量。不带电荷的分子有利地选自或衍生自以下类别：聚乙二醇、聚(2-噁唑啉)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)和/或聚丙烯酰胺(pam)或短双官能性交联剂分子。此外，ugb具有至少两个官能团，优选4至8个特别有利于交联的官能团。用于交联的合适官能团(在gb或ugb下)可包括胺、巯基、羧基、酸酐、马来酰亚胺、乙烯基砜、丙烯酸酯、羟基、异氰酸酯、环氧化物和醛基，或基于静电力、疏水性相互作用、氢键、偶极相互作用能够形成非共价键的基团。第二结构单元(组分)由具有(硫)硫酸根或磺酸根基团的聚合物组成，因此在生理条件下(带电的结构单元，gb)(任选地具有2,000至250,000g/摩尔的摩尔质量)带负电荷，能够水凝胶网络中主要经由静电(离子)相互作用结合蛋白质，并且在较小程度上经由较弱的键如范德华力、氢键或疏水相互作用结合蛋白质。根据本发明，显著决定蛋白质结合的亲和中心是在生理条件下大部分带负电的硫酸根或磺酸基团。硫酸化或磺化聚合物是从天然来源获得的硫酸化糖胺聚糖，例如肝素和选择性脱硫肝素、硫酸软骨素、硫酸肝素、硫酸角质素、硫酸化透明质酸、以及基于甘露糖、乳糖、葡聚糖和聚磺化化合物的硫酸化乙二醇聚合物，其可具有含硫单体，例如，苯乙烯磺酸(ss)、乙烯基磺酸(vs)、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(amps)、氨基丙磺酸(aps)或茴香脑磺酸(as)(也在带有含有上述交联基团的单元的聚合物中)。亲和中心(带负电荷的硫酸根或磺酸根基团)仅故意沿gb分布，而ugb是使蛋白质吸附最小化的组分。gb上存在的任何不用于交联反应的羧基被认为与蛋白质在水凝胶中的结合无关，因为gb的酸性明显更强，因此优选去质子化的gb的硫酸根或磺酸根基团。生理条件是水溶液，其在组织中具有与人体组织的生理盐度精确对应的ph值和离子强度，因此用磷酸盐缓冲液调节至ph7.4和约0.9％nacl。根据本发明的生物流体是具有可变盐含量(优选生理盐度)的水溶液和蛋白质的混合物。蛋白质含量可以变化，主要由水溶性球状蛋白质(例如信号分子、酶或因子，以100pg/ml-2000ng/ml范围内的低水平存在)和调节体内渗透压和运输过程的白蛋白(例如，以约60mg/ml的高浓度存在)组成。根据本发明的概念，控制代谢、转运和信号功能(例如信号分子和酶)与含有水凝胶的硫酸化或磺化组分(gb)的结合的蛋白质的差异显著，这是一方面通过gb和蛋白质之间的静电相互作用，以及蛋白质的大小和结构(例如，特征蛋白质结构域的存在)，和另一方面通过水凝胶的网络参数确定的。在确定网络参数时测量：(1)在生理条件下溶胀的水凝胶中溶胀的水凝胶(毫摩尔硫酸根或磺酸根/ml)中的硫酸根或磺酸根浓度；以及(2)gb的每个重复单元的硫酸根或磺酸根基团数量除以gb的重复单元的摩尔质量(基团数量/(克/摩尔))作为gb的电荷的特征尺寸。参数(1)与三维溶胀的水凝胶网络中的相互作用中心数量(对应于带负电荷的硫酸根或磺酸根基团)相关，因此将显著地确定蛋白质(信号分子、酶)在水凝胶中的结合。该参数包括gb与蛋白质(信号分子、酶)的分子间相互作用(即相邻聚合物链的相互作用)。另一方面，参数(2)描述了沿不同gb的相互作用中心(对应于带负电荷的硫酸根或磺酸根基团)的密度和分布，因此将确定蛋白质与各个gb的相互作用，因此还包括经由聚合物链的电荷中心的空间调节的特定相互作用，其是已知的，例如蛋白质-糖胺聚糖相互作用(参见capila、i.linhardt、rjangewchemintedengl[应用化学英文国际版]2002,41(3),391-412)。根据本发明，水凝胶对蛋白质(信号分子)的结合和释放行为通过叠加由参数(1)和(2)得到的所得水凝胶网络性质来确定，因此可以通过指定这些参数来定量描述(还参见示例性实施例ugb1-gb101至ugb1-gb404的结果)。此外，必须考虑空间效应，因为对于蛋白质的结合和螯合，必须保证水凝胶网络的空间可接近性，即蛋白质的大小不得超过水凝胶的网目大小，例如，相对于材料和方法通过橡胶弹性理论的方式从水凝胶的储能模量估算。通过使生物流体与水凝胶接触，水凝胶可以在其网络结构和硫酸化或磺化程度上选择性地分级，生物流体中相关信号分子的浓度可以通过信号分子与水凝胶结合的特征选择性来调节，并因此可以在生物或生物技术应用中得到控制。生物学应用可以在医学上下文中涉及可溶性信号分子的调节，用于控制血管生成、血管芽生、免疫应答、尤其用于治疗神经变性和自身免疫和癌症疾病、糖尿病、皮肤伤口愈合和骨再生，用于抑制肿瘤增殖以及用于身体内或身体上的抗菌和抗微生物治疗。生物技术应用包括胚胎干细胞(es)、诱导多能干细胞(ips)和其他非es和ips相关干细胞和祖细胞，原代、源自患者的细胞、永生化细胞系，以及心脏、肌肉、肾、肝和神经组织的体外细胞和器官培养，以及富集或消耗，从而分离蛋白质混合物，特别是信号分子混合物或酶混合物。如已经提到的，本发明的另一方面涉及用于实施上述方法的共价交联的水凝胶材料，其基于聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)形式的带电的结构单元和含有具有至少两个氨基基团或巯基基团的聚合物或交联剂分子的氨基或巯基基团形式的不带电荷的结构单元。带电和不带电的结构单元交联形成聚合物网络，该网络可通过用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(edc)/n-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-nhs)活化聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)的羧基而获得，并且与含有氨基的聚合物或具有至少两个氨基的交联剂分子直接交联，每个氨基具有酰胺形成或通过双官能性交联剂分子官能化活化的羧基基团，各自具有氨基和能够迈克尔型加成(michael-typeaddition)的基团，随后通过各自的迈克尔型加成与含有巯基基团的聚合物或具有至少两个巯基基团的交联剂分子交联。能够进行迈克尔型加成的基团优选地选自马来酰亚胺、乙烯基砜和丙烯酸酯基团。含有氨基或巯基基团作为不带电荷的结构单元的聚合物优选地选自以下类别：聚乙二醇(peg)、聚(2-噁唑啉)(pox)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)和/或聚丙烯酰胺(pam)。可替代使用的含有短交联剂分子的氨基或巯基基团优选是非聚合双官能性交联剂分子。有利地选择聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)作为带电荷的结构单元，其中4-苯乙烯磺酸与马来酸的可变摩尔比为6:1-1:6，摩尔质量范围为5,000至100,000克/摩尔。根据本发明特别优选的实施例，具有用于聚合物网络形成的可酶促切割的肽的聚合物用作不带电的结构单元。这些可酶促切割的肽优选具有赖氨酸(侧链中具有氨基基团)或半胱氨酸(侧链中具有巯基基团)作为肽序列中反应性氨基酸。可酶促切割的肽是有利地借助于人或细菌蛋白酶可切割的，特别是(mmp)-反应性基质金属蛋白酶(例如pqgiwgq、ipvslrsg或vpmsmrgg)、组织蛋白酶反应性(例如vpmsmrgg)、弹性蛋白酶反应性(例如aapv或apeeimdrq)、凝血酶反应性(例如凝血酶反应性ggf-哌啶酸ryswgcg或gg-环己胺arswgcg)、fxa反应性(例如ggiegrmggwcg)、激肽释放酶反应性(例如cgggpfriggwcg)或细菌蛋白酶反应性(例如溶金菌素(aureolysin)反应性advfea或aaeaa)、弹性蛋白酶反应性aapv或蛋白酶iv反应性序列mkatklvlgavilgstllag。以这种方式构建的水凝胶允许自动调节释放和降解机制。根据本发明的另一个实施例，具有氨基或羧基的生物活性分子和/或抗粘附分子和/或细胞工程肽，特别是选自kcwg-rgdsp、kcwg-eidgielt、kcwg-iklli、kgcwggrniaeiikdi、kgcwggsdpgyigsrsddsa、kgcwggpqvtrgdvftmp、kgcwggkggngeprgdtyray经由序列中的赖氨酸或半胱氨酸附接至带电的结构单元聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)或其与能够迈克尔型加成的基团的衍生物通过形成共价键附接至水凝胶网络。生物活性分子可以是抗微生物物质，例如抗生素或抗菌剂、或药剂。抗粘附分子优选为聚乙二醇(peg)或聚(2-噁唑啉)(pox)。细胞工程肽优选是衍生自细胞外基质的结构蛋白和功能蛋白的肽，例如衍生自胶原蛋白、层粘连蛋白、腱生蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白的肽。根据有利的实施例，生物活性肽和/或抗粘附肽和/或细胞工程肽经由可酶促切割的肽序列与水凝胶网络共价偶联。如已经提到的，可酶促切割的肽优选对人或细菌蛋白酶敏感，例如mmp、组织蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶。即使在保留水凝胶网络的情况下，这种类型的水凝胶也允许自动调节释放和降解机制。优选地，水凝胶材料具有0.2至22kpa的储能模量。溶胀网络中的磺酸根浓度和每个重复单元(we)的磺酸根基团数量除以重复单元的摩尔质量(mw)(g/mol)可以根据表5.1(见下文)中定义的范围彼此独立地变化。因此，本发明提供了一种完全合成的、高度水合的水凝胶，其带有用于将被分离的物质组的亲和中心，该分离经由聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)的磺酸根基团作为带电的结构单元(gb)，其具有故意可分级的物理和生化性质。聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)在此用作前述水凝胶材料意义上的带电的结构单元(gb)。该材料提供了以模块方式(即在很大程度上彼此独立)绘制天然细胞外基质(ecm)的所有重要功能的可能性。具体而言，这些功能是生长细胞的框架、支持和保护功能(作为第一功能)、细胞粘附的控制(作为第二功能)、治疗相关信号分子的分级螯合和可逆释放(作为第三功能)、以及通过向内生长细胞进行按需重组可能性(作为第四功能)。物理性质，例如材料的刚度和水合作用，可在很宽的范围内调节。根据本发明的优选实施例，为了该目的通过如下制备共价交联的水凝胶：使活化的聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)的羧基基团与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(edc)/n-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-nhs)反应并且经由稳定的酰胺基团直链或星形支化聚乙二醇的末端氨基基团作为不带电荷的结构单元。在嵌入活细胞时优选的一个可替代的实施例中，在第一步中，将用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(edc)/n-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-nhs)活化的羧基聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)通过短双官能性交联剂分子n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺的方式分级，即每分子聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)用6至10分子的n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺官能化，然后纯化和分离。然后，聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)的这些衍生物与n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺在水溶液或复杂的生物流体中与活细胞和生物分子混合时允许自发的生物正交反应，这些生物分子经由迈克尔型加成无官能性变化，该加成在官能化的聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)衍生物的马来酰亚胺基团与含巯基基团的双官能性交联剂分子或含有巯基基团的聚合物的巯基之间，作为在前述水凝胶结构含义内的结构单元。例如，这些结构单元可以是酶促可切割的肽，其序列中具有氨基酸半胱氨酸(在侧链中具有巯基基团)并且其先前已与四臂聚乙二醇(peg)的一个或多个臂缀合，如tsurkan等人,2013(adv.mater.[新材料]2013,25,2606-2610)中所述。这种类型的交联具有以下优点：由于马来酰亚胺与游离巯基基团的快速反应，发生定向反应而没有与其他生物分子或细胞表面的蛋白质的不希望的副反应，因此迈克尔型加成可以是用作聚合细胞的生物正交交联反应。水凝胶还可以经由聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)衍生物的马来酰亚胺基团，通过细胞工程肽(例如氨基酸序列cwgrgdsp)的方式官能化。另外，水凝胶材料可以用抗微生物物质(例如，用带正电荷的抗生素)官能化。作为共价交联的水凝胶材料的替代物，可以应用物理交联的水凝胶材料来实施上述方法。这种同样完全合成的材料基于聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)形式的带电的结构单元与聚合物形式的不带电的结构单元之间的物理相互作用，其中高度带正电的肽序列缀合在聚合物。高度带正电荷的肽序列优选包含至少10个重复的赖氨酸或精氨酸或至少5个重复的带有赖氨酸和丙氨酸或带有精氨酸和丙氨酸的二肽基序。从示例性实施例的以下描述中，本发明的实施例的进一步细节、特征和优点将变得显而易见，示例性实施例也由所描绘的表格和附图描述和支持。图1显示了24小时后在水凝胶上培养的人内皮细胞的细胞培养物的代表性光学显微图像。其他有利的浓度比也可以通过有意地改变网络特性来设定，并且所提出的方法还使得可以通过将分析扩展到另外的信号分子来控制任何生物流体中的这些物质的浓度。表1：实施例01至26的水凝胶的化学和物理描述：交联反应1(vn1)：活化的羧基基团与氨基基团，交联反应2(vn2)：马来酰亚胺基团与巯基基团表2：聚合物水凝胶结构单元(组分)的化学-物理性质；mwp：聚合物的摩尔质量，mwwe：重复单元的摩尔质量：表3：信号分子的化学-物理性质，ugb1-gb101、ugb1-gb202、ugb1-gb523、ugb1-gb303、ugb1-gb404、ugb2-gb420和不带电荷的水凝胶ugb2-ugb326(作为阴性对照)型水凝胶中蛋白质的结合或螯合表4：gb1至5的羧基活化时间以分钟表示，凝胶体积用于结合研究表5.1凝胶类型及参数范围abcd1型0.0040-0.00600.09-0.20＜20不带电荷的2型0.0025-0.00400.05-0.18＜20不带电荷的3型0.0005-0.00250.01-0.12＜20不带电荷的4型0.0040-0.01000.16-0.80＜20不带电荷的5型00＜20不带电荷的表5.2优选实施例的凝胶类型abcd1型(ugb1-gb101)0.00500.12＜20不带电荷的2型(ugb1-gb202)0.00350.12＜20不带电荷的2型(ugb2-gb523)0.00380.14＜20不带电荷的3型(ugb1-gb303)0.00190.06＜20不带电荷的4型(ugb1-gb404)0.00450.28＜20不带电荷的4型(ugb2-gb420)0.00450.16＜20不带电荷的5型(ugb2-ugb326)00＜20不带电荷的表6.1表6.2.efgcd1型(ugb1-gb101)70.20.00180.12＜20不带电荷的2型(ugb1-gb202)48.40.00250.12＜20不带电荷的2型(ugb2-gb523)75.00.00180.14＜20不带电荷的3型(ugb1-gb303)23.40.00270.06＜20不带电荷的4型(ugb1-gb404)90.00.00310.28＜20不带电荷的4型(ugb2-gb420)90.00.00180.16＜20不带电荷的5型(ugb2-ugb326)000＜20不带电荷的在表5.1、5.2、6.1和6.2中，每个重复单元(we)的硫酸根或磺酸根基团数量除以we的摩尔质量(mw)在a列中表示为带电单位的性质[摩尔/g]。作为溶胀的水凝胶的性质，硫酸根或磺酸根基团的浓度(毫摩尔/ml)在b列中给出，kpa的储能模量在c列中给出。d列列出了不带电的结构单元的属性。e列表示每摩尔聚合物的带电的结构单元的硫酸根或磺酸根基团的摩尔浓度(以摩尔/摩尔计)。f列显示水凝胶的性质，作为gb的浓度(以毫摩尔/ml表示)，g列显示硫酸根或磺酸根基团的浓度(以毫摩尔/ml表示)和c列作为储存模块。根据方法中列出的假设，20kpa的储能模量对应于约6nm的网眼尺寸，因此应当允许本文讨论的所有结构上类似的信号分子进入水凝胶的空间可接近性。表7表7列出了生物流体中相关浓度的物质组a和b的物质。现在将参考上面所示的表格中的示例性实施例(ab)来解释本发明。例如，已证明来自表1中的ugb1-gb101(ab1)的水凝胶特别有利于调节不同信号分子的浓度(参见表3)。该类趋化因子与三级结构具有高度的结构相似性，其通过二硫桥通过四个半胱氨酸相互作用而稳定(对应于prositeid：ps00471和ps00472)。此外，趋化因子的特征在于强净正电荷iep＞9或带正电荷的结构域，例如mip1-α和mip1-β且摩尔质量小于10kda(见表3)，并通过该水凝胶类型牢固地结合在水凝胶中且因此从相邻的生物流体中消耗(mip1-α和mip1-β的结合约60％，其他的趋化因子嗜酸性粒细胞趋化因子、gro-α、il-8、ip-10、mcp-1、调节活化正常t细胞表达和分泌因子和sdf-1α≥95％结合(表3)，而令人惊讶的是以下高度带正电的信号分子fgf-2(iep9.58)和tgfb1(iep8.59)与fgf家族(对应于prositeid：ps00247)和tgfb1家族(对应于prositeid：ps00250)的生长因子和结构相似的蛋白质的种类相关仅与31％和18％的非常弱结合，plgf(iep8.37)结合更少＜10％(表3)，信号分子与具有轻度基础iep的细胞因子类相关，例如il-10(iep7.65)，以及具有中性范围(ph5.5-7)的iep的信号分子，例如il1-β、il6和tnf-α以及如下家族中il-1-β蛋白的结构相似的蛋白质：家族(对应于prositeid：ps00253)、il-10蛋白家族(对应于prositeid：ps00520)、白介素-6/gm-csf/mgf家族(对应于prositeid：ps00254)和tnf-α蛋白家族(对应于prositeid：ps00251)仅与复合生物流体(tnf-α约38％的结合)弱结合≤30％(表3)，因此，生物流体中的浓度基本保持不变。此外，具有略微负净电荷egf(iep4.8)和小于10％的结合的生长因子几乎不结合。结果，对于细胞存活必需的信号传导因子，例如egf、fgf-2、tgfβ或plgf，不受通过上述水凝胶实现的螯合的影响。强碱性细胞因子ifn-γ(iep9.52)、il-4(iep9.25)、wnt和bmp拮抗剂骨硬化蛋白(9.57)和dkk1(8.72)以及il-4/il-13家族的结构相似蛋白质(对应于prositeid：ps00838)和骨硬化蛋白样家族(对应于interproid：ipr008835)和强碱性生长因子bngf(iep9.00)、pdgf(iep9.4)和vegf(iep9.2)和ngf家族结构相似的蛋白质(对应于prositeid：ps00248)和pdgf家族结构相似的蛋白质(对应于prositeid：ps00250)和il-12p40强烈结合，如预期的那样≥59.9％(表3)，并因此从生物流体中消耗。通过使生物流体与具有根据表5.1的1类的特定电荷和网络特征的水凝胶接触，选择性地选择具有与dkk1、bngf、pdgf-bb、vegf以及趋化因子结构相似的蛋白质的生长因子(例如，嗜酸性粒细胞趋化因子、gro-α、il-8、ip-10、mcp-1mip-1α、mip1β、调节活化正常t细胞表达和分泌因子、sdf1α)具有根据注释序列基序与ifn-γ、il4和骨硬化蛋白的蛋白质结构相似的细胞因子并且蛋白质家族可以从生物流体中消耗或其在生物流体中的浓度通过预带电荷水凝胶增加，同时有利地保持上述信号分子egf、fgf-2、tgfb1、plgf、il-10、il1β、il6和tnfα的浓度几乎不变。此外，根据uwefreudenberg等人，journalofcontrolledrelease[控释杂志],journalofcontrolledrelease:officialjournalofthecontrolledreleasesociety[控释杂志：控释学会官方期刊]220期部分a(2015年12月28日):79-88,doi:10.1016/j.jconrel.2015.10.028，这种水凝胶具有gb1与的酶凝血酶和抗凝血酶相互作用的相互作用。另一个特别有利的示例性实施例(ab2)在于水凝胶类型ugb1-gb202(参见表2)中，其具有与水凝胶类型ugb1:gb101(参见表3)几乎相同的结合或螯合模式，除了两种趋化因子mip-1α和mip-1β与骨硬化蛋白的结合较弱(每种约40％，表3)，il-10(15％)、il-6(8％)、tnfα(25％)的结合甚至更弱，参见表3，更有利的几乎不存在fgf-2(5％)和tgfb1(0％)的结合，以及gb2与凝血酶凝血酶和抗凝血酶的缺乏相互作用(参见uwefreudenberg等人，journalofcontrolledrelease[控释杂志],journalofcontrolledrelease:officialjournalofthecontrolledreleasesociety[控释杂志：控释学会官方期刊]220期部分a(2015年12月28日):79-88,doi:10.1016/j.jconrel.2015.10.028)。另一个有利的示例性实施例是ugb2-gb523(ab23，参见表1)，其具有的电荷特性可以像ab2一样根据表5.1分配给2型，但其具有略微不同的磺酸根含量(0.14毫摩尔/ml)(表1或表5.2，b栏)且每个重复单元(we)略微不同数量的磺酸根基团除以we的摩尔重量(mw)，以[摩尔/克]表示，0.0038，但表5.1中给出的2型水凝胶的范围两者参数。然而，水凝胶由另一种带电的合成凝胶结构单元(gb5)形成，具有不同的交联反应(交联类型2，表1)，并且具有与ab2几乎相同的结合或螯合模式(参见表3)，除了两种趋化因子mip-1α和mip-1β的结合稍强。这证实了根据表5.1的具有特征电荷模式的水凝胶的分类，并且还表示特别有利的螯合模式。另一个有利的示例性实施方案(ab3)由水凝胶类型ugb1-gb303(参见表2)表示，其由于水凝胶中硫酸根或磺酸根基团的浓度显著较低而与许多蛋白质(信号分子)的结合显著较弱(表5.2，b栏，0.06与ab1或ab2的0.12毫摩尔/ml相比)以及每个we的硫酸根或磺酸根基团数量较低除以we的摩尔质量0.0019与0.005或0.0035(对于ab1或ab2)相比较，与ab1和ab2相比较(见表5.2，a栏)。对于这种类型的水凝胶，bngf、pdgf-bb和vegfa、嗜酸性粒细胞趋化因子、gro-α、ip-10、调节活化正常t细胞表达和分泌因子、sdf-1α、ifn-γ和il-4被水凝胶结合超过50％，并因此从生物流体中消耗。相反，il-8、mcp-1和il-12p40仅被水凝胶结合约45％(参见表3)，hgf、mip-1α、mip-1β、il-1β、il-10、il-6、tnfα和dkk1仅微弱结合16％-36％(见表3)，fgf-2、tgfb1、egf、plgf、gm-csf和骨硬化蛋白几乎不结合(＜12％)(见表3)，因此大多数信号分子明显少于ab1和ab2。例如，使用这种类型的凝胶，从任意生物流体选择性的分离bngf、pdgf-bb和vegfa、嗜酸性粒细胞趋化因子、gro-α、ip-10、调节活化正常t细胞表达和分泌因子、sdf-1α、ifn-γ和il-4是可能的。另一个有利的实施例是水凝胶ugb1-gb404(参见表1)，其由于水凝胶中高浓度的硫酸根或磺酸根基团(0.28毫摩尔/ml)(表5.2，b栏)和同样大量的每个we的磺酸根基团除以we的摩尔质量(0.0045摩尔/g)，除了hgf、plgf、gm-gsf和egf，所有研究因素均以高效率(在72％-100％之间，参见表3)在水凝胶中结合在一起，并因此从生物流体中消耗(见表3)。特别是，使用这种水凝胶，发生相邻生物流体中所有被研究的和结构相似的因子(iep和结构相似性的存在)的消耗，特别是趋化因子的类别，其具有由三相结构的高结构相似性，其由四个半胱氨酸通过二硫桥(对应于prositeid：ps00471和ps00472)的相互作用得到，其特征是强净正电荷iep＞9或带正电荷的结构域，如在mip1α和mip1β中，分子量小于10kda(见表蛋白质性质)，fgf-2(iep9.58)、tgfb1(iep8.59)和结构相似的fgf家族蛋白(对应于prositeid：ps00247)、tgf家族(对应于prositeid：ps00250)和与具有轻微碱性iep的细胞因子相关信号分子类别，例如il-10(iep7.65)以及具有中性范围(ph5.5-7)的iep的信号分子，例如il1β、il6和tnf和il-1β蛋白家族的结构相似的蛋白质(对应于prositeid：ps00253)和il-10蛋白家族的结构相似的蛋白质(对应于prositeid：ps00520)。另一个有利的示例性实施例，ugb2-gb420(参见表1)，其具有可以根据表5.1的带电荷特性也与类型4相关联，如ab4，其具有相同的gb5，参见表5.1a列：0.0045，但是较低的磺酸根浓度0.16毫摩尔/ml(见表1和表5.1)仍然可归因于4型，但是由不同的交联反应(表1中的vn：2)形成，与ugb1-gb404具有几乎相同的结合或螯合模式(见表3)。因此，该结果还证实了根据表5.1的1-5型的电荷特性对于物质或物质组的区分螯合的有效预测能力。另一个示例性实施例是由ugb1和ugb3形成的不带电水凝胶(ugb2-ugb326)，如所预期的，其作为阴性对照几乎不结合来自生物流体的信号分子。除了pdgf-bb的轻微螯合率为19.7％±23.1％，ip10为16.1％±16.4％，由于标准偏差较大而无法归类为显著性，无螯合(所有测试信号分子≤1.3％，见表3)发生在这种水凝胶上。该结果可以清楚地归因于不存在带电亲和中心并因此不存在前述电荷相互作用。然而，4.4kpa的储能模量和网络网格尺寸(表1)几乎与ugb1-gb202、ugb2-gb420和ugb2-gb523的储能模量相同，即与带电示例性实施例信号分子的空间相互作用相当。这些结果，特别是不带电荷的水凝胶(ugb2-ugb326)与信号分子的缺乏相互作用(即不存在结合和螯合作用)，证实了根据表5.1的区分螯合的权利要求。同时，经由选择性地预先对表5中的1至3型水凝胶预带电荷并且独立于螯合之外并因此消耗其他因子，可以将各个因子释放到生物流体中。因此，对于各种类型的水凝胶，复杂生物流体中的几乎任何水平的单个信号分子都可以通过水凝胶的靶向预带电荷或信号分子的几乎定量的螯合(消耗)来调节(例如用于将信号分子与任何含有蛋白质的溶液分离的应用)。基于ugb1-gb101至ugb2-ugb326中的示例性实施例，对于本发明的描述重要的水凝胶网络中的蛋白质性质、水凝胶性质和蛋白质结合之间的以下关系是显而易见的：根据表3信号分子的强结合与蛋白质一侧净正电荷相关(此处有高、基本iep作为相应参数)以及分子量的倒数(高iep和小分子量增强结合，见表3，高度带正电和相对较小的趋化因子(＜9kda)最强烈地结合在水凝胶网络一侧，(1)水凝胶中高浓度的硫酸根或磺酸根基团(表1和5.2，b列)和(2)每个we的大量硫酸根或磺酸根基团除以we的摩尔质量增强信号分子的结合。与这些参数相符，从最强结合到最弱结合的水凝胶顺序结果如下：ugb1-gb404≈ugb2-gb420＜ugb1-gb101＜ugb1-gb202≈ugb2-gb523＜ugb1-gb303＜＜ugb2-ugb326。该结果由实验发现的结合值支持(参见表3)。此外，通过上述水凝胶网络参数(1)和(2)的不同组合，可以调节文献中称为“特定相互作用”的强相互作用-即蛋白质和带负电的聚电解质(例如葡萄糖-氨基聚糖)之间的不同相互作用中心的空间匹配，并且除了分子量和净电荷之外还可以在蛋白质侧使用其他结构性质来调节与水凝胶的结合。这些相关性还解释了强碱性和相对小的信号分子fgf-2、tgfb1和plgf与水凝胶类型ugb1-gb101、ugb1-gb2-02、ugb1-gb303和ugb1-gb404的低结合。控制可溶性信号分子水平的其他可能性基于不同水凝胶类型的顺序或组合使用，以精确调节各种特定的螯合和释放性质。通过靶向改变网络性质(特别是先前描述的参数(1)和(2)以及在所谓的多相水凝胶材料中组合不同组成的水凝胶微粒(例如，用各个信号分子预带电荷)(即通过混合不同类型的水凝胶类型或用信号分子或蛋白质预带电荷)，也可以在相邻的生物流体中设定其他有利的浓度比。通过将分析扩展到另外的信号分子，所提出的方法还允许控制这些物质在任何类型的生物流体中的浓度。为了能够有效地控制信号分子的复杂生物学功能，例如用于治疗概念，除了从预带电荷信号分子的水凝胶持续释放单一信号分子细胞外，还需要对来自细胞的直接生物环境或生物学应用的信号分子的活性管理。因此必须考虑与大量相关信号分子的相互作用。当含有硫酸化或磺化组分的水凝胶带有例如用于持续释放的信号分子时，来自生物环境的其他治疗上重要的分子可以同时被螯合并因此与治疗上期望的信号分子释放同时失活，从而代表不希望的副作用。然而，另一方面，还可以特异性地螯合并因此使治疗上不需要的信号分子失活到携带硫酸化或磺化基团的水凝胶中。总的来说，非常复杂的释放和螯合方案是可能的，其总体上决定了生物效应，特别是材料的分子分离性质。本发明的其他有利实施例包括使用根据表5的1-4型的水凝胶来调节低总水平的生物活性蛋白质的浓度或水平。该方法的一个重要优点在于其应用可能性的普遍性。该方法可有利地用于生物技术纯化和通过使用具有硫酸化或磺化组分的水凝胶从生物流体中或在生物流体中分离蛋白质混合物。在示例性的狭义意义上，用于因子管理的方法可以在体内用于控制血管生成、免疫疾病、糖尿病、神经变性疾病和伤口愈合。在伤口愈合中，大多数促炎作用趋化因子(例如嗜酸性粒细胞趋化因子、gro-α、il-8、ip-10、mcp-1、mcp-3、mcd、调节活化正常t细胞表达和分泌因子和sdf-1)被螯合在水凝胶内，而促再生因子(例如egf、fgf-2、tgfb1、il-10、hgf和plgf)将基本保持不受影响。本发明特别重要的应用领域是控制负责决定体外和体内细胞的命运的生物流体中物质的浓度。促炎作用趋化因子的失调和相关的慢性炎症是各种疾病如克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘或类风湿性关节炎的发展的原因。通过应用根据本发明的硫酸化或磺化组分的不同水凝胶从生物流体中靶向调节这些炎性因子的浓度代表了可能的应用场景。在更广泛的意义上，根据本发明的水凝胶与硫酸化或磺化组分的应用允许从复杂的蛋白质混合物中对这里研究的或结构相似的信号分子进行靶向纯化。因此，所描述的凝胶系统可以在生物技术上用于从微生物或真核来源的细胞裂解物中靶向纯化蛋白。在这种情况下，根据本发明的水凝胶促使这些细胞裂解物结合信号分子。在第二步中，可以再次从水凝胶中除去结合的物质，以通过用高浓度盐水溶液或带正电荷的聚电解质(例如壳聚糖)冲洗进一步使用，从而分离。此外，用于分离信号分子的阴性选择，其在这些条件下与1-3型结合实例的水凝胶弱结合。通过在结合24小时后使用上清液，egf、fgf-2、tgf-β、il-10、hgf和plgf是可能的。本发明的相关实际优点是即使在1mg/ml至45mg/ml的高白蛋白浓度下，也实现了多种生物相关信号分子与硫酸化或磺化水凝胶的结合，所述水凝胶具有靶向分级电荷特征和网络结构，同时在生理电解质中作为生物流体的低水平的信号分子从100pg/ml至2000ng/ml，并且因此可以使用各个信号分子与不同水凝胶类型的结合的选择性差异。表1中给出的ugb1-gb101至ugb1-gb4011的示例性实施方案是根据交联反应1的共价交联的水凝胶，其中gb4(聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)，苯乙烯磺酸:马来酸的摩尔比为3:1，表1)分子的6至24个羧基(取决于四臂星形peg中1.5至6的摩尔比)，用edc/磺基-nhs活化，并直接与四臂胺封端的ugb1反应以产生水凝胶(参见表1)，得到具有0.28至0.06毫摩尔/ml的可变磺酸根浓度的水凝胶和4.8至19.6kpa的可变储能模量(参见表1)。表1中给出的示例性实施例ugb1-gb512至ugb1-gb519是根据交联原理1的共价交联的水凝胶，其中聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)分子的6至24个羧基(取决于四官能性星形peg中1.5至6的摩尔比)，苯乙烯磺酸与马来酸的摩尔比为1:1(gb5)，用edc/snhs活化，并通过四臂胺封端的ugb1直接转化为水凝胶(参见表1)，得到具有0.13至0.05毫摩尔/ml的可变磺酸根浓度和3至21.8kpa的可变储能模量的水凝胶(参见表1)。示例性实施例ugb2-gb420至ugb2-gb422是根据交联原理2的共价交联的水凝胶，其中gb4(聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)，苯乙烯磺酸与马来酸的摩尔比为3:1)的8个羧基，用edc/磺基-nhs活化，在第一步中用短双官能性交联剂分子n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺官能化，然后纯化和分离。然后通过将生理盐水(或血清)与ugb-2(巯基封端的四臂peg)混合，将gb4的这些衍生物转化为水凝胶，得到具有0.16至0.05毫摩尔/ml的磺酸根基团浓度梯度的水凝胶，储能模量为3.7-0.2kpa。示例性实施例ugb2-gb523至ugb2-gb525是根据交联原理2(vn2，表1)的共价交联的水凝胶，其中gb5(聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)苯乙烯磺酸:马来酸的摩尔比1:1)的八个羧基与用edc/磺基-nhs活化的在第一步中通过短双官能性交联剂分子n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺官能化，随后纯化和分离。然后通过在生理盐水溶液(或血清)中与ugb-2(巯基封端的四臂peg)混合，将这些gb5衍生物转化为水凝胶，得到水凝胶，其中磺酸根基团的浓度为0.14至0.04毫摩尔/ml，储能模量为4.6-0.3kpa。示例性实施例ugb2-ugb326是不带电的peg水凝胶，其中根据交联原理2，巯基封端的四臂peg(ugb-2)与马来酰亚胺封端的四臂peg(ugb-3)反应。该水凝胶在螯合实验中用作不带电荷的阴性对照。令人惊奇的是，基于示例性实施例04-5，可以制备具有大范围有利性质和性质组合并且没有不利的免疫原性反应的全合成水凝胶。因此，溶胀的水凝胶中的磺酸根基团宽的浓度为0.04至0.28毫摩尔/ml并且具有0.2至21.8kpa的储能模量的同样大的变化，可以在很大程度上彼此独立地调节。例如，水凝胶ugb2-gb421、ugb1-gb514、ugb1-gb515和ugb1-gb408在溶胀的水凝胶中具有恒定浓度(0.08毫摩尔/ml)，但同时增加了储能模量(1.1、5.5、12.5和19.6kpa)，即磺酸根浓度和水凝胶的刚度可以在很宽的范围内彼此独立地调节。另外，选择磺酸根浓度为0.05的ugb1-gb519，磺酸根浓度为0.06的ugb1-gb411，磺酸根浓度为0.09的ugb1-gb410，储能模量几乎恒定为8.0-8.5kpa，磺酸根浓度可以独立于水凝胶的硬度而变化(参见表1)。此外，对于vn1，摩尔比ugb:gb的进一步变化范围在1.5和3之间以及在3和6之间，对于vn2，变化范围在0.5和0.75和1之间以及1.5和1.5和2之间，对于gb和ugb的浓度的进一步的变化，可以产生许多其他性质组合。令人惊讶的是，通过聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)的交联，从马来酸中一个紧密相邻的酸基团的edc/磺基nhs活化开始，这些酸基团的反应性受到不可预测的影响而不是仅通过相邻的羧基，特别是通过磺酸根基团和疏水性苯乙烯单元，可以合成具有不带电的结构单元的水凝胶材料，具有上述可广泛分级的性质。在这里，通过使用1分钟的令人惊讶的非常短的活化时间，即edc/磺基nhs添加至聚聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)的时间，实现了精确的网络形成(用于vn1)或衍生化(用于vn2)，参见表4，之后通过与随后活化的聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)和反应物的非常强烈的混合物混合使含氨基的分子反应。在另一个示例性实施例中，ugb1-gb101、ugb1-gb420、ugb1-gb523和ugb1-gb326型水凝胶用粘附肽cwrgdsp官能化并用vegf-a和fgf-2预带电荷，并用于培养人内皮细胞的无血清细胞培养基中的凝胶表面。在培养24小时后分析贴壁细胞的形态，如图1所示，ugb1-gb101、ugb2-gb420、ugb2-gb523和ugb2-ugb326。内皮细胞在不同的水凝胶上呈现不同的形态，可通过两个参数纵横比和圆形度来描述。高纵横比和低圆形度对应于所需的细长内皮细胞形态，这是形成生物学上所需管状结构的第一步。在ugb1-gb101、ugb2-gb420和ugb2-gb523上培养的内皮细胞的纵横比为3.4±1.0、4.1±1.1和4.9±1.6，而未带电的参考凝胶ugb2-ugb326具有显著较低的纵横比为2.1±1.2。对于水凝胶ugb1-gb101、ugb1-gb420和ugb1-gb523和ugb1-gb326上的内皮细胞，圆形度相应地为0.5±0.1、0.4±0.1、0.3±0.1和0.7±0.3。这些差异在统计上非常显著。因此，根据表5.1的内皮细胞在水凝胶上表现出显著不同的1型(ugb1-gb101)的、4型(ugb2-gb420)的、2型(ugb2-gb523)的和不带电的5型(ugb1-gb326)的不同电荷和螯合特性。在不带电的水凝胶上，细胞显示出不希望的短纵横比和高圆形度，而所需的形态以ugb1-gb101＜ugb1-gb420＜ugb2-gb523的顺序增加。2型水凝胶ugb2-gb523在该实验中显示出最佳结果。因此，该分级证实了电荷性质和螯合模式对人内皮细胞培养的直接影响。在另一个示例性实施方案中，类型1的水凝胶(ugb1-gb101)，类型4的水凝胶(ugb1-gb420)，类型2的水凝胶(ugb1-gb523)和不带电的类型5的水凝胶(ugb1-ugb326)用于人间叶细胞基质细胞的聚合。水凝胶具有细胞反应性，即，除了用粘附介导肽cwgrgdsp对水凝胶进行官能化之外，由这些细胞分泌的基质金属蛋白酶可酶促切割的可切割肽序列gcggpqgiwgqggcg在相应的不带电荷的结构单元上预先缀合并用于根据vn2的交联。通过测试在24小时后表征嵌入细胞的代谢活性作为活力的证据。在1型水凝胶中聚合的人间叶细胞基质细胞以相对荧光单位测量的代谢活性分别为7112±3924，2型为3704±2945，4型为3160±6023和不带电的5型为2316±446的代谢活性。因此，当嵌入2型凝胶中时，人间叶细胞基质细胞显示出最高的代谢活性，并且当嵌入不带电的参照凝胶的凝胶中时，其显示出最低的代谢活性。因此证明水凝胶，特别是2型水凝胶特别有利于在3d中培养活的人间叶细胞基质细胞。在另一个有利的示例性实施例中，ugb1-gb101、ugb2-gb420、ugb2-gb523和ugb2-ugb326通过带有带正电荷基团的抗生素庆大霉素的区分螯合而官能化。然后通过使用两种相关致病性细菌菌株大肠杆菌(e.coli)和表皮葡萄球菌(staph.epidermidis)从不同水凝胶中释放庆大霉素来测量抑制。通过抑制区的大小(与培养板上的水凝胶的距离，参见材料和方法)测量抗微生物活性。对于没有预先庆大霉素螯合的ugb1-gb101、ugb2-gb420、ugb2-gb523和ugb2-ugb326型水凝胶，没有检测到抑制区，即水凝胶不具有抗微生物作用。在通过水凝胶预先区分螯合庆大霉素的情况下，测量以下分级抑制区：ugb1-gb101：3.08±0.33mm，ugb2-gb420大肠杆菌：3.08±0.33mm，表皮葡萄球菌：2.94±0.35mm，ugb2-gb420：大肠杆菌：1.78±0.27mm，表皮葡萄球菌：1.76±0.45mm；ugb2-gb523大肠杆菌：2.18±0.38mm，表皮葡萄球菌：1,81±0.51mm，并且对于不带电的参考凝胶ugb2-ugb326大肠杆菌：0.48±0.36mm，表皮葡萄球菌：0.90±0.28mm。因此，如所预期的，对于不带电的参考凝胶ugb2-ugb326，仅非常少量的庆大霉素被非特异性螯合并随后再次释放。对于其他水凝胶，可以按照ugb2-gb420＜ugb2-gb523＜ugb1-gb101的顺序找到分级的抗微生物作用。该结果支持了带正电荷的药物分子的区分螯合的权利要求。此外，通过改变庆大霉素的硫化浓度也可以建立不同的抗微生物效果。材料与方法：肝素的区域选择性脱硫(由gb1的gb2和gb3产生)对于肝素(gb2和gb3)的区域选择性脱硫的合成，首先将肝素(mw14,000，默克密理博公司(merckmillipore)，制造商编号：375095，德国，gb1)溶解在去离子超纯水中并借助安伯来特(amberlite)ir-120h+离子交换柱(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)进行脱盐。通过向肝素溶液中添加吡啶(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)直至达到ph6，形成肝素-吡啶盐，其在b-490旋转蒸发器(büchi，德国)中通过溶剂蒸发富集，随后在-80℃(gealyovacgt2，德国)冻干，并储存在-20℃直至进一步加工。为了制备n-脱硫肝素(n-dsh，gb2)，将1g/l肝素-吡啶溶解在dmso和去离子超纯水(95:5)的混合物中，并在50℃下孵育1.5小时。将得到的溶液用去离子的超纯水1:1稀释，并用1m氢氧化钠溶液(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)调节至ph9。将溶液(仕必纯公司(spectrumlabs)，德国，mwco＝8kda)对去离子超纯水透析3天后，进行脱硫化肝素的n-乙酰化。为此，向溶液中添加10％v/v甲醇(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)和50mm碳酸钠(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)。乙酰化反应进行3小时，冷却至4℃，并且每隔半小时通过每1mg肝素添加400μl乙酸酐(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)以400rpm持续搅拌，随后通过添加2m碳酸钠溶液将ph调节至7.5。为了制备6o-n-脱硫肝素(6on-dsh，gb3)，将1g/l肝素-吡啶溶解在dmso和去离子超纯水(95:5)的混合物中，并在90℃下孵育24小时。将得到的溶液用去离子超纯水1:1稀释，并用1m氢氧化钠溶液(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)调节至ph9。在透析管(仕必纯公司(spectrumlabs)，德国，mwco＝8kda)中对去离子超纯水透析三天后，通过溶剂蒸发b-490(büchi，德国)富集6o-n-脱硫肝素，然后冻干(莱宝(gealyovac)gt2，德国)。gb和ugb的表征(见表2)：gb1-gb3的分子量通过dawnheleosii(怀特欧洲技术公司(wyatttechnologyeurope)，德国)在690nm处的多角度光散射测定。用ri检测器(optilabt-rex，怀特公司(wyatt)，德国)在λ＝690nm的波长下测定分子量测定所需的dn/dc值。对于光散射实验的评估，需要gb1、gb2和gb3的ri增量，dn/dc为0.1351ml·g-1。用astra软件6.1版(怀特技术公司(wyatttechnology)，美国)进行用于确定摩尔质量的光散射结果的评估。肝素衍生物(gb1-gb3)的硫酸化程度通过元素分析(艾力蒙塔公司(elementar)，variomicrocube，德国)基于摩尔s:n比确定。因为每个二糖单元恰好含有一个n原子，所以gb1、gb2和gb3的硫酸化程度(硫酸根基团数量/重复单元)由s:n的摩尔比确定。此外，由此确定重复单元的摩尔质量。在此基础上计算每个重复单元或每摩尔聚合物的硫酸根基团数量。每个重复单元或每摩尔gb4和gb5聚合物(聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸))的分子量和磺酸根基团数量基于来自制造商(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，制造商编号：434566，德国)的信息。ugb1、ugb2、ugb3、氨基-、巯基-、或马来酰亚胺-末端的四臂peg的分子量和结构基于来自制造商(键凯科技公司(jenkemtechnology)，美国)的信息。根据tsurkan等人2013(adv.mater.[新材料]2013,25,2606-2610)描述的方法制备和使用ugb4(可酶促切割的肽封端的四臂peg)的摩尔质量和结构。基于肝素或肝素衍生物制备水凝胶(还见表1)：为了制备水凝胶，将基于gb1的肝素(gb1)(默克密理博公司(merckmillipore)，制造商编号：375095，德国)、脱硫化肝素衍生物通过先前描述的方法根据水凝胶类型(参见表2)作为带电组分(gb)溶解，参见区域选择性脱硫，gb2和gb3)在4℃下用去离子超纯水在500rpm下用涡旋混合器(ika，德国)进行30秒。此外，四臂胺封端的peg(mw10,000，键凯科技公司(jenkemtechnology)，美国)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc；西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)和n-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-nhs，西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)以与ugb1相同的方式溶解于所有类型的水凝胶。为了确保水凝胶结构单元的完全溶液，将这些溶液在4℃下用超声浴(rk100h，班德利公司(bandelin)，德国)另外处理5分钟。为了将gb1活化至gb3，添加edc和磺基-nhs(edc和磺基-nhs的比例为2:1)至溶解的gb(4摩尔磺基-nhs，每摩尔ugb1最终反应混合物8摩尔edc)中，并根据表4中列出的时间在4℃下孵育。在gb1、gb2、gb3的活化时间之后，另外添加溶解的氨基封端的4-臂peg(ugb1)并用涡旋混合器(ika，德国)以500rpm混合30秒。交联反应1后制备基于聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)的水凝胶(vn1，还见表1)：通过以下方法使用聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)(其中4-苯乙烯磺酸:马来酸的摩尔比为3:1(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，制造商编号：434566，德国，gb4，参见表2)，以及4-苯乙烯磺酸:马来酸的摩尔比为1:1(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，制造商编号：434558，德国，gb5，参见表2))和ugb1(四价peg，胺封端，mw10,000，键凯科技公司(jenkemtechnology)，美国)制备共价交联水凝胶：gb4或gb5和ugb1各自溶解在具有3倍浓度的去离子超纯水中的水凝胶混合物总体积的三分之一，如表1中所示，并在4℃下用超声波浴(rk100h，班德利公司(bandelin)，德国)另外处理5分钟。此后，将所有溶液在4℃下回火。对于另外的步骤：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc，西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)和n-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-nhs，西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)也溶解在总反应混合物的六分之一中并在4℃下回火。ugb1:edc:磺基nhs的摩尔比是1:8:4(ugb1的每个氨基是1:2:1)。在下一步骤中，将edc和磺基-nhs添加至gb4或gb5中并通过移液管混合，在30秒的等待时间后，将反应混合物在涡旋振荡器(vwr，德国)上混合10秒，然后再等待20秒。在该程序之后，总活化时间为1分钟，将涡旋振荡器上的ugb1移液至活化的gb4或gb5，然后与涡旋振荡器混合另外10秒。现在可以通过移液倾倒最终反应混合物(ugb1和gb4或gb5的浓度现在对应于表1中给出的浓度)至任意形式，通过聚合在经12小时内进行凝胶化。随后，在进一步使用或表征水凝胶之前，通过反复溶液交换数小时，使水凝胶在磷酸盐缓冲盐水溶液中完全溶胀。用人内皮细胞制备用于细胞培养的水凝胶：为了培养人内皮细胞，通过将11μl最终反应混合物/cm2吸移到玻璃盖玻片上，形成最终厚度为约100μm的表面结合凝胶。根据pompe等人biomacromolecules[生物大分子]2003,4,1072-1079的方法，预先用聚(乙烯-老-马来酸酐)薄膜涂覆玻璃盖玻片以确保水凝胶的共价键合。对于用rgd肽修饰，在edc/磺基-nhs的磷酸盐缓冲盐水溶液中溶胀的成型水凝胶在4℃下以50mmedc和25mm磺基-nhs的浓度溶解于1/15m磷酸盐缓冲盐水溶液中，并将gb4或gb5的剩余羧基活化20分钟，然后用硼酸盐缓冲液(100mm，ph8.0，4℃)冲洗。随后，使活化的水凝胶与溶解在硼酸盐缓冲液(100mm，ph8.0)中的浓度为50mg/ml的肽序列h2n-gwggrgdsp-conh2(肽国际公司(peptidesinternational)，路易斯维尔，肯塔基州，美国)的溶液在室温下反应2小时，然后用磷酸盐缓冲盐水过量洗涤。细胞培养：将人脐静脉内皮细胞(huvec，龙沙公司(lonza)，德国)在补充有promocellc-22010(promocellgmbh，德国)的promocellc-22010上在37℃和5％co2下在纤连蛋白包被的细胞培养瓶上传代直至达到80％融汇。第2至6代的细胞用于后续实验。将rgd官能化的表面结合水凝胶与vegf-a和fgf-2以0.565μg/cm2水凝胶表面的浓度在室温下孵育18小时，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤2次。在没有补充混合物的promocell培养基中在用rgd-和vegf-165和fgf-2官能化的水凝胶上培养的50,000个细胞/cm2。培养24小时后，洗涤，固定细胞并通过光学显微镜(olympusix73倒置显微镜，汉堡市，德国)表征。在用fiji图像处理软件测量单个细胞后，通过将细胞长度除以细胞宽度来确定纵横比。通过fiji图像处理软件根据以下公式确定圆形度：圆形度＝4*π*(细胞面积/周长)^2。在每种情况下，在n＝10个独立样品上每个图像测量20个细胞。使用graphpadprism软件和单因素方差分析(one-wayanova)测试进行的统计学评估显示所有研究条件的显著差异。交联反应2后制备基于聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)的水凝胶(vn2，还见表1)：聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)与马来酰亚胺基团的衍生化：为了根据交联反应2形成水凝胶，必须首先用n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(西格玛公司(sigma)，德国)官能化gb4或gb5。为此目的，将500mg(25μmole)相应的gb4或gb5溶解在2.7ml去离子超纯水中并在冰上搅拌10分钟。样品容器是25ml的按扣盖玻璃。随后，将65.14mg的nhs(0.30毫摩尔)溶解在400μl中，并将115.02mg(0.60毫摩尔)的edc溶解在200μl冰冷的去离子超纯水中，将两者添加到gb4或gb5溶液中并等待5分钟。在下一步骤中，在完成活化时间后40秒内，向活化的gb4或gb5中逐滴添加76.25mg(0.30毫摩尔)的n-(-2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐溶解在200μlmilliq水中的溶液。将反应混合物在冰上搅拌另外10分钟。最后，移去冰浴，将混合物在室温下搅拌过夜。将产物置于透析管中，排除尺寸为mwco＝5kda。透析进行了两天；在第一天，对2.5升单摩尔氯化钠溶液进行透析6小时。在此，每2小时更换一次溶液。6小时后，然后对去离子超纯水进行透析过夜。在第二天，对去离子超纯水进行透析8小时，每2小时更换一次水。在最后一步中，将溶液冷冻干燥。尺寸排阻色谱法用于表征gb4/gb5-马来酰亚胺衍生物：尺寸排阻色谱(sec)用于确定每个gb4或gb5分子的马来酰亚胺基团数量。为此目的，肽rgd-sp(m＝990g/摩尔)以各种过量偶联于gb4/gb5-马来酰亚胺衍生物。在这种情况下，检测的摩尔rgdsp过量相对于gb4或gb5为6.8、10或12。最初，通过在样品容器中将35μl各自的rgd-sp浓度与35μl磷酸盐缓冲盐水溶液混合来进行校准。对于该研究，使用来自phenomnex(德国)的biosep-secs2000柱，其中插入hplc系统agilent1100(德国)。洗脱液是磷酸盐缓冲盐水溶液，流速为0.5ml/min。注射量为50μl。在相同的洗脱条件下，还进行马来酰亚胺基团的测定。在每种情况下，将35μlrgd浓度与35μlgb4/gb5-马来酰亚胺衍生物溶液在样品容器中混合。该方法允许用gb4或gb5精确测定马来酰亚胺的转化率。交联反应2后制备基于聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)衍生物的水凝胶(vn2，还见表1)：将gb4/gb5马来酰亚胺衍生物和四臂巯基封端的peg(ugb2，mw＝10,000da，振凯(jenchem)，美国，表2)以两倍于表1中提到的浓度溶解在磷酸盐缓冲盐水溶液中。此后，将等体积的两种组分移液到微反应容器中并在涡旋振荡器上振荡10秒。随后，取出限定体积的反应混合物并置于涂有sigma的9mm直径玻璃盖玻片上。另一个涂有sigma的盖玻片放在水滴上。30分钟后除去盖玻片，并将凝胶切片在磷酸盐缓冲盐水溶液中溶胀12小时。在高ugb2浓度下，ugb2的ph可以用1mhcl调节至ph5-7之间，以实现最佳凝胶化。用3d中的人间叶细胞基质细胞生产用于细胞培养的水凝胶：根据前述方法，使用ugb4(表4，根据tsurkan等人，adv.mater.[新材料]2013,25(18),2606-2610描述的方法合成)代替ugb2制备基质金属蛋白酶(mmp)可切割水凝胶。为此目的，将细胞悬浮在gb4或gb5衍生物中，按照上述方法混合形成水凝胶，并在磷酸盐缓冲盐水溶液和细胞培养基中凝胶化5分钟后立即溶胀。细胞培养：在标准培养条件(5％co2和37℃)下，将间叶细胞干细胞(msc，atcc，从脂肪组织分离，德国)在含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的dmem中培养。在实验中使用第2至4代的msc。将gb-4或gb-5衍生物和ugb与1摩尔cgwggrgdsp/摩尔gb混合并溶解在磷酸盐缓冲盐水溶液中(gb4或gb5衍生物的浓度是表1中所示浓度的3倍)。混合后，将溶液在37℃孵育10-15分钟，然后将浓缩的细胞悬浮液在最终凝胶体积的三分之一中混合，以6x106个细胞/ml外推至最终反应混合物。将ugb4(表1的3倍浓度)溶解在磷酸盐缓冲盐水溶液中的总凝胶体积的另外三分之一中，并添加到具有细胞的gb4/5衍生物的混合物中并通过移液混合。凝胶化5分钟后，添加上述细胞培养基，并如前所述将水凝胶在37℃孵育24小时。测试：在水凝胶中培养细胞孵育24小时后，进行测试。为此，将溶解在细胞培养基中的10％染料溶液添加到每个水凝胶样品中，并在微量滴定板中于37℃孵育1小时。随后，在微孔板光度计(德国)上测量荧光。激发波长为560nm，荧光在590nm波长下测量。通过相对荧光值(rfu)指示细胞的代谢活性。评估了10个具有4个受试者测定(n＝40)的独立实验，并且发现所有条件的显著差异(单因素方差分析)。抗菌抑制区测定：将水凝胶盘(60μl)在1ml的50μg/ml庆大霉素(西格玛奥德里奇公司(sigmaaldrich)，德国)中孵育18小时，然后用磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤两次。通过抑制区测定法测定带有庆大霉素的水凝胶的抗微生物活性。为此目的，根据制造商的说明制备luria肉汤(lb)琼脂(西格玛奥德里奇公司(sigmaaldrich)，慕尼黑，德国)板。生长12小时后的大肠杆菌k12dh5(dsmz，德国)和表皮葡萄球菌pci1200(atcc，美国)培养物在600nm下稀释至0.1并测量光密度(od)。将250μl这些细菌悬浮液施加在各自的平板上。使用无菌棉布均匀分布细菌。将水凝胶ugb1-gb101、ugb2-gb420和ugb2-gb523以及ugb2-ugb326(各自添加或不添加庆大霉素)置于agar板的四个角上，并将板在37℃孵育过夜。此后，用数字卡尺测量抑制区。评估了10个具有3个受试者定义(n＝30)的独立实验，并且发现所有条件的显著差异(单因素方差分析)。确定水凝胶的物理化学性质：为了确定各种水凝胶类型的物理性质，在每种情况下将67μl未聚合的水凝胶溶液在两个9mm玻璃载玻片(menzel德国)之间聚合，所述载玻片用sigmacote(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)在室温下处理16小时，然后从玻璃载玻片上取下所得的凝胶切片。用fla-3100型扫描仪(富士通(fujitsu)，日本)光学测定凝胶切片的直径(未溶胀状态下的直径)。此后，将凝胶切片在磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs)、0.9％nacl缓冲至ph7.4(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)中溶胀24小时(生理条件)，并再次用fla型3100扫描仪测量(富士通(fujitsu)，日本)(溶胀状态下的直径)。根据以下等式由确定的直径确定水凝胶的溶胀：溶胀＝溶胀的水凝胶的直径^3/未溶胀的水凝胶的直径^3，参见表1。报告的数据各自通过从至少四个独立样品取平均值(mw)获得。另外，指定了标准偏差(sd)。此外，水凝胶的储能模量和损耗模量使用来自英国ta仪器公司(tainstrumentsunitedkingdom)的ares型剪切流变仪通过振荡流变测定法(以千帕表示)测定。为此目的，从在生理条件下溶胀的水凝胶(磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs，0.9％nacl缓冲至ph7.4(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国))中冲压8mm切片24小时，并在9mm板中测量，设置为在室温下增加频率1-100rad/s且低变形(2％)，并且在整个频率范围内确定平均值(每个样品1个测量值)。报告的值是四个独立制备的水凝胶盘的平均值，并给出±标准偏差。表1中给出了四种水凝胶类型的储能模量，并且损耗模量小了几个数量级(数据未显示)。表1显示了水凝胶的物理化学性质。水凝胶的网眼尺寸可以基于橡胶弹性理论使用下面的公式(聚合物物理学(polymerphysics)，michaelrubinstein和ralphh.colby，2006，牛津大学出版社，牛津)从实验确定的储能模量得出：其中g'是测量的储能模量，na是阿伏伽德罗常数，r是通用气体常数，t是温度(以开尔文表示)。为了确定不同水凝胶类型的结合特性，将未聚合的水凝胶溶液在室温下在用sigmacote(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)(曼泽尔玻璃(menzelglasses))处理的两个5mm载玻片之间聚合16小时，随后在磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs)(0.9％nacl缓冲至ph7.4)(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)中溶胀24小时。相应地调整总体积以确保在四种水凝胶类型中等量摩尔量的gb1、gb2、gb3和gb4(参见表4)。对于结合(螯合)研究，将各水凝胶盘在0.5ml蛋白质lobind反应容器(微量离心管，德国)中孵育24小时，其中对应于表3的蛋白质混合物溶于400μlpbs中，含1％(m/v)牛血清白蛋白(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)和0.05％(m/v)proclin300(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，德国)(对应于孵育后的溶液2)。为了制备蛋白质混合物，根据制造商的说明溶解procartaplex标准a、b和c(生物科学公司(ebioscience)，德国)并补充蛋白质dkk1(制造商编号：120-30，派普泰克公司(peprotech)，德国)，骨硬化蛋白(制造商编号：1406-st，派普泰克公司(peprotech)，德国)和tgfb1(制造商：100-21，派普泰克公司(peprotech)，德国)。各个浓度显示在表7中(对应于孵育前的溶液1)。将溶液1和2储存在-80℃直至测量蛋白质浓度。为了确定溶液1和2中的蛋白质浓度，根据制造商的说明，使用procartaplex人趋化因子panel1(生物科学公司(ebioscience)，德国)与相应procarteaplexsimplex试剂盒组合在bioplex200型的装置(伯乐公司(biorad)，德国)上测量样品。根据确定的溶液1和2的浓度，根据下式确定信号分子的结合(螯合)：结合％＝(1溶液2中的浓度(孵育后)/溶液1中的浓度(孵育前))×100。表4显示gb1至4的羧基的活化时间(以分钟表示)和用于结合研究的凝胶体积。硫酸化或磺化水凝胶的特征在于它们在带电的结构单元(gb)上的电荷分布，以摩尔硫酸根或磺酸根基团/摩尔聚合物表示，并且通过在生理条件下在硫酸根中溶胀的水凝胶体积中的硫酸根或磺酸根基团的浓度来表征，以毫摩尔硫酸根或磺酸根/ml水凝胶，每个we的硫酸根或磺酸根基团数量除以特定区域中we的摩尔质量。假设水凝胶结构单元定量构建到网络中，基于水凝胶化过程中的水凝胶结构单元的摩尔浓度(参见表1)和体积膨胀(表1)进行计算。未溶胀的水凝胶中硫酸根或磺酸根基团的浓度由未溶胀的水凝胶中的gb浓度×重复单元数量×每个重复单元的硫酸根或磺酸根基团数量计算。溶胀凝胶中的硫酸根或磺酸根的浓度(表1)由未溶胀的水凝胶中的硫酸根或磺酸根基团的浓度除以溶胀计算(参见表1)。提取实验未产生任何可测量的凝胶组分洗脱，因此认为完全掺入凝胶组分的假设是合理的。表3显示了如前所述，在孵育前标准化为可溶性因子浓度的水凝胶中信号分子的结合量的百分比。百分比是指质量百分比。物质的分子大小，也称为信号物质或因子，以千道尔顿(kda)表示。蛋白质(信号分子)通过缩写(表3)和通用蛋白质资源数据库(uniprot；http://www.uniprot.org/)的uniprot识别号(uniprotid)进行唯一分配。使用程序expasyprotparm基于完全生物处理的氨基酸序列测定等电点(iep)和摩尔质量(http://web.expasy.org/protparam/；参考文献：gasteiger,e.等人,theproteomicsprotocolshandbook[蛋白质组学方案手册]571-607(2005))。使用基于uniprot识别号的数据库expasyprosite确定蛋白质的结构参数(http://prosite.expasy.org/；sigrist,c.j.a.等人,newandcontinuingdevelopmentsatexpasyprosite[expasy蛋白质功能位点数据库的新发展和持续发展]；参考文献：(1)nucleicacidsres[核酸研究]41,(2013)；(2)sigrist,c.j.a.等人,prosite:adocumenteddatabaseusingpatternsandprofilesasmotifdescriptors.,brief.bioinform.[蛋白质功能位点数据库：使用模式和配置文件作为基序描述符的文档化数据库。生物信息学简报],3,265-274(2002))。当前第1页12