用于耗尽CD137+细胞的组合物和方法与流程
相关申请
本申请要求于2017年1月20日提交的美国临时申请第62/448,741号和于2017年12月7日提交的美国临时申请第62/595,977号的优先权。上文提及的申请的内容通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本发明涉及移植疗法的领域，并且提供了用于通过施用能够结合由造血细胞表达的抗原的抗体、抗体-药物缀合物和配体-药物缀合物来治疗自身免疫性疾病和移植物抗宿主疾病(gvhd)的方法。
发明背景
虽然造血干细胞具有显著的治疗潜力，但阻碍它们在临床中使用的限制是在细胞移植之后几天或几周的移植物抗宿主疾病(gvhd)的发展。虽然关于移植后gvhd的治疗取得了显著的进展，但对改善的方法，特别是关于降低gvhd的死亡率，本领域中仍存在需求。gvhd的常规治疗需要使用有效药物诸如皮质类固醇和环孢菌素的系统性免疫抑制疗法。诸如霉酚酸酯、雷帕霉素(西罗莫司)、伊马替尼和利妥昔单抗的剂被用于具有类固醇难治性gvhd的患者。然而，这些治疗具有有限的功效，并且经常引起严重的不良作用。仅50％的具有gvhd的患者能够在诊断之后5年内终止免疫抑制治疗，并且10％的患者需要超过5年的持续治疗。剩余的40％在gvhd消退之前死亡或发展复发性恶性肿瘤。具有高风险gvhd的患者(血小板计数<100,000/微升或gvhd进行性发作)的五年存活率仅为40％-50％。因此，预防和治疗gvhd的创新性策略的开发代表着重要的未满足的临床需求。
如同gvhd，自身免疫性疾病诸如多发性硬化、类风湿性关节炎、肠道疾病、银屑病、狼疮和1型糖尿病的特征在于针对正常自身组织的异常免疫应答。自身免疫性疾病的特征在于产生自身反应性t细胞和与宿主组织反应的抗体(自身抗体)。自身免疫性疾病的传统疗法包括全局抑制免疫应答的免疫抑制剂。这样的剂的益处通常由于易受机会性感染、长期恶性肿瘤的风险、毒性和其他不利副作用而减弱。因此，对开发更特异性地靶向gvhd和自身免疫性疾病两者的细胞介质(mediator)的策略存在需求。
发明概述
本发明提供了用于预防和治疗接受造血干细胞移植疗法的患者诸如人类患者中的急性和慢性形式的移植物抗宿主疾病(gvhd)和自身免疫性疾病，以便降低与gvhd和自身免疫性疾病相关的发病率和死亡率的方法。此外，本发明的特征还在于治疗各种造血状况的方法，所述造血状况诸如镰状细胞性贫血、地中海贫血、范科尼贫血、wiskott-aldrich综合征(wiskott-aldrichsyndrome)、腺苷脱氨酶缺乏症-重症综合性免疫缺陷、异染性脑白质营养不良、diamond-blackfan贫血和schwachman-diamond综合征、人类免疫缺陷病毒感染和获得性免疫缺陷综合征，以及其他。本发明的特征在于用能够结合由造血细胞表达的蛋白质诸如cd137的抗体、抗体-药物缀合物、配体和配体-药物缀合物治疗患者，以便耗尽患者中的造血细胞(诸如t细胞)的群体的方法。t细胞的该选择性耗尽继而改善了总患者存活率和无复发患者存活率，同时显著减少了gvhd和自身免疫性疾病。
在第一方面中，本发明的特征在于治疗有相应需要的人类患者中的gvhd的方法，该方法通过向患者施用有效量的能够结合cd137的抗体、或其抗原结合片段、或抗体药物缀合物(adc)进行，其中抗体或其抗原结合片段经由接头缀合至细胞毒素。
在第二方面中，本发明提供了一种耗尽罹患gvhd或处于gvhd风险的人类患者中的cd137+细胞的群体的方法，该方法通过向患者施用有效量的能够结合cd137的抗体、或其抗原结合片段、或抗体药物缀合物(adc)进行，其中抗体或其抗原结合片段经由接头缀合至细胞毒素。
在第三方面中，本发明的特征在于治疗有相应需要的人类患者中的自身免疫性疾病的方法，该方法通过向患者施用有效量的能够结合cd137的抗体、或其抗原结合片段、或抗体药物缀合物(adc)进行，其中抗体或其抗原结合片段经由接头缀合至细胞毒素。
在第四方面中，本发明提供了一种耗尽罹患自身免疫性疾病或处于自身免疫性疾病风险的人类患者中的cd137+细胞的群体的方法，该方法通过向患者施用有效量的能够结合cd137的抗体、或其抗原结合片段、或抗体药物缀合物(adc)进行，其中抗体或其抗原结合片段经由接头缀合至细胞毒素。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体或其抗原结合片段、多克隆抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、双重可变免疫球蛋白结构域、单链fv分子(scfv)、双体、三体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、fv片段、fab片段、f(ab’)2分子和串联二-scfv。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合位于seqidno:20的氨基酸残基115-156内的表位处的人类cd137细胞外结构域。seqidno:20对应于cd137的细胞外结构域，并且具有以下氨基酸序列：
在一些实施方案中，抗体具有选自由以下组成的组的同种型：igg、iga、igm、igd和ige。
在一些实施方案中，fc结构域是人类igg1同种型fc结构域。在一些实施方案中，fc结构域是人类igg2同种型fc结构域。在一些实施方案中，fc结构域是人类igg3同种型fc结构域。在一些实施方案中，fc结构域是人类igg4同种型fc结构域。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗有相应需要的人类患者中的gvhd的方法，该方法包括向患者施用有效量的可溶性cd137配体。
在另一个方面中，本发明的特征在于耗尽罹患gvhd或处于gvhd风险的人类患者中的cd137阳性细胞的群体的方法，该方法包括向患者施用有效量的可溶性cd137配体。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗有相应需要的人类患者中的自身免疫性疾病的方法，该方法通过向患者施用有效量的可溶性cd137配体进行。
在另一个方面中，本发明的特征在于耗尽罹患自身免疫性疾病或处于自身免疫性疾病风险的人类患者中的cd137阳性细胞的群体的方法，该方法通过向患者施用有效量的可溶性cd137配体进行。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段被缀合至细胞毒素诸如微管结合剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段或可溶性cd137配体通过接头缀合至微管结合剂。在又其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段被缀合至细胞毒素，其中细胞毒素是微管结合剂。
在一些实施方案中，微管结合剂是美登素(maytansine)。
在一些实施方案中，微管结合剂是美登木素生物碱(maytansinoid)。
在一些实施方案中，微管结合剂是美登素或美登木素生物碱。
在一些实施方案中，美登木素生物碱选自由以下组成的组：dm1、dm3和dm4以及美登醇(maytansinol)。
在一些实施方案中，美登木素生物碱是美登醇类似物。
在一些实施方案中，在患者接受包括造血干细胞的移植之前，抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体被递送至患者中。
在一些实施方案中，在将造血干细胞施用至患者之前约3天(例如，从1小时至7天(例如，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天))，缀合至细胞毒素诸如微管结合剂的抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体被递送至患者中。
在一些实施方案中，在患者接受包括造血干细胞的移植的同时，抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体被递送至患者中。
在一些实施方案中，在患者接受包括造血干细胞的移植之后，抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体被递送至患者中。
在一些实施方案中，在施用外源性造血干细胞移植体之后例如约1小时至10天(例如，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天)或更多天，其抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体(例如，被缀合至细胞毒素，诸如微管结合剂)被递送至患者中。例如，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在移植之后约3天至4天被施用。
在一些实施方案中，移植是同种异体的。在一些实施方案中，移植是自体的。
在一些实施方案中，移植是骨髓移植、外周血移植或脐带血移植。
在一些实施方案中，移植包括造血细胞(例如，造血干细胞)。
在一些实施方案中，在造血干细胞移植到患者中后两天或更多天之后，造血干细胞或其后代维持造血干细胞功能潜力。
在一些实施方案中，在造血干细胞移植到患者中后两天或更多天(例如，从约2天至约5天、从约2天至约7天、从约2天至约20天、从约2天至约30天、诸如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更多天)之后，造血干细胞或其后代维持造血干细胞功能潜力。
在一些实施方案中，在造血干细胞移植到患者中后，造血干细胞或其后代能够定位至造血组织诸如骨髓和/或重建造血作用。
在一些实施方案中，在移植到患者中后，造血干细胞引起选自由以下组成的组的细胞的群体的恢复：巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、t细胞和b细胞。
在一些实施方案中，移植包括白细胞。
在一些实施方案中，在移植到患者后，造血细胞选自由以下组成的组：t细胞、b细胞、树突细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、癌细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种耗尽罹患gvhd或处于gvhd风险的人类患者中的cd137+细胞的群体的方法，该方法通过向患者施用有效量的能够结合cd137并且缀合至细胞毒素诸如微管结合剂的抗体、或抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体进行，其中包括cd137+细胞的造血细胞选自由以下组成的组：t细胞、b细胞、树突细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、癌细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
在一些实施方案中，选自由t细胞、b细胞、树突细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、癌细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞组成的组的cd137+细胞展示出针对患者的抗原的反应性。
在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体在施用至患者后被cd137+细胞内化。例如，抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体可以通过受体介导的胞吞(例如，在结合至细胞表面cd137后)被cd137+t细胞内化。在一些实施方案中，与抗体、其抗原结合片段或adc共价结合的细胞毒素可以通过化学裂解(例如，通过本文描述的接头的酶促裂解或非特异性裂解)在细胞内释放。然后细胞毒素可以进入其细胞内靶(诸如有丝分裂纺锤体、核dna、核糖体rna或拓扑异构酶，以及其他)，以便促进cd137+t细胞的死亡。
在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体能够促进有丝分裂停滞并抑制cd137+t细胞的增殖(例如，通过抑制微管动态不稳定性)。
在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体可以通过在施用至患者后募集一种或更多种补体蛋白、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞来促进细胞的死亡。
在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性cd137配体可以通过在施用至患者后募集一种或更多种补体蛋白、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞来促进cd137+t细胞的死亡。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段或可溶性cd137配体用于治疗t细胞或b细胞驱动的自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，自身免疫性疾病是多发性硬化、类风湿性关节炎、肠道疾病、银屑病、狼疮或1型糖尿病。
在一些实施方案中，所述方法用于治疗患者中的一种或更多种紊乱或癌症，该患者诸如已经接受了包括造血干细胞的移植的患者。例如，患者可以是罹患干细胞紊乱的患者。在一些实施方案中，患者罹患血红蛋白病紊乱，诸如镰状细胞性贫血、地中海贫血、范科尼贫血和wiskott-aldrich综合征。患者可以罹患免疫缺陷性紊乱，诸如先天性免疫缺陷性紊乱或获得性免疫缺陷性紊乱(例如，人类免疫缺陷病毒或获得性免疫缺陷综合征)。在一些实施方案中，患者罹患代谢紊乱，诸如糖原贮积病、黏多糖贮积病、戈谢氏病(gaucher'sdisease)、hurler病、鞘脂贮积病和异染性脑白质营养不良。在一些实施方案中，患者罹患癌症，诸如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征以及成神经细胞瘤。在一些实施方案中，患者罹患选自由以下组成的组的紊乱：腺苷脱氨酶缺乏症和重症综合性免疫缺陷、高免疫球蛋白m综合征、chediak-higashi病、遗传性淋巴组织细胞增多症、骨硬化病、成骨不全症、贮积病、重型地中海贫血、系统性硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化和青少年类风湿性关节炎。
在另外的方面中，本发明的特征在于治疗有相应需要的人类患者中的移植物抗宿主疾病(gvhd)的方法，该方法通过向人类患者施用抗cd137抗体药物缀合物(adc)使得gvhd被治疗，其中adc包含连接至细胞毒素的抗cd137抗体，该细胞毒素是微管结合剂或rna聚合酶抑制剂。在一个实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植之前向患者施用adc。在另一个实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植之前约三天向患者施用adc。在另一个实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植的同时向患者施用adc。在另外的实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植之后向患者施用adc。在又另一个实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植之后约1小时至10天向患者施用adc。在另外的实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植之后约3天至4天向患者施用adc。在其他实施方案中，移植是同种异体的。
在又另一个方面中，本发明的特征在于耗尽患有gvhd或处于发展gvhd风险的人类受试者中的cd137阳性细胞的群体的方法，该方法通过向人类患者施用抗cd137adc使得cd137细胞的群体被耗尽，其中adc包含连接至细胞毒素的抗cd137抗体，该细胞毒素是微管结合剂或rna聚合酶抑制剂。在一个实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植之前向患者施用adc。在另一个实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植之前约三天向患者施用adc。在另一个实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植的同时向患者施用adc。在另外的实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植之后向患者施用adc。在又另一个实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植之后约1小时至10天向患者施用adc。在另外的实施方案中，该方法包括在患者接受包括造血干细胞的移植之后约3天至4天向患者施用adc。在其他实施方案中，移植是同种异体的。在其他实施方案中，微管结合剂是美登木素生物碱。在其他实施方案中，rna聚合酶抑制剂是鹅膏蕈毒素(amatoxin)。在某些实施方案中，鹅膏蕈毒素由式(ia)表示
其中r1是h、oh、ora或orc；
r2是h、oh、orb或orc；
ra和rb与它们结合的氧原子一起组合形成任选地被取代的5元杂环烷基基团；
r3是h、rc或rd；
r4、r5、r6和r7各自独立地是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r8是oh、nh2、orc、ord、nhrc或nrcrd；
r9是h、oh、orc或ord；
x是-s-、-s(o)-或-so2-；
rc是-l-z；
rd是任选地被取代的c1-c6烷基、任选地被取代的c1-c6杂烷基、任选地被取代的c2-c6烯基、任选地被取代的c2-c6杂烯基、任选地被取代的c2-c6炔基、任选地被取代的c2-c6杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的杂芳基；
l是任选地被取代的c1-c6亚烷基、任选地被取代的c1-c6杂亚烷基、任选地被取代的c2-c6亚烯基、任选地被取代的c2-c6杂亚烯基、任选地被取代的c2-c6亚炔基、任选地被取代的c2-c6杂亚炔基、任选地被取代的环亚烷基、任选地被取代的杂环亚烷基、任选地被取代的亚芳基或任选地被取代的杂亚芳基；并且
z是由l上存在的反应性取代基与抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分，
其中am精确地包含一个rc取代基。在又其他实施方案中，鹅膏蕈毒素由式(ib)表示
其中r1是h、oh、ora或orc；
r2是h、oh、orb或orc；
ra和rb与它们结合的氧原子一起组合形成任选地被取代的5元杂环烷基基团；
r3是h、rc或rd；
r4、r5、r6和r7各自独立地是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r8是oh、nh2、orc、ord、nhrc或nrcrd；
r9是h、oh、orc或ord；
x是-s-、-s(o)-或-so2-；
rc是-l-z；
rd是任选地被取代的c1-c6烷基、任选地被取代的c1-c6杂烷基、任选地被取代的c2-c6烯基、任选地被取代的c2-c6杂烯基、任选地被取代的c2-c6炔基、任选地被取代的c2-c6杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的杂芳基；
l是任选地被取代的c1-c6亚烷基、任选地被取代的c1-c6杂亚烷基、任选地被取代的c2-c6亚烯基、任选地被取代的c2-c6杂亚烯基、任选地被取代的c2-c6亚炔基、任选地被取代的c2-c6杂亚炔基、任选地被取代的环亚烷基、任选地被取代的杂环亚烷基、任选地被取代的亚芳基或任选地被取代的杂亚芳基；并且
z是由l上存在的反应性取代基与抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分，
其中am精确地包含一个rc取代基。
在其他实施方案中，adc包含缀合至细胞毒素的抗cd137抗体，该细胞毒素是rna聚合酶抑制剂，例如鹅膏蕈碱。在一个实施方案中，鹅膏蕈碱是α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素(amanin)、鹅膏素酰胺(amaninamide)、一羟鹅膏素酰胺(amanullin)、一羟鹅膏毒肽羧酸(amanullinicacid)或羧基鹅膏毒肽酰胺原(proamanullin)。
在另一个方面中，本发明的特征在于耗尽接受同种异体移植的人类患者中的同种异体反应性t细胞的方法，该方法通过向人类患者施用抗cd137adc使得同种异体反应性t细胞被耗尽，其中adc包含连接至细胞毒素的抗cd137抗体。在某些实施方案中，移植是骨髓移植。在其他实施方案中，移植是外周血移植。在又其他实施方案中，移植是脐带血移植。在其他实施方案中，移植包括造血细胞。在某些实施方案中，在造血干细胞移植到患者中后两天或更多天之后，造血干细胞或其后代维持造血干细胞功能潜力。在其他实施方案中，细胞毒素是rna聚合酶抑制剂。在另一个实施方案中，rna聚合酶抑制剂是鹅膏蕈毒素。在其他实施方案中，抗cd137抗体包含如由kabat编号定义的抗体bbk2的cdr。在另一个实施方案中，抗cd137抗体包含抗体bbk2的重链可变区和轻链可变区(如lee,等人eurjimmunogenet.2002年10月；29(5):449-52中描述的，该文献通过引用以其整体并入本文)。在其他实施方案中，抗cd137抗体是嵌合bbk2。在其他实施方案中，抗cd137抗体包含含有seqidno:23的重链序列和含有seqidno:24的轻链序列。在又其他实施方案中，抗cd137抗体是拮抗剂抗体。
在其他实施方案中，抗cd137抗体是igg1或igg4。在某些实施方案中，抗cd137抗体是完整抗体。
在一个实施方案中，在本文描述的方法和组合物中使用的微管结合剂是美登木素生物碱。
在其他实施方案中，在本文描述的方法和组合物中使用的rna聚合酶抑制剂是鹅膏蕈毒素。在某些实施方案中，鹅膏蕈毒素由式(ia)表示
其中r1是h、oh、ora或orc；
r2是h、oh、orb或orc；
ra和rb与它们结合的氧原子一起组合形成任选地被取代的5元杂环烷基基团；
r3是h、rc或rd；
r4、r5、r6和r7各自独立地是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r8是oh、nh2、orc、ord、nhrc或nrcrd；
r9是h、oh、orc或ord；
x是-s-、-s(o)-或-so2-；
rc是-l-z；
rd是任选地被取代的c1-c6烷基、任选地被取代的c1-c6杂烷基、任选地被取代的c2-c6烯基、任选地被取代的c2-c6杂烯基、任选地被取代的c2-c6炔基、任选地被取代的c2-c6杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的杂芳基；
l是任选地被取代的c1-c6亚烷基、任选地被取代的c1-c6杂亚烷基、任选地被取代的c2-c6亚烯基、任选地被取代的c2-c6杂亚烯基、任选地被取代的c2-c6亚炔基、任选地被取代的c2-c6杂亚炔基、任选地被取代的环亚烷基、任选地被取代的杂环亚烷基、任选地被取代的亚芳基或任选地被取代的杂亚芳基；并且
z是由l上存在的反应性取代基与抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分，
其中am精确地包含一个rc取代基。在又其他实施方案中，鹅膏蕈毒素由式(ib)表示
其中r1是h、oh、ora或orc；
r2是h、oh、orb或orc；
ra和rb与它们结合的氧原子一起组合形成任选地被取代的5元杂环烷基基团；
r3是h、rc或rd；
r4、r5、r6和r7各自独立地是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r8是oh、nh2、orc、ord、nhrc或nrcrd；
r9是h、oh、orc或ord；
x是-s-、-s(o)-或-so2-；
rc是-l-z；
rd是任选地被取代的c1-c6烷基、任选地被取代的c1-c6杂烷基、任选地被取代的c2-c6烯基、任选地被取代的c2-c6杂烯基、任选地被取代的c2-c6炔基、任选地被取代的c2-c6杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的杂芳基；
l是任选地被取代的c1-c6亚烷基、任选地被取代的c1-c6杂亚烷基、任选地被取代的c2-c6亚烯基、任选地被取代的c2-c6杂亚烯基、任选地被取代的c2-c6亚炔基、任选地被取代的c2-c6杂亚炔基、任选地被取代的环亚烷基、任选地被取代的杂环亚烷基、任选地被取代的亚芳基或任选地被取代的杂亚芳基；并且
z是由l上存在的反应性取代基与抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分，
其中am精确地包含一个rc取代基。在其他实施方案中，rna聚合酶抑制剂是鹅膏蕈碱。在又其他实施方案中，鹅膏蕈碱是α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、鹅膏素酰胺、一羟鹅膏素酰胺、一羟鹅膏毒肽羧酸或羧基鹅膏毒肽酰胺原。
在一个实施方案中，特征在于包含经由接头缀合至细胞毒素的抗cd137抗体的抗体药物缀合物(adc)。细胞毒素可以是例如鹅膏蕈碱，例如α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、鹅膏素酰胺、一羟鹅膏素酰胺、一羟鹅膏毒肽羧酸和羧基鹅膏毒肽酰胺原。在一个实施方案中，细胞毒素是α-鹅膏蕈碱。在一个实施方案中，细胞毒素是β-鹅膏蕈碱。在一个实施方案中，细胞毒素是γ-鹅膏蕈碱。在一个实施方案中，细胞毒素是ε-鹅膏蕈碱。在一个实施方案中，细胞毒素是鹅膏素。在一个实施方案中，细胞毒素是鹅膏素酰胺。在一个实施方案中，细胞毒素是一羟鹅膏素酰胺。在一个实施方案中，细胞毒素是一羟鹅膏毒肽羧酸。在一个实施方案中，细胞毒素是羧基鹅膏毒肽酰胺原。在一个实施方案中，抗cd137抗体结合至人类cd137的胞外域。在一个实施方案中，抗cd137抗体与抗体bbk2竞争。
在一些实施方案中，抗cd137抗体包含抗体bbk2的cdr。在其他实施方案中，抗cd137抗体包含抗体bbk2的重链可变区和轻链可变区。在又其他实施方案中，抗cd137抗体是嵌合bbk2。在其他实施方案中，抗cd137抗体包含含有seqidno:23的重链序列和含有seqidno:24的轻链序列。在某些实施方案中，抗cd137抗体是igg1或igg4。
在另一个方面中，本发明的特征在于特异性结合人类cd137的抗体或其抗原结合部分，所述抗体包含含有seqidno:23中列出的氨基酸序列的重链，并且包含含有seqidno:24中列出的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是完整抗体。
在另一个方面中，本发明的特征在于抗体药物缀合物(adc)，该抗体药物缀合物包含本发明的抗cd137抗体或其抗原结合部分，其中抗体、其抗原结合部分经由接头缀合至细胞毒素。在某些实施方案中，细胞毒素是微管结合剂或rna聚合酶抑制剂。在其他实施方案中，rna聚合酶抑制剂是鹅膏蕈毒素。在又其他实施方案中，鹅膏蕈毒素是鹅膏蕈碱。在其他实施方案中，鹅膏蕈碱是α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、鹅膏素酰胺、一羟鹅膏素酰胺、一羟鹅膏毒肽羧酸或羧基鹅膏毒肽酰胺原。接头可以是例如为val-ala或val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
在另一个方面中，本发明的特征在于药物组合物，该药物组合物包含本发明的adc和药学上有活性的载体。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗有相应需要的人类患者中的移植失败(graftfailure)或gvhd的方法，所述方法包括向人类患者施用有效量的本发明的adc，其中人类患者先前接受了移植。在某些实施方案中，人类患者在施用adc之前不多于4天接受移植。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗处于移植失败或gvhd风险的人类患者的方法，其中将有效量的本文描述的adc施用至处于具有移植失败或gvhd风险的人类患者，随后向人类患者施用移植。在一些实施方案中，adc作为单个剂量被施用至人类患者。
在另一个方面中，本发明的特征在于包含经由接头缀合至细胞毒素的抗cd137抗体的adc，其中该抗体包含重链可变区，该重链可变区包含分别具有seqidno:25、26和27中列出的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3，并且包含轻链可变区，该轻链可变区包含分别具有seqidno:29、30和31中列出的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，重链可变区包含seqidno:28中列出的氨基酸序列，并且轻链可变区包含seqidno:32中列出的氨基酸序列。在其他实施方案中，抗体是igg1同种型或igg4同种型。在其他实施方案中，细胞毒素是微管结合剂或rna聚合酶抑制剂。在又其他实施方案中，rna聚合酶抑制剂是鹅膏蕈毒素。在又其他实施方案中，鹅膏蕈毒素是鹅膏蕈碱。在其他实施方案中，鹅膏蕈碱选自由以下组成的组：α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、鹅膏素酰胺、一羟鹅膏素酰胺、一羟鹅膏毒肽羧酸和羧基鹅膏毒肽酰胺原。
在另一个方面中，本发明的特征在于包含经由接头缀合至细胞毒素的抗cd137抗体的抗体药物缀合物(adc)，其中该抗体包含重链可变区，该重链可变区包含分别具有seqidno:33、34和35中列出的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3，并且包含轻链可变区，该轻链可变区包含分别具有seqidno:36、37、38中列出的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体或人源化抗体。在其他实施方案中，抗体是igg1同种型或igg4同种型。在其他实施方案中，细胞毒素是微管结合剂或rna聚合酶抑制剂。在又其他实施方案中，rna聚合酶抑制剂是鹅膏蕈毒素。在又其他实施方案中，鹅膏蕈毒素是鹅膏蕈碱。在其他实施方案中，鹅膏蕈碱是α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、鹅膏素酰胺、一羟鹅膏素酰胺、一羟鹅膏毒肽羧酸或羧基鹅膏毒肽酰胺原。
在另一个方面中，本发明的特征在于组合物，该组合物包含本文描述的任何adc和药学上可接受的载体。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗有相应需要的人类患者中的移植失败或gvhd的方法，该方法通过向人类患者施用有效量的如本文描述的adc进行，其中人类患者先前接受了移植。在一些实施方案中，人类患者在施用adc之前不多于4天接受移植。在一些实施方案中，adc作为单个剂量被施用至人类患者。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗处于具有移植失败或gvhd风险的人类患者的方法，该方法通过向处于具有移植失败或gvhd风险的人类患者施用有效量的本文描述的抗cd137adc，并且随后向人类受试者施用移植进行。在一些实施方案中，adc作为单个剂量被施用至人类患者。
附图简述
图1a和图1b图示描绘了使用过表达cd137的jurkat细胞(即，人类t淋巴细胞系)的体外细胞结合测定的结果，包括鼠bbk2(即，“bbk-migg1”)和阴性对照(即，“migg1”)。
图2a和图2b图示描绘了体外t细胞杀伤测定的结果，包括抗cd137-鹅膏蕈碱adc(即，“cd137-鹅膏蕈碱”)和抗t细胞特异性鹅膏蕈碱adc(即，“抗t细胞-鹅膏蕈碱”)，与阴性对照(即，“higg-鹅膏蕈碱”)相比。结果示出了每个adc的存活的被激活的细胞的数目(图2a)或存活的未被激活的细胞的数目(图2b)(y轴)随adc浓度(x轴)的变化。
图3图示描绘了体内测定的结果，该测定比较了在nsg小鼠异种-gvhd模型中，将抗cd137-鹅膏蕈碱adc与对照pbs、抗cd137抗体(裸)和同种型-鹅膏蕈碱相比，小鼠存活百分比(y轴)随移植后天数(x轴)的变化。
图4图示描绘了体内测定的结果，该测定比较了在nsg小鼠异种-gvhd模型中，将抗cd137-鹅膏蕈碱adc与对照pbs、抗cd137抗体(裸)和同种型-鹅膏蕈碱相比，在外周血中检测到的人类t细胞的数目(y轴)随移植后天数(x轴)的变化。
图5a和图5b图示描绘了用于在nsg小鼠异种-gvhd模型中确定对于cd137-鹅膏蕈碱adc与对照pbs、抗cd137-bbk抗体(裸)、同种型-鹅膏蕈碱与抗t细胞-鹅膏蕈碱adc相比，人源化nsg-sgm3小鼠模型中的植入(engraftment)率(图5a)和t细胞频率(图5b)的体内测定的结果，其中抗在移植后第5天、第9天、第14天、第22天和第27天测量植入和t细胞频率。
定义
如本文使用的，术语“约”是指高于或低于所描述的值的10％以内的值。例如，术语“约5nm”指示从4.5nm至5.5nm的范围。
如本文使用的，术语“同种异体”是指来自属于相同的物种但基因上不同的个体的细胞或组织，并且因此是免疫不相容的。因此，术语“同种异体细胞”是指基因不同但属于相同物种的细胞类型。通常，术语“同种异体”用于定义从供体移植到相同物种的接受者的细胞，诸如干细胞。
如本文使用的，术语“鹅膏蕈毒素”是指由鬼笔鹅膏(amanitaphalloides)蘑菇产生的肽的鹅膏蕈毒素家族成员，或其变体或衍生物，诸如其能够抑制rna聚合酶ii活性的变体或衍生物。与本文描述的组合物和方法结合使用的鹅膏蕈毒素包括α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、鹅膏素酰胺、一羟鹅膏素酰胺、一羟鹅膏毒肽羧酸和羧基鹅膏毒肽酰胺原以及其衍生物，诸如由本文描述的式(i)、式(ia)和式(ii)中任一种描述的衍生物。
如本文使用的术语“拮抗剂”描述了抑制或降低靶分子例如cd137的生物活性的任何分子。
如本文使用的，术语“抗体”是指与特定抗原特异性结合或与特定抗原免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程化抗体和其他方式修饰的形式的抗体，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、异源缀合抗体(例如，双特异性抗体、三特异性抗体和四特异性抗体、双体、三体和四体)，以及抗体的抗原结合片段，包括例如fab'片段、f(ab')2片段、fab片段、fv片段、rlgg片段和scfv片段。除非另外指示，否则术语“单克隆抗体”(mab)意在包括能够与靶蛋白质特异性结合的完整分子以及抗体片段(包括例如fab片段和f(ab')2片段)两者。如本文使用的，fab片段和f(ab')2片段是指缺乏完整抗体的fc片段的抗体片段。本文描述了这些抗体片段的实例。
取决于抗体的重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体可以被指定为不同的类别。存在五大类免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些中的若干种可以被进一步分成亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的，并且在例如abbas等人cellularandmol.immunology,第4版(2000)中被一般地描述。抗体可以是通过抗体与一个或更多个其他蛋白质或肽的共价缔合或非共价缔合形成的较大融合分子的一部分。
如本文使用的术语“抗原结合片段”是指保留与靶抗原特异性结合的能力的抗体的一个或更多个片段。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。抗体片段可以是例如fab、f(ab’)2、scfv、双体、三体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适配体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于：(i)fab片段，由vl结构域、vh结构域、cl结构域和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，含有在铰链区通过二硫化物桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh结构域和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体的单臂的vl结构域和vh结构域组成的fv片段，(v)包含vh结构域和vl结构域的dab；(vi)由vh结构域组成的dab片段(参见，例如，ward等人,nature341:544-546,1989)；(vii)由vh结构域或vl结构域组成的dab；(viii)分离的互补决定区(cdr)；以及(ix)两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)分离的cdr的组合，该cdr可以任选地通过合成接头连接。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过接头连接，该接头使得它们能够成为单个蛋白质链，其中vl区和vh区配对以形成单价分子(被称为单链fv(scfv))。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选这些片段的效用。抗原结合片段可以通过重组dna技术、完整免疫球蛋白的酶促裂解或化学裂解，或在某些情况下，通过本领域已知的化学肽合成程序产生。
如本文使用的，术语“抗cd137抗体”是指能够与cd137特异性结合的含蛋白质或肽的分子，该分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，诸如但不限于重链或轻链或其配体结合部分的至少一个cdr、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分。抗cd137抗体还包含抗体样蛋白支架，诸如iii型纤连蛋白第十结构域(10fn3)，其含有在结构和溶剂可及性上类似于抗体cdr的bc、de和fg结构环。10fn3结构域的三级结构类似于igg重链的可变区的三级结构，并且本领域技术人员可以通过用来自抗cd137单克隆抗体的cdrh-1、cdrh-2或cdrh-3区的残基代替10fn3的bc、de和fg环的残基将例如抗cd137单克隆抗体的cdr移植到纤连蛋白支架上。在一个实施方案中，抗cd137抗体与人类cd137特异性结合。
如本文使用的，术语“双特异性抗体”是指例如能够结合至少两种不同抗原的单克隆抗体，通常是人类抗体或人源化抗体。例如，结合特异性中的一种可以针对t细胞表面抗原，诸如cd137，另一种可以用于不同的t细胞表面抗原或另一种细胞表面蛋白质，诸如参与阻止或限制细胞生长的信号转导途径的受体或受体亚基，以及其他。
如本文使用的，术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这样的抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性(参见，例如，美国专利第4,816,567号和morrison等人,1984,proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855)。在一个实施方案中，嵌合抗体包含鼠重链和轻链可变区以及人类轻链和重链恒定区。
如本文使用的，术语“互补决定区”和“cdr”是指在抗体的轻链和重链可变结构域两者中发现的高变区。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(fr)。描绘抗体的高变区的氨基酸位置可以取决于背景和本领域已知的各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可以被视为混合高变位置，因为这些位置可以根据一组标准被认为是在高变区内，而根据不同组标准被认为是在高变区外。这些位置中的一个或更多个也可以见于扩展的高变区中。本文描述的抗体可以在这些混合高变位置中含有修饰。天然重链和轻链的可变结构域各自含有通过三个cdr连接的四个框架区，其主要采用β-折叠构型，该cdr形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每个链中的cdr通过框架区以fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的顺序紧密靠近在一起，并且与来自其他抗体链的cdr一起促成抗体的靶结合位点的形成(例如，参见kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,nationalinstituteofhealth,bethesda,md.,1987或http://www.imgt.org/3dstructure-db/cgi/domaingapalign.cgi)。免疫球蛋白氨基酸残基包括cdr的编号可以根据kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行。
如本文使用的，术语“缀合物”是指通过化学键合一个分子(诸如抗体或其抗原结合片段)的反应性官能团与另一个分子(诸如本文描述的细胞毒素)的适当反应性官能团而形成的化合物。缀合物可以在彼此结合的两个分子之间(例如在抗体和细胞毒素之间)包含接头。可以用于形成缀合物的接头的实例包括含有肽的接头，诸如含有天然存在的或非天然存在的氨基酸，诸如d-氨基酸的接头。可以使用本文描述的和本领域已知的各种策略来制备接头。取决于其中的反应性组分，可以通过例如酶促水解、光解、在酸性条件下水解、在碱性条件下水解、氧化、二硫化物还原、亲核裂解或有机金属裂解来裂解接头(参见，例如leriche等人,bioorg.med.chem.,20:571-582,2012)。值得注意的是，术语“缀合物”(当指化合物时)在本文中也可互换地被称为“药物抗体缀合物”或“抗体药物缀合物(adc)”。
如本文使用的，术语“偶联反应”是指化学反应，其中两个或更多个适合于彼此反应的取代基反应以便形成将与每个取代基结合的分子片段连接起来(例如，共价地)的化学部分。偶联反应包括那些反应，其中与作为细胞毒素(诸如本领域已知的或本文描述的细胞毒素)的片段结合的反应性取代基和与用于本领域已知的或本文描述的cd137的片段结合的合适反应性取代基反应。合适地反应性取代基的实例包括亲核体/亲电体对(例如，硫醇/卤代烷基对、胺/羰基对、或硫醇/α,β-不饱和羰基对，以及其他)、二烯/亲二烯体对(例如叠氮化物/炔烃对，以及其他)以及类似物。偶联反应包括但不限于硫醇烷基化、羟基烷基化、胺烷基化、胺缩合、酰胺化、酯化、二硫化物形成、环加成(例如，[4+2]diels-alder环加成、[3+2]huisgen环加成，以及其他)、亲核芳香族取代、亲电芳香族取代和本领域已知的或本文描述的其他反应形式。
如本文使用的，术语“供体”是指在将细胞或其后代施用至接受者之前从其中分离一种或更多种细胞的人类或动物。一种或更多种细胞可以是例如造血干细胞的群体。
如本文使用的，术语“双体”是指含有两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过接头连接的vh结构域和vl结构域，该接头太短(例如，包含五个氨基酸的接头)而不允许同一肽链上的vh结构域和vl结构域的分子内缔合。该构型迫使每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对，以便形成同二聚体结构。因此，术语“三体”是指含有三条肽链的三价抗体，肽链中的每条含有通过接头连接的一个vh结构域和一个vl结构域，该接头是极短的(例如，包含1个-2个氨基酸的接头)而不准许在同一肽链内的vh结构域和vl结构域的分子内缔合。为了折叠成它们的天然结构，以这种方式配置的肽通常是三聚化的，以便将相邻肽链的vh结构域和vl结构域定位成在空间上彼此接近(参见，例如，holliger等人,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-48,1993)。
如本文使用的，“双重可变结构域免疫球蛋白”(“dvd-ig”)是指经由接头组合两种单克隆抗体的靶结合可变结构域以产生四价双靶向单一剂的抗体(参见，例如，gu等人,meth.enzymol.,502:25-41,2012)。
如本文使用的，术语“内源性”描述在特定生物体诸如人类患者中天然存在的物质，诸如分子、细胞、组织或器官(例如，造血干细胞或造血谱系细胞，诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、t细胞或b细胞)。
如本文使用的，术语“外源性”描述在特定生物体诸如人类患者中并不天然存在的物质，诸如分子、细胞、组织或器官(例如，造血干细胞或造血谱系细胞，诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、t细胞或b细胞)。外源性物质包括从外部来源提供至生物体或从其提取的经培养的物质的那些物质。
如本文使用的，术语“框架区”、“fr”或“fw区”包括与抗体或其抗原结合片段的可变区内的cdr相邻的氨基酸残基。fw区残基可以存在于例如人类抗体、人源化抗体、单克隆抗体、抗体片段、fab片段、单链抗体片段、scfv片段、抗体结构域和双特异性抗体，以及其他。
如本文使用的，术语“半衰期”是指身体内的抗体药物的血浆浓度降低一半或50％所需的时间。血清浓度的该50％降低反映了循环并且不被抗体清除的自然方法去除的药物的量。
如本文使用的，术语“造血干细胞”(“hsc”)是指具有自我更新和分化成包括不同谱系的成熟血细胞的能力的未成熟的血细胞，所述不同谱系包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，原巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如，nk细胞、b细胞和t细胞)。这样的细胞可以包括cd34+细胞。cd34+细胞是表达cd34细胞表面标志物的未成熟细胞。在人类中，cd34+细胞被认为包括具有上文定义的干细胞性质的细胞亚群，而在小鼠中，hsc是cd34-。此外，hsc还指长期重建hsc(lt-hsc)和短期重建hsc(st-hsc)。基于功能潜力和细胞表面标志物表达，lt-hsc和st-hsc是分化的。例如，人类hsc是cd34+、cd38-、cd45ra-、cd90+、cd49f+和lin-(对于成熟谱系标志物包括cd2、cd3、cd4、cd7、cd8、cd10、cd11b、cd19、cd20、cd56、cd235a呈阴性)。在小鼠中，骨髓lt-hsc是cd34-、sca-1+、c-kit+、cd135-、slamfl/cd150+、cd48-和lin-(对于成熟谱系标志物包括ter119、cd11b、gr1、cd3、cd4、cd8、b220、il7ra呈阴性)，而st-hsc是cd34+、sca-1+、c-kit+、cd135-、slamfl/cd150+和lin-(对于成熟谱系标志物包括ter119、cd11b、gr1、cd3、cd4、cd8、b220、il7ra呈阴性)。此外，在稳态条件下，st-hsc比lt-hsc更少地静止且更多地增殖。然而，lt-hsc具有更大的自我更新潜力(即，它们在整个成年期存活，并且可以通过连续接受者连续移植)，而st-hsc具有有限的自我更新(即，它们仅在有限的时间段内存活，并且不具有连续移植潜力)。这些hsc中的任一种可以用于本文描述的方法。st-hsc是特别有用的，因为它们是高度增殖性的，并且因此可以更快地产生分化的后代。
如本文使用的，术语“造血干细胞功能潜力”是指造血干细胞的功能性质，其包括1)多潜能性(其是指分化成多种不同血液谱系的能力，该血液谱系包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，原巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如，nk细胞、t细胞和b细胞))，2)自我更新(其是指造血干细胞产生与母细胞具有等同潜力的子细胞的能力，并且此外该能力可以在个体的整个寿命中反复发生而不衰竭)，以及3)造血干细胞或其后代被重新引入到移植接受者的能力，届时它们归巢到造血干细胞小生境，并且重建富有成效的和持续的造血作用。
如本文使用的，术语“人类抗体”是指这样的抗体，其中基本上蛋白质的每个部分(例如，所有cdr、框架区、cl结构域、ch结构域(例如，ch1、ch2、ch3)、铰链以及vl结构域和vh结构域)在人类中基本上是非免疫原性的，仅具有小的序列改变或变异。人类抗体可以在人类细胞中产生(例如，通过重组表达)或由能够表达功能重排的人类免疫球蛋白(诸如重链和/或轻链)基因的非人类的动物或原核细胞或真核细胞产生。当人类抗体是单链抗体时，它可以包括在天然人类抗体中不存在的接头肽。例如，fv可以含有连接重链的可变区和轻链的可变区的接头肽，诸如两个至约八个甘氨酸或其他氨基酸残基。这样的接头肽被认为是人类来源的。人类抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，所述方法包括使用源自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。人类抗体也可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。
“人源化”抗体是指含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列的非人类抗体。因此，非人类(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人类抗体的最小序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体含有基本上至少一个并且通常是两个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部cdr区对应于非人类免疫球蛋白的那些。全部或基本上全部fw区也可以是人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可以含有至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人类免疫球蛋白共有序列的恒定区。抗体人源化的方法是本领域已知的。
在一个实施方案中，人源化抗体是这样的人类抗体(接受者抗体)，其中来自接受者的cdr的残基被具有期望的特异性、亲和力和/或能力的来自非人类物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的cdr的残基代替。在一些情况下，人类抗体的框架区(fr)残基被对应的非人类残基代替。此外，人源化抗体可以包含接受者抗体或供体抗体中不存在的残基。可以进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上至少一个并且通常是两个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人类抗体的那些，并且全部或基本上全部fr是人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将含有至少一部分抗体恒定区(fc)，通常是人类免疫球蛋白的恒定区。对于另外的细节，参见jones等人,nature321:522-525(1986)；riechmann等人,nature332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。还参见以下综述文章和其中引用的参考文献：vaswani和hamilton,ann.allergy,asthma&immunol.1:105-115(1998)；harris,biochem.soc.transactions23:1035-1038(1995)；hurle和gross,curr.op.biotech.5:428-433(1994)。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用以指呈其基本上完整形式的抗体，而不是如本文定义的抗体片段。因此，对于igg抗体，完整抗体包含两条重链和两条轻链，每条重链包含可变区、恒定区和fc区，每条轻链包含可变区和恒定区。更具体地，完整igg包含两条轻链，每条轻链包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)，并且包含两条重链，每条重链包含重链可变区(vh)和三个重链恒定区(ch1、ch2和ch3)。ch2和ch3代表重链的fc区。
如本文使用的，术语“微管结合剂”是指通过破坏对有丝分裂和间期细胞功能所必需的微管网络而起作用的化合物。微管结合剂的实例包括，但不限于，美登素、美登木素生物碱及其衍生物，诸如本文描述的或本领域已知的那些；长春花生物碱，诸如长春花碱、硫酸长春花碱、长春新碱、硫酸长春新碱、长春地辛和长春瑞滨；紫杉烷，诸如多西他赛和紫杉醇；大环内酯类，诸如圆皮海绵内酯(discodermolides)、秋水仙碱(cochicine)和埃博霉素，及其衍生物，诸如埃博霉素b或其衍生物。紫杉醇作为
如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是藉以产生它的方法。
如本文使用的，术语“处于gvhd风险的患者”是指具有一个或更多个发展gvhd的风险因素的患者。风险因素包括但不限于：同种异体供体移植(例如，来自骨髓移植的造血干细胞的移植)，包括错配的人类白细胞抗原(hla)供体和性别错配的供体，t细胞充满的干细胞移植(tcellrepletestemcelltransplant)、供体和接受者年龄、移植供体或宿主中巨细胞病毒(cmv)或cmv抗体的存在、全身辐照(total-bodyirradiation)(tbi)剂量的增加、调节方案强度、急性gvhd预防、缺乏保护性环境、脾切除术、免疫球蛋白使用、潜在疾病、abo相容性、暴露于疱疹病毒之前、供体血液输注、表现评分、抗生素肠道去污以及同种异体移植后血液输注。
如本文使用的，术语“处于自身免疫性疾病风险的患者”是指具有一个或更多个发展自身免疫性疾病的风险因素的患者。风险因素包括但不限于：年龄(青年至中年)、性别(女性)、种族(非裔美国人、美国印第安人或拉丁美洲人)、自身免疫性疾病的家族史、暴露于环境因素、既往感染、慢性炎症和供体移植(例如，来自骨髓移植的造血干细胞的移植)。如本文使用的，术语“接受者”是指接受移植，诸如含有造血干细胞的群体的移植的患者。被施用至接受者的移植的细胞可以是例如自体细胞、同基因细胞或同种异体细胞。
如本文使用的，术语“样品”是指取自受试者的样本(例如，血液、血液组分(例如，血清或血浆)、尿液、唾液、羊水、脑脊液、组织(例如，胎盘或真皮)、胰液、绒毛膜绒毛样品和细胞)。
如本文使用的，术语“scfv”是指单链fv抗体，其中来自抗体的重链和轻链的可变结构域已经连接形成一条链。scfv片段含有单个多肽链，该多肽链包含由接头分离的抗体轻链的可变区(vl)(例如，cdr-l1、cdr-l2和/或cdr-l3)和抗体重链的可变区(vh)(例如，cdr-h1、cdr-h2和/或cdr-h3)。连接scfv片段的vl区和vh区的接头可以是包含蛋白原(proteinogenic)氨基酸的肽接头。可以使用可选择的接头以便增加scfv片段对蛋白水解降解的耐受性(例如，含有d-氨基酸的接头)，以便增强scfv片段的溶解度(例如，亲水接头诸如含有聚乙二醇的接头或含有重复甘氨酸和丝氨酸残基的多肽)，以改善分子的生物物理稳定性(例如，含有形成分子内或分子间二硫键的半胱氨酸残基的接头)，或以减弱scfv片段的免疫原性(例如，含有糖基化位点的接头)。本领域普通技术人员还将理解，本文描述的scfv分子的可变区可以被修饰，使得它们的氨基酸序列与它们源自的抗体分子的氨基酸序列不同。例如，可以在氨基酸残基处(例如，在cdr和/或框架残基中)进行导致保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取代，以便保存或增强scfv与被对应抗体识别的抗原结合的能力。
如本文使用的术语“特异性结合(specificbinding)”或“特异性地结合(specificallybinding)”是指抗体(或adc)识别和结合至特定蛋白质结构(表位)而不是一般地蛋白质的能力。如果抗体或adc对表位“a”是特异性的，则在含有标记的“a”和抗体的反应中，含有表位a的分子(或游离、未标记的a)的存在将减少与抗体或adc结合的标记的a的量。举例来说，如果抗体在标记时可以被对应的未标记的抗体竞争远离其靶，则抗体“特异性地结合”至靶。在一个实施方案中，如果抗体具有至少约10-4m、10-5m、10-6m、10-7m、10-8m、10.-9m、10-10m、10-11m、10-12m或更小(更小意指小于10-12的数，例如10-13)的对靶的kd，则抗体特异性地结合至靶，例如，cd137。在一个实施方案中，如本文使用的，术语“特异性结合至cd137(specificbindingtocd137)”或“特异性地结合至cd137(specificallybindingtocd137)”是指结合至cd137并且具有1.0×10-7m或更小的解离常数(kd)的抗体或adc，该解离常数如由表面等离子体共振确定的。在一个实施方案中，kd根据标准生物层干涉法(bli)确定。然而，应理解，抗体或adc可能能够特异性地结合至序列相关的两种或更多种抗原。例如，在一个实施方案中，抗体可以特异性地结合至cd137的人类和非人类(例如，小鼠或非人类灵长类动物)直系同源物两者。
如本文使用的，术语“受试者”和“患者”是指接受如本文描述的针对特定疾病或状况的治疗的生物体，诸如人类。例如，患者，诸如人类患者，可以在造血干细胞移植疗法之前接受治疗，以便通过施用如本文描述的能够结合cd137的抗体、其抗原结合片段或配体来治疗或预防gvhd。
如本文使用的，短语“基本上从血液中清除”是指在将治疗剂(诸如抗cd137抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体)施用至患者后的时间点，在该时间点，从患者分离的血液样品中的治疗剂的浓度使得治疗剂通过常规手段不能被检测到(例如，使得在用于检测治疗剂的装置或测定的噪声阈值之上不能检测到治疗剂)。本领域已知的多种技术可以用于检测抗体、抗体片段和蛋白质配体，诸如本领域已知的或本文描述的基于elisa的检测测定。可以用于检测抗体、抗体片段和蛋白质配体的另外的测定包括本领域已知的免疫沉淀技术和免疫印迹测定，以及其他。
如本文使用的，短语“干细胞紊乱”广泛地指可以通过调节受试者的靶组织和/或通过消融靶组织中的内源性干细胞群体(例如，消融来自受试者的骨髓组织中的内源性造血干细胞或祖细胞群体)和/或通过在受试者的靶组织中植入或移植干细胞来治疗或治愈的任何疾病、紊乱或状况。例如，i型糖尿病已经被示出通过造血干细胞移植被治愈，并且可以受益于根据本文描述的组合物和方法的调节。可以使用本文描述的组合物和方法治疗的另外的紊乱包括但不限于镰状细胞性贫血、地中海贫血、范科尼贫血、wiskott-aldrich综合征、adascid、hiv/aids、异染性脑白质营养不良、diamond-blackfan贫血和schwachman-diamond综合征。受试者可以患有或受以下影响：遗传性血液紊乱(例如，镰状细胞性贫血)或自身免疫性疾病。另外地或可选择地，受试者可以患有恶性肿瘤或受恶性肿瘤的影响，诸如选自由血液癌症(例如，白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或骨髓增生异常综合征)和成神经细胞瘤组成的组的恶性肿瘤。在一些实施方案中，受试者患有代谢紊乱或以其他方式受代谢紊乱的影响。例如，受试者可以罹患或以其他方式受选自由以下组成的组的代谢紊乱的影响：糖原贮积病、黏多糖贮积病、戈谢氏病、hurler病、鞘脂贮积病、异染性脑白质营养不良，或可以受益于本文公开的治疗和疗法的任何其他疾病或紊乱，并且所述其他疾病或紊乱包括但不限于重症综合性免疫缺陷、wiscott-aldrich综合征、高免疫球蛋白m(igm)综合征、chediak-higashi病、遗传性淋巴组织细胞增多症、骨硬化病、成骨不全症、贮积病、重型地中海贫血、镰状细胞病、系统性硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化，青少年类风湿性关节炎和在"bonemarrowtransplantationfornon-malignantdisease,"asheducationbook,1:319-338(2000)中描述的那些疾病或紊乱，其公开内容当其涉及可以通过施用造血干细胞移植疗法来治疗的病理学时通过引用以其整体并入本文。
如本文使用的，术语“罹患疾病”是指经历gvhd或自身免疫性疾病的受试者(例如，人类)。不意图将本发明限于任何特定迹象或症状，也不限于疾病。因此，意图本发明涵盖正在经历从亚临床疾病到充分发展的疾病的任何疾病范围的受试者，其中受试者表现出与gvhd或自身免疫性疾病相关的象征(例如，迹象和症状)中的至少一些。
如本文使用的，术语“转染”是指通常用于将外源性dna引入到原核或真核宿主细胞中的多种技术中的任一种，诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、deae-右旋糖酐转染以及类似技术。
如本文使用的，术语“移植”是指已经从其来源部位转移到接受者部位的任何器官、身体组织或细胞，或者这样做的行为。
如本文使用的，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理改变或紊乱，或者促进所治疗的患者中的有益表型。有益或期望的临床结果包括但不限于：cd137阳性细胞的细胞计数或相对浓度的降低、gvhd或自身免疫性疾病的细胞表现和临床表现的减少、促进外源性造血细胞在如本文描述的患者中的植入以及随后的造血干细胞移植疗法。另外的有益结果包括罹患gvhd或处于gvhd风险的造血干细胞的细胞计数或相对浓度的增加。本文描述的疗法的有益结果还可以包括在造血干细胞移植疗法后一种或更多种造血谱系细胞的细胞计数或相对浓度的增加，所述造血谱系细胞诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、t细胞或b细胞。
如本文使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以达到期望的结果或对gvhd或自身免疫性疾病具有效果的量。用于任何特定的患者的特定的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括：被治疗的紊乱和紊乱的严重程度；采用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间；施用途径；采用的特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与采用的特定化合物组合或巧合地使用的药物；以及本领域熟知的类似因素。剂量可以变化，并且可以以每日一次或更多次给药施用，持续一天或若干天。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可以被称为“vh”。轻链的可变结构域可以被称为“vl”。这些结构域通常是抗体最可变的部分，并且含有抗原结合位点(cdr)。
如本文使用的，术语“载体”包括核酸载体，诸如质粒、dna载体、质粒、rna载体、病毒或其他合适的复制子。本文描述的表达载体可以含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞的基因组中的另外的序列元件。可以用于表达本发明的抗体和抗体片段的某些载体包括含有指导基因转录的调节序列(诸如启动子和增强子区)的质粒。用于表达抗体和抗体片段的其他有用的载体含有增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mrna的稳定性或核输出的多核苷酸序列。这些序列元件可以包括例如5'和3'非翻译区和多腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本文描述的表达载体还可以含有编码用于选择含有这样的载体的细胞的标志物的多核苷酸。合适的标志物的实例包括编码对抗生素诸如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素和诺尔丝菌素的耐受性的基因。
如本文使用的，术语“烷基”是指在链中具有例如从1个至20个碳原子的直链或支链烷基基团。烷基基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、叔戊基、己基、异己基以及类似基团。
如本文使用的，术语“亚烷基”是指直链或支链二价烷基基团。二价位置可以在烷基链内的相同或不同原子上。亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基以及类似基团。
如本文使用的，术语“杂烷基”是指在链中具有例如从1个至20个碳原子并且在链中还含有一个或更多个杂原子(例如氧、氮或硫，以及其他)的直链或支链烷基基团。
如本文使用的，术语“杂亚烷基”是指直链或支链二价杂烷基基团。二价位置可以在杂烷基链内的相同或不同原子上。
如本文使用的，术语“烯基”是指在链中具有例如从2个至20个碳原子的直链或支链烯基基团。烯基基团的实例包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、叔丁烯基、己烯基以及类似基团。
如本文使用的，术语“亚烯基”是指直链或支链二价烯基基团。二价位置可以在烯基链内的相同或不同原子上。亚烯基的实例包括亚乙烯基、亚丙烯基、亚异丙烯基、亚丁烯基以及类似基团。
如本文使用的，术语“杂烯基”是指在链中具有例如从2个至20个碳原子并且在链中还含有一个或更多个杂原子(例如，氧、氮或硫，以及其他)的直链或支链烯基基团。
如本文使用的，术语“杂亚烯基”是指直链或支链二价杂烯基基团。二价位置可以在杂烯基链内的相同或不同原子上。
如本文使用的，术语“炔基”是指在链中具有例如从2个至20个碳原子的直链或支链炔基基团。炔基基团的实例包括炔丙基、丁炔基、戊炔基、己炔基以及类似基团。
如本文使用的，术语“亚炔基”是指直链或支链二价炔基基团。二价位置可以在炔基链内的相同或不同原子上。
如本文使用的，术语“杂炔基”是指在链中具有例如从2个至20个碳原子并且在链中还含有一个或更多个杂原子(例如，氧、氮或硫，以及其他)的直链或支链炔基基团。
如本文使用的，术语“杂亚炔基”是指直链或支链二价杂炔基基团。二价位置可以在杂炔基链内的相同或不同原子上。
如本文使用的，术语“环烷基”是指饱和的并且具有例如从3个至12个碳环原子的单环、或稠合、桥连、或螺多环环结构。环烷基基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[3.1.0]己烷以及类似基团。
如本文使用的，术语“环亚烷基”是指二价环烷基基团。二价位置可以在环结构内的相同或不同原子上。环亚烷基的实例包括环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基以及类似基团。
如本文使用的，术语“杂环烷基”是指饱和的并且每个环结构具有例如从3个至12个选自碳原子和选自例如氮、氧和硫以及其他的杂原子的环原子的单环、或稠合、桥连或螺多环环结构。环结构可以例如在碳、氮或硫环成员上含有一个或更多个氧代基团。
如本文使用的，术语“杂环亚烷基”是指二价杂环烷基基团。二价位置可以在环结构内的相同或不同原子上。
如本文使用的，术语“芳基”是指含有例如从6个至19个碳原子的单环或多环芳香族环体系。芳基基团包括但不限于苯基、芴基、萘基以及类似基团。
如本文使用的，术语“亚芳基”是指二价芳基基团。二价位置可以在相同或不同的原子上。
如本文使用的，术语“杂芳基”是指单环杂芳香族或双环或三环稠环杂芳香族基团。杂芳基基团包括吡啶基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,3,4-三嗪基、1,2,3-三嗪基、苯并呋喃基、[2,3-二氢]苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三唑基、异苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、3h-吲哚基、苯并咪唑基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹嗪基、喹唑啉基、酞嗪基、喹喔啉基、噌啉基、萘啶基、吡啶并[3,4-b]吡啶基、吡啶并[3,2-b]吡啶基、吡啶并[4,3-b]吡啶基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、5,6,7,8-四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢异喹啉基、嘌呤基、蝶啶基、咔唑基、呫吨基、苯并喹啉基以及类似基团。
如本文使用的，术语“杂亚芳基”是指二价杂芳基基团。二价位置可以在相同或不同的原子上。
除非另外受单独取代基的定义限制，否则前述化学部分，诸如“烷基”、“亚烷基”、“杂烷基”、“杂亚烷基”、“烯基”、“亚烯基”、“杂烯基”、“杂亚烯基”、“炔基”、“亚炔基”、“杂炔基”、“杂亚炔基”、“环烷基”、“环亚烷基”、“杂环烷基”、“杂环亚烷基”、“芳基”、“亚芳基”、“杂芳基”和“杂亚芳基”基团可以任选地例如被从1个至5个选自由以下组成的组的取代基取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、烷基杂芳基、烷基环烷基、烷基杂环烷基、氨基、铵基、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧基羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤甲基、氰基、羟基、巯基、硝基以及类似基团。取代可以包括邻近取代基经历闭环的情况，诸如邻位官能取代基的闭环，以形成例如通过闭环形成的内酰胺、内酯、环酐、缩醛、半缩醛、硫代缩醛、缩醛胺和半缩醛胺，例如，以提供保护基团。
详述
本发明提供了通过施用能够结合由造血细胞表达的抗原的抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体来预防和治疗移植物抗宿主疾病(gvhd)和自身免疫性疾病的方法。该施用可以引起针对宿主为反应性的外源性t细胞的群体的选择性耗尽。本发明部分地基于以下发现：能够结合cd137的抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体可以被施用至患者，以便预防和治疗gvhd和自身免疫性疾病，诸如由造血干细胞移植疗法引起的那些。
由于抗cd137抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体的施用，gvhd的预防和治疗可以在多种临床症状中表现出来(参见，例如，mcdonald,blood.127:1544-1440,2016，以及flowers等人,blood.125:606-615，它们的公开内容当它们分别涉及但不限于急性和慢性gvhd的可测量的临床特征时通过引用并入本文)。由于抗cd137抗体、其抗原结合片段或adc的施用，gvhd和自身免疫性疾病的预防和治疗可以在多种经验测量中表现出来。例如，cd137+阳性细胞的耗尽可以通过以下确定：通过本领域已知的荧光激活细胞分选(facs)分析方法以测量移植后时间段期间外周血中的cd137+白细胞计数，和/或通过测量骨髓抽吸样品中供体细胞对骨髓细胞的恢复。对接受者的外周血中的产生干扰素-γ(ifn-γ)的t细胞的计数可以评估抗cd137针对gvhd和自身免疫性疾病的功效。如由facs确定的免疫细胞群体的改变可以指示gvhd或自身免疫性疾病。最后，取自患者的基因生物标志物和蛋白质组生物标志物也可以指示gvhd或自身免疫性疾病。
以下的部分提供了对可以被施用至罹患gvhd或自身免疫性疾病或处于gvhd或自身免疫性疾病风险的患者的抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体，以及向患者施用这样的治疗剂的方法的描述。
抗cd137抗体和配体
本发明部分地基于以下发现；能够结合cd137(也被称为cdw137、tnfrsf9、4-1bb和ila)的抗体、其抗原结合片段和可溶性配体可以用作治疗剂，以预防和治疗罹患gvhd或自身免疫性疾病或处于gvhd或自身免疫性疾病风险的患者中的由于造血干细胞的gvhd。此外，已经发现结合cd137的配体，诸如人类cd137l，可以用作治疗剂以预防或治疗罹患gvhd或处于gvhd风险的患者。这些配体，诸如可溶性人类cd137，可以与效应结构域诸如fc结构域共价地结合，以便例如促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。
t细胞已经被示出表达cd137，因为该抗原是共刺激分子的跨膜tnf受体超家族，并且在多种造血细胞上表达，并且促进t细胞激活，并且调节t细胞的增殖和存活(参见，例如cannons等人,j.immunol.167:1313-1324,2001，其公开内容当其涉及cd137被t细胞表达时通过引用并入本文)。抗体、其抗原结合片段和配体可以使用本领域已知的和本文描述的技术来鉴定，诸如通过免疫、计算建模技术和体外选择方法，诸如下文描述的噬菌体展示和基于细胞的展示平台。
可以通过本文公开的方法用于预防和治疗gvhd或自身免疫性疾病的抗cd137抗体包括具有以下cdr中的一个或更多个或全部的那些抗体：
a.具有氨基酸序列stywis(seqidno:1)的cdr-h1；
b.具有氨基酸序列kiypgdsytnyspsfqg(seqidno:2)的cdr-h2；
c.具有氨基酸序列rgygifdy(seqidno:3)的cdr-h3；
d.具有氨基酸序列sgdnigdqyah(seqidno:4)的cdr-l1；
e.具有氨基酸序列qdknrps(seqidno:5)的cdr-l2；以及
f.具有氨基酸序列atytgfgslav(seqidno:6)的cdr-l3。
可以通过本文公开的方法用于预防和治疗gvhd和自身免疫性疾病的另外的抗cd137抗体包括具有以下cdr中的一个或更多个或全部的那些抗体：
a.具有氨基酸序列stywis(seqidno:1)的cdr-h1；
b.具有氨基酸序列kiypgdsytnyspsfqg(seqidno:2)的cdr-h2；
c.具有氨基酸序列rgygifdy(seqidno:3)的cdr-h3；
d.具有氨基酸序列sgdnigdqyah(seqidno:4)的cdr-l1；
e.具有氨基酸序列qdknrps(seqidno:5)的cdr-l2；以及
f.具有氨基酸序列stytfvgfttv(seqidno:7)的cdr-l3。
另外的抗cd137抗体包括具有以下cdr中的一个或更多个或全部的那些抗体：
a.具有氨基酸序列nsyais(seqidno:8)的cdr-h1；
b.具有氨基酸序列giipgfgtanyaqkfqg(seqidno:9)的cdr-h2；
c.具有氨基酸序列rkneedggfdh(seqidno:10)的cdr-h3；
d.具有氨基酸序列sgdnlgdyyas(seqidno:11)的cdr-l1；
e.具有氨基酸序列ddsnrps(seqidno:12)的cdr-l2；以及
f.具有氨基酸序列qtwdgtlhfv(seqidno:13)的cdr-l3。
另外的抗cd137抗体或adc包括具有以下cdr中的一个或更多个或全部的那些抗体：
a.具有氨基酸序列sdyymh(seqidno:14)的cdr-h1；
b.具有氨基酸序列visgsgsntyyadsvkg(seqidno:15)的cdr-h2；
c.具有氨基酸序列rlyaqfegdf(seqidno:16)的cdr-h3；
d.具有氨基酸序列sgdnigskyvs(seqidno:17)的cdr-l1；
e.具有氨基酸序列sdserps(seqidno:18)的cdr-l2；以及
f.具有氨基酸序列qswdgsisrv(seqidno:19)的cdr-l3。
前述抗体在例如美国专利第9,468,678号中描述，其公开内容当其涉及抗cd137抗体及其抗原结合片段时通过引用并入本文。在美国专利第9,468,678号中公开的抗体及其片段可以与本文公开的方法结合使用。
在另一个实施方案中，可以用于本文描述的方法和组合物(包括adc)的抗cd137抗体是鼠抗cd137抗体bbk2(thermofisher；ms621pabx)或包含对应于bbk2抗体的抗原结合区的抗cd137抗体。bbk2抗体(也可以被称为bbk-2抗体或抗4-1bb抗体)是与人类4-1bb重组蛋白(4-1bb也被称为cd137)的胞外域结合的小鼠单克隆抗体(igg1，κ)。在某些实施方案中，本公开内容的方法和组合物包括包含bbk2抗体的结合区(例如，cdr)的抗cd137抗体。在另一个实施方案中，本公开内容的方法和组合物包括竞争性地抑制bbk2抗体与其cd137上的表位结合的抗体。在某些实施方案中，抗cd137抗体是人源化bbk2或嵌合bbk2。
在一个实施方案中，本文描述的方法和组合物包括包含bbk2的可变重链和轻链区的嵌合抗cd137(ch-bbk2)抗体。在某些实施方案中，嵌合bbk2抗体是包含人类恒定区的igg1抗体。ch-bbk2的重链氨基酸序列在seqidno:23中描述，并且ch-bbk2的轻链氨基酸序列在seqidno:24中描述。重链序列和轻链序列中的每个的cdr区(cdr1、cdr2和cdr3)在下文用粗体描述。可变区是斜体的。
前述cdr区(和bbk2抗体)在lee等人(2002)europeanjofimmunogenetics29(5):449-452中描述。因此，在一个实施方案中，抗cd137抗体bbk2(包括ch-bbk2)的vhcdr氨基酸序列如下：sgytftsyw(vhcdr1；seqidno:33)；niypsdsyt(vhcdr2；seqidno:34)和trngvegyphyyame(vhcdr3；seqidno:35)。抗cd137抗体bbk2(包括ch-bbk2)的vlcdr氨基酸序列如下：sqdlsnh(vlcdr1；seqidno:36)；yyts(vlcdr2；seqidno:37)和cqqgytlpy(vlcdr3；seqidno:38)。
可选择地，bbk2的cdr区可以根据kabat编号定义。由kabat编号定义的cdr在下文中针对重链序列和轻链序列中的每个来描述(在下文中以粗体描述)。bbk2的可变区是斜体的。
因此，在一个实施方案中，抗cd137抗体bbk2(包括ch-bbk2)的vhcdr氨基酸序列如下：sywin(vhcdr1；seqidno:25)；niypsdsytnynqkfkd(vhcdr2；seqidno:26)和ngvegyphyyamey(vhcdr3；seqidno:27)，并且抗cd137抗体bbk2(包括ch-bbk2)的vlcdr氨基酸序列如下：rasqdlsnhly(vlcdr1；seqidno:29)；ytsrlhs(vlcdr2；seqidno:30)和qqgytlpyt(vlcdr3；seqidno:31)。
bbk2的重链可变区在seqidno:28中列出为qvqlqqpgaelvrpgasvklsckasgytftsywinwvkqrpgqglewigniypsdsytnynqkfkdkatltvdkssntvymqlnsptsedsavyyctrngvegyphyyameywgqgtsvtvss。bbk2的轻链可变区在seqidno:32中列出为diqmtqttsalsaslgdrvtigcrasqdlsnhlywyqqkpdgtvklliyytsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltirnleqedvatyfcqqgytlpytfgggtkleik。抗cd137抗体(包括抗cd137adc)可以包含分别在seqidno:28和32中列出的重链和轻链可变区氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗cd137抗体，例如嵌合(ch-bbk2)抗体或人源化bbk2抗体，包含重链可变区，该重链可变区包含含有seqidno:25的氨基酸序列的cdr1、含有seqidno:26的氨基酸序列的cdr2和含有seqidno:27的氨基酸序列的cdr3；并且包含轻链可变区，该轻链可变区包含含有seqidno:29的氨基酸序列的cdr1、含有seqidno:30的氨基酸序列的cdr2和含有seqidno:31的氨基酸序列的cdr3。
在一个实施方案中，抗cd137抗体，例如嵌合(ch-bbk2)抗体或人源化bbk2抗体，包含重链可变区，该重链可变区包含含有seqidno:33的氨基酸序列的cdr1、含有seqidno:34的氨基酸序列的cdr2和含有seqidno:35的氨基酸序列的cdr3；并且包含轻链可变区，该轻链可变区包含含有seqidno:36的氨基酸序列的cdr1、含有seqidno:37的氨基酸序列的cdr2和含有seqidno:38的氨基酸序列的cdr3。
因此，bbk2、人源化bbk2或嵌合bbk2抗体可以用于本文描述的抗cd137adc和方法。这些抗体中的每一种可以使用本领域已知的方法和本文描述的方法被缀合至下文描述的任何细胞毒素。
可以与本文描述的细胞毒素结合使用的其他抗cd137抗体可以使用本领域已知的技术(例如，杂交瘤产生)来鉴定。杂交瘤可以使用鼠系统来制备。用于融合的脾细胞的免疫以及随后分离的方案是本领域已知的。用于杂交瘤产生的融合配偶体和程序也是已知的。人类抗cd137抗体也可以在humab-
抗cd137抗体可以由分离的核酸分子产生，该分离的核酸分子包含编码由本公开内容提供的cd137结合分子的氨基酸序列的核苷酸序列。由核苷酸序列编码的氨基酸序列可以是抗体的任何部分，诸如cdr，包含一个、两个或三个cdr的序列，重链的可变区，轻链的可变区，或者可以是全长重链或全长轻链。本公开内容的核酸可以是例如dna或rna，并且可以包含或可以不包含内含子序列。通常，核酸是cdna分子。
除了抗体和抗原结合片段之外，可溶性cd137配体诸如人类cd137配体可以在造血干细胞移植疗法之前根据本文描述的方法被施用至患者以调节患者。例如，cd137配体诸如人类cd137配体可以被缀合至细胞毒素(例如，根据下文描述的或本领域已知的方法)或另一种效应分子诸如fc结构域。用于与本文描述的方法一起使用的美登素细胞毒素包括，例如，人类cd137配体-igg1fc缀合物、人类cd137配体-igg2fc缀合物、人类cd137配体-igg3fc缀合物、人类cd137配体-igg4fc缀合物、人类cd137配体-igafc缀合物、人类cd137配体-igefc缀合物、人类cd137配体-igmfc缀合物和人类cd137配体-igdfc缀合物。
用于与本文描述的组合物和方法结合使用的抗体和配体包括上文描述的那些抗体的变体，诸如含有或缺乏fc结构域的抗体片段，以及本文描述的非人类抗体的人源化变体，和含有本文描述的抗体、抗体片段或可溶性配体的一个或更多个或全部cdr或其等效区的抗体样蛋白支架(例如，10fn3结构域)。
鉴定抗体和配体的方法
用于高通量筛选能够结合cd137的分子的抗体、抗体片段和配体的文库的方法可以用于鉴定和例如可用于预防和治疗gvhd或自身免疫性疾病的亲和成熟的剂。这样的方法包括本领域已知的体外展示技术，诸如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、核糖体展示、mrna展示和cdna展示，以及其他。使用噬菌体展示来分离结合生物相关分子的抗体、抗原结合片段或配体已经在以下中综述：例如felici等人,biotechnol.annualrev.1:149-183,1995；katz,annualrev.biophys.biomol.struct.26:27-45,1997；和hoogenboom等人,immunotechnology4:1-20,1998，它们中的每一篇的公开内容当它们涉及体外展示技术时通过引用并入本文。已经构建随机组合肽文库以选择结合细胞表面抗原的多肽，如在kay,perspect.drugdiscoverydes.2:251-268,1995和kay等人,mol.divers.1:139-140,1996中描述的，它们中的每一篇的公开内容当它们涉及发现抗原结合分子时通过引用并入本文。蛋白质，诸如多聚体蛋白质，已经成功地被噬菌体展示为功能性分子(参见，例如，ep0349578；ep4527839；和ep0589877，以及chiswell和mccafferty,trendsbiotechnol.10:80-841992，它们中的每一篇的公开内容当它们涉及体外展示技术用于发现抗原结合分子时通过引用并入本文)。此外，功能性抗体片段诸如fab和scfv片段已经以体外展示形式被表达(参见，例如，mccafferty等人,nature348:552-554,1990；barbas等人,proc.natl.acad.sci.usa88:7978-7982,1991；和clackson等人，nature352:624-628,1991，它们中的每一篇的公开内容当它们涉及用于发现抗原结合分子的体外展示平台时通过引用并入本文)。人类抗cd137抗体也可以例如在humab-
除了体外展示技术之外，计算建模技术可以用于在计算机(insilico)中设计和鉴定抗cd137抗体、抗体片段和配体，例如，使用us2013/0288373中描述的程序，该专利的公开内容当其涉及用于鉴定抗cd137抗体的分子建模方法时并入本文。例如，使用计算建模技术，本领域技术人员可以在计算机中筛选能够结合cd137上的特异性表位诸如cd137的细胞外表位的分子的抗体、抗体片段和配体的文库。
可以使用另外的技术来鉴定结合细胞(例如，t细胞)表面上的cd137并且例如通过受体介导的胞吞被细胞内化的抗体、其抗原结合片段和配体。例如，上文描述的体外展示技术可以被修改以筛选结合造血干细胞表面上的cd137并且随后被内化的抗体、其抗原结合片段和配体。噬菌体展示代表一种这样的可以与该筛选范例结合使用的技术。为了鉴定结合cd137并且随后被造血干细胞内化的抗cd137抗体、其片段和配体，本领域技术人员可以使用在williams等人,leukemia19:1432-1438,2005中描述的噬菌体展示技术，该文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。例如，使用本领域已知的诱变方法，可以产生重组噬菌体文库，所述重组噬菌体文库编码抗体、抗体片段，诸如scfv片段、fab片段、双体、三体和10fn3结构域，以及其他，或者含有(例如，在一个或更多个或全部的cdr或其等效区中或者抗体或抗体片段中的)随机化氨基酸盒的配体。可以设计框架区、铰链、fc结构域和抗体或抗体片段的其他区，使得它们由于例如具有人类种系抗体序列或相对于人类种系抗体仅表现出微小变异的序列而在人类中是非免疫原性的。
使用本文描述的或本领域已知的噬菌体展示技术，例如，通过首先将噬菌体文库与封闭剂(诸如例如，乳蛋白、牛血清白蛋白和/或igg)一起孵育以便去除编码表现出非特异性蛋白质结合的抗体、其片段或配体的噬菌体，和编码结合fc结构域的抗体或其片段的噬菌体，并且然后将噬菌体文库与作为cd137+的造血干细胞的群体一起孵育，可以将含有与噬菌体颗粒共价结合的随机化抗体、抗体片段或配体的噬菌体文库与cd137抗原一起孵育。噬菌体文库可以与造血干细胞一起孵育，持续足以允许cd137特异性抗体、其抗原结合片段或配体结合细胞表面cd137并且随后被造血干细胞内化的时间(例如，在4℃从30分钟至6小时，诸如在4℃1小时)。含有对cd137未表现出足够亲和力以便允许与造血干细胞结合并且被其内化的抗体、其片段或配体的噬菌体随后可以通过例如用ph2.8的冷(4℃)的0.1m甘氨酸缓冲液洗涤细胞来去除。可以通过例如裂解细胞和从细胞培养基中回收内化的噬菌体来鉴定与已经被造血干细胞内化的抗体、其片段或配体结合的噬菌体。然后例如通过使用本领域已知的方法将细菌细胞与回收的噬菌体在2xyt培养基中孵育，可以在细菌细胞中扩增噬菌体。然后，从该培养基中回收的噬菌体可以通过例如确定插入噬菌体基因组中的编码抗体、其片段或配体的基因的核酸序列来表征。随后可以通过化学合成(例如，抗体片段诸如scfv片段或cd137配体的化学合成)或通过重组表达(例如，全长抗体的重组表达)从头制备编码的抗体、其片段或配体。
制备的抗体、其片段或配体的内化能力可以例如使用本领域已知的放射性核素内化测定来评估。例如，使用本文描述的或本领域已知的体外展示技术鉴定的抗cd137抗体、其片段或配体可以通过掺入放射性同位素来官能化，所述放射性同位素诸如18f、75br、77br、122i、123i、124i、125i、129i、131i、211at、67ga、111in、99tc、169yb、186re、64cu、67cu、177lu、77as、72as、86y、90y、89zr、212bi、213bi或225ac。例如，放射性卤素，诸如18f、75br、77br、122i、123i、124i、125i、129i、131i、211at，可以使用含有亲电卤素试剂的珠诸如聚苯乙烯珠(例如，iodinationbeads,thermofisherscientific,inc.,cambridge,ma)来掺入到抗体、其片段或配体中。放射性标记的抗体、其片段、adc或配体可以与造血干细胞一起孵育，持续足以允许内化的时间(例如，在4℃从30分钟至6小时，诸如在4℃1小时)。然后可以洗涤细胞以去除未内化的抗体或其片段(例如，使用ph2.8的冷(4℃)的0.1m甘氨酸缓冲液)。通过检测所得到的造血干细胞的发射辐射(例如，γ-辐射)与回收的洗涤缓冲液的发射辐射(例如，γ-辐射)相比，可以鉴定内化的抗体、其片段或配体。前述内化测定也可以用于表征adc。
抗体可以使用重组方法和组合物来产生，例如，在美国专利第4,816,567号中描述的。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗cd137抗体的分离的核酸。这样的核酸可以编码抗体的包含vl的氨基酸序列和/或包含vh的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另外的实施方案中，提供了包含这样的核酸的一种或更多种载体(例如，表达载体)。在另外的实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下转化)：(1)包含编码包含抗体的vl的氨基酸序列和包含抗体的vh的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的vl的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的vh的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴细胞(例如，y0细胞、ns0细胞、sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗cll-1抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码如上文提供的抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗cd137抗体，将例如，如上文描述的编码抗体的核酸(分离并且插入一种或更多种载体中，以用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。使用常规程序(例如，通过使用能够特异性地结合至编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以容易地分离这样的核酸和对这样的核酸测序。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文描述的原核细胞或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和fc效应物功能时。关于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如美国专利第5,648,237号、第5,789,199号和第5,840,523号。(还参见charlton,methodsinmolecularbiology,第248卷(b.k.c.lo,编著,humanapress,totowa,n.j.,2003),第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌(e.coli)中的表达)。在表达之后，抗体可以从细菌细胞浆(paste)中以可溶性级分分离，并且可以被进一步纯化。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是被sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人类胚胎肾系(293或293细胞，如例如在graham等人,j.genvirol.36:59(1977)中描述的)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠塞尔托利氏细胞(sertolicell)(tm4细胞，如例如在mather,biol.reprod.23:243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人类宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(brl3a)；人类肺细胞(w138)；人类肝细胞(hepg2)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562)；tri细胞，如例如在mather等人,annalsn.y.acad.sci.383:44-68(1982)中描述的；mrc5细胞；和fs4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub等人,proc.natl.acad.sci.usa77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如y0、ns0和sp2/0。关于某些适合于抗体产生的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，yazaki和wu，methodsinmolecularbiology,第248卷(b.k.c.lo,编著,humanapress,totowa,n.j.),第255-268页(2003)。
药物-抗体缀合物
细胞毒素
本文描述的抗体、其抗原结合片段和配体(例如，识别和结合cd137的抗体、其抗原结合片段和可溶性配体)可以被缀合(或连接)至细胞毒素，诸如微管结合剂(例如，美登素或美登木素生物碱)、鹅膏蕈毒素、假单胞菌外毒素a、debouganin、白喉毒素、诸如α-鹅膏蕈碱、皂草素(saporin)、奥瑞他汀(auristatin)、蒽环霉素、加利车霉素(calicheamicin)、伊立替康(irinotecan)、sn-38、倍癌霉素(duocarmycin)、吡咯并苯二氮卓类、吡咯并苯二氮卓类二聚体、吲哚并苯二氮卓类和吲哚并苯二氮卓类二聚体或其变体，或本文描述的或本领域已知的另一种细胞毒性化合物，以便在施用至患者后促进造血细胞诸如宿主反应性t细胞的耗尽。在一些实施方案中，细胞毒性分子被缀合至内化抗cd137抗体、其抗原结合片段或可溶性配体，使得在细胞摄取抗体、其片段或可溶性配体后，细胞毒素可以进入其细胞内靶并且介导造血细胞死亡。适合与本文描述的组合物和方法一起使用的另外的细胞毒素包括dna嵌入剂(例如，蒽环霉素)、能够破坏有丝分裂纺锤体的剂(例如，长春花生物碱、美登素、美登木素生物碱及其衍生物)、rna聚合酶抑制剂(例如，鹅膏蕈毒素，诸如α-鹅膏蕈碱及其衍生物)、能够破坏蛋白质生物合成的剂(例如，表现出rrnan-糖苷酶活性的剂，诸如皂草素和蓖麻毒蛋白a链)，以及本领域已知的其他。
美登木素生物碱
抗cd137抗体可以被缀合至作为微管结合剂的细胞毒素。在一些实施方案中，细胞毒素是美登素、美登木素生物碱或美登木素生物碱类似物。美登木素生物碱是阻止微管蛋白聚合的微管结合剂。合适的美登木素生物碱的实例包括美登醇的酯、合成的美登醇以及美登醇类似物和衍生物。包括抑制微管形成并且对哺乳动物细胞是高度毒性的任何药物，如美登木素生物碱、美登醇以及美登醇类似物和衍生物。
合适的美登醇酯的实例包括具有修饰的芳香族环的那些和在其他位置具有修饰的那些。这样的合适的美登木素生物碱在以下中公开：美国专利第4,137,230号；第4,151,042号；第4,248,870号；第4,256,746号；第4,260,608号；第4,265,814号；第4,294,757号；第4,307,016号；第4,308,268号；第4,308,269号；第4,309,428号；第4,313,946号；第4,315,929号；第4,317,821号；第4,322,348号；第4,331,598号；第4,361,650号；第4,362,663号；第4,364,866号；第4,424,219号；第4,450,254号；第4,322,348号；第4,362,663号；第4,371,533号；第5,208,020号；第5,416,064号；第5,475,092号；第5,585,499号；第5,846,545号；第6,333,410号；第7,276,497号和第7,473,796号，它们中的每一篇的公开内容当它们涉及美登木素生物碱及其衍生物时通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物(adc)利用含硫醇的美登木素生物碱(dm1)作为细胞毒性剂，该美登木素生物碱被正式称为n2′-脱乙酰基-n2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素。dm1由以下结构式表示：
在另一个实施方案中，本发明的缀合物利用含硫醇的美登木素生物碱n2′-脱乙酰基-n2′(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(例如，dm4)作为细胞毒性剂。dm4由以下结构式表示：
另一种包含含有空间位阻硫醇键的侧链的美登木素生物碱是n2′-脱乙酰基-n-2′(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(被称为dm3)，由以下结构式(iii)表示：
在美国专利第5,208,020号和第7,276,497号中教导的美登木素生物碱中的每一种也可以用于本发明的缀合物。在这方面，5,208,020和7,276,697的全部公开内容通过引用并入本文。
美登木素生物碱上的许多位置可以用作化学连接连接部分的位置。例如，具有羟基基团的c-3位、用羟甲基修饰的c-14位、用羟基修饰的c-15位和具有羟基基团的c-20位都预期是有用的。在一些实施方案中，c-3位用作化学连接连接部分的位置，并且在一些特定的实施方案中，美登醇的c-3位用作化学连接连接部分的位置。
本发明还包括美登木素生物碱和缀合物的各种异构体和混合物。本发明的某些化合物和缀合物可以以各种立体异构形式、对映体形式和非对映体形式存在。产生这样的抗体-美登木素生物碱缀合物的若干描述在美国专利第5,208,020号、第5,416,064号、第6,333,410号、第6,441,163号、第6,716,821号和第7,368,565号中提供，它们中的每一篇以其整体并入本文。
可以通过分光光度法测量252nm和280nm处的吸光度的比率确定每个抗体分子结合的美登木素生物碱分子的治疗有效数目。每个抗体分子缀合的平均3个至4个美登木素生物碱分子可以增强靶细胞的细胞毒性，而不会不利地影响抗体的功能或溶解度，尽管毒素/抗体的一个分子相比于单独的抗体可以增强细胞毒性。美登木素生物碱分子/抗体或其抗原结合片段或可溶性配体的平均数目可以是例如1-10或2-5。
鹅膏蕈毒素
在一些实施方案中，细胞毒素是鹅膏蕈毒素或其衍生物，诸如α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、鹅膏素酰胺、一羟鹅膏素酰胺、一羟鹅膏毒肽羧酸或羧基鹅膏毒肽酰胺原。例如，可以被缀合至本文描述的抗体、其抗原结合片段或可溶性配体的合适的细胞毒素包括由式(iv)表示的鹅膏蕈毒素或其衍生物
其中r1是h、oh、ora或orc；
r2是h、oh、orb或orc；
ra和rb与它们结合的氧原子一起组合形成任选地被取代的5元杂环烷基基团；
r3是h、rc或rd；
r4是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r5是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r6是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r7是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r8是oh、nh2、orc、ord、nhrc或nrcrd；
r9是h、oh、orc或ord；
x是-s-、-s(o)-或-so2-；
rc是l-z；
rd是任选地被取代的c1-c6烷基、任选地被取代的c1-c6杂烷基、任选地被取代的c2-c6烯基、任选地被取代的c2-c6杂烯基、任选地被取代的c2-c6炔基、任选地被取代的c2-c6杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的杂芳基；
l是接头，诸如任选地被取代的c1-c6亚烷基、任选地被取代的c1-c6杂亚烷基、任选地被取代的c2-c6亚烯基、任选地被取代的c2-c6杂亚烯基、任选地被取代的c2-c6亚炔基、任选地被取代的c2-c6杂亚炔基、任选地被取代的环亚烷基、任选地被取代的杂环亚烷基、任选地被取代的亚芳基或任选地被取代的杂亚芳基；并且
z是在l上存在的反应性取代基与结合cd137的抗体、其抗原结合片段或可溶性配体内存在的反应性取代基之间形成偶联反应的化学部分。
在一些实施方案中，细胞毒素含有一个rc取代基。
在一些实施方案中，细胞毒素是由式(iva)表示的鹅膏蕈毒素或其衍生物
其中r1是h、oh、ora或orc；
r2是h、oh、orb或orc；
ra和rb与它们结合的氧原子一起组合形成任选地被取代的5元杂环烷基基团；
r3是h、rc或rd；
r4是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r5是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r6是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r7是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r8是oh、nh2、orc、ord、nhrc或nrcrd；
r9是h、oh、orc或ord；
x是-s-、-s(o)-或-so2-；
rc是l-z；
rd是任选地被取代的c1-c6烷基、任选地被取代的c1-c6杂烷基、任选地被取代的c2-c6烯基、任选地被取代的c2-c6杂烯基、任选地被取代的c2-c6炔基、任选地被取代的c2-c6杂炔基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的杂芳基；
l是任选地被取代的c1-c6亚烷基、任选地被取代的c1-c6杂亚烷基、任选地被取代的c2-c6亚烯基、任选地被取代的c2-c6杂亚烯基、任选地被取代的c2-c6亚炔基、任选地被取代的c2-c6杂亚炔基、任选地被取代的环亚烷基、任选地被取代的杂环亚烷基、任选地被取代的亚芳基或任选地被取代的杂亚芳基；
z是在l上存在的反应性取代基与结合cd137的抗体、其抗原结合片段或可溶性配体内存在的反应性取代基之间形成偶联反应的化学部分；并且
其中细胞毒素含有一个rc取代基。
在一些实施方案中，ra和rb与它们结合的氧原子一起组合形成：
其中y选自o、s、nre和crere’，并且
re和re’各自独立地是任选地被取代的c1-c6亚烷基-rc、任选地被取代的c1-c6杂亚烷基-rc、任选地被取代的c2-c6亚烯基-rc、任选地被取代的c2-c6杂亚烯基-rc、任选地被取代的c2-c6亚炔基-rc、任选地被取代的c2-c6杂亚炔基-rc、任选地被取代的环亚烷基-rc、任选地被取代的杂环亚烷基-rc、任选地被取代的亚芳基-rc、或任选地被取代的杂亚芳基-rc。
在一些实施方案中，细胞毒素是由式(ia)表示的鹅膏蕈毒素或其衍生物，其中r1是h、oh、ora或orc；
r2是h、oh、orb或orc；
ra和rb与它们结合的氧原子一起组合形成：
r3是h或rc；
r4是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r5是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r6是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r7是h、oh、orc、ord、rc或rd；
r8是oh、nh2、orc或nhrc；
r9是h或oh；并且
其中rc和rd各自如上文定义的。与本文描述的缀合物结合使用的毒素包括含有由式(iva)表示的鹅膏蕈毒素或其衍生物的那些，
其中r1是h、oh、ora或orc；
r2是h、oh、orb或orc；
ra和rb与它们结合的氧原子一起组合形成：
r3是h或rc；
r4和r5各自独立地是h、oh、orc、rc或ord；
r6和r7各自是h；
r8是oh、nh2、orc或nhrc；
r9是h或oh；并且
其中rc是如上文定义的。
与本文描述的缀合物结合使用的毒素包括含有由式(iva)表示的鹅膏蕈毒素或其衍生物的那些，
其中r1是h、oh或ora；
r2是h、oh或orb；
ra和rb与它们结合的氧原子一起组合形成：
r3、r4、r6和r7各自是h；
r5是orc；
r8是oh或nh2；
r9是h或oh；并且
其中rc是如上文定义的。这样的鹅膏蕈毒素缀合物在例如美国专利申请公布第2016/0002298号中描述，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
与本文描述的缀合物结合使用的毒素包括含有由式(iva)表示的鹅膏蕈毒素或其衍生物的那些，
其中r1和r2各自独立地是h或oh；
r3是rc；
r4、r6和r7各自是h；
r5是h、oh或oc1-c6烷基；
r8是oh或nh2；
r9是h或oh；并且
其中rc是如上文定义的。这样的鹅膏蕈毒素缀合物在例如美国专利申请公布第2014/0294865号中描述，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
与本文描述的缀合物结合使用的毒素包括含有由式(ia)表示的鹅膏蕈毒素或其衍生物的那些，
其中r1和r2各自独立地是h或oh；
r3、r6和r7各自是h；
r4和r5各自独立地是h、oh、orc或rc；
r8是oh或nh2；
r9是h或oh；并且
其中rc是如上文定义的。这样的鹅膏蕈毒素缀合物在例如美国专利申请公布第2015/0218220号中描述，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
与本文描述的缀合物结合使用的毒素包括含有由式(iva)表示的鹅膏蕈毒素或其衍生物的那些，
其中r1和r2各自独立地是h或oh；
r3、r6和r7各自是h；
r4和r5各自独立地是h或oh；
r8是oh、nh2、orc或nhrc；
r9是h或oh；并且
其中rc是如上文定义的。这样的鹅膏蕈毒素缀合物在例如美国专利第9,233,173号和第9,399,681号中描述，它们中的每一篇的公开内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段被缀合至鹅膏蕈毒素诸如α-鹅膏蕈碱或其变体。例如，在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段(例如，识别和结合cd137的抗体或抗原结合片段)被缀合至由式(ii)表示的α-鹅膏蕈碱化合物：
其中x是s、so或so2；r1是h或与抗体、其抗原结合片段或配体共价结合的接头；并且r2是h或与抗体、其抗原结合片段或配体共价结合的接头；其中当r1是h时，r2是接头，并且当r2是h时，r1是接头。
在一些实施方案中，细胞毒素是α-鹅膏蕈碱。在一些实施方案中，α-鹅膏蕈碱是式iv的化合物。在一些实施方案中，式iv的α-鹅膏蕈碱经由接头l被附接至抗cd137抗体。接头l可以在若干个可能的位置中的任一个位置(例如，r1-r9中的任一个)被附接至式iv的α-鹅膏蕈碱。在一些实施方案中，接头在位置r1处附接。在一些实施方案中，接头在位置r2处附接。在一些实施方案中，接头在位置r3处附接。在一些实施方案中，接头在位置r4处附接。在一些实施方案中，接头在位置r5处附接。在一些实施方案中，接头在位置r6处附接。在一些实施方案中，接头在位置r7处附接。在一些实施方案中，接头在位置r8处附接。在一些实施方案中，接头在位置r9处附接。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
在一些实施方案中，细胞毒素是β-鹅膏蕈碱。在一些实施方案中，β-鹅膏蕈碱是式iv的化合物。在一些实施方案中，式iv的β-鹅膏蕈碱经由接头l被附接至抗cd137抗体。接头l可以在若干个可能的位置中的任一个位置(例如，r1-r9中的任一个)被附接至式iv的β-鹅膏蕈碱。在一些实施方案中，接头在位置r1处附接。在一些实施方案中，接头在位置r2处附接。在一些实施方案中，接头在位置r3处附接。在一些实施方案中，接头在位置r4处附接。在一些实施方案中，接头在位置r5处附接。在一些实施方案中，接头在位置r6处附接。在一些实施方案中，接头在位置r7处附接。在一些实施方案中，接头在位置r8处附接。在一些实施方案中，接头在位置r9处附接。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
在一些实施方案中，细胞毒素是γ-鹅膏蕈碱。在一些实施方案中，γ-鹅膏蕈碱是式iv的化合物。在一些实施方案中，式iv的γ-鹅膏蕈碱经由接头l被附接至抗cd137抗体。接头l可以在若干个可能的位置中的任一个位置(例如，r1-r9中的任一个)被附接至式iv的γ-鹅膏蕈碱。在一些实施方案中，接头在位置r1处附接。在一些实施方案中，接头在位置r2处附接。在一些实施方案中，接头在位置r3处附接。在一些实施方案中，接头在位置r4处附接。在一些实施方案中，接头在位置r5处附接。在一些实施方案中，接头在位置r6处附接。在一些实施方案中，接头在位置r7处附接。在一些实施方案中，接头在位置r8处附接。在一些实施方案中，接头在位置r9处附接。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
在一些实施方案中，细胞毒素是ε-鹅膏蕈碱。在一些实施方案中，ε-鹅膏蕈碱是式iv的化合物。在一些实施方案中，式iv的ε-鹅膏蕈碱经由接头l被附接至抗cd137抗体。接头l可以在若干个可能的位置中的任一个位置(例如，r1-r9中的任一个)被附接至式iv的ε-鹅膏蕈碱。在一些实施方案中，接头在位置r1处附接。在一些实施方案中，接头在位置r2处附接。在一些实施方案中，接头在位置r3处附接。在一些实施方案中，接头在位置r4处附接。在一些实施方案中，接头在位置r5处附接。在一些实施方案中，接头在位置r6处附接。在一些实施方案中，接头在位置r7处附接。在一些实施方案中，接头在位置r8处附接。在一些实施方案中，接头在位置r9处附接。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
在一些实施方案中，细胞毒素是鹅膏素。在一些实施方案中，鹅膏素是式iv的化合物。在一些实施方案中，式iv的鹅膏素经由接头l被附接至抗cd137抗体。接头l可以在若干个可能的位置中的任一个位置(例如，r1-r9中的任一个)被附接至式iv的鹅膏素。在一些实施方案中，接头在位置r1处附接。在一些实施方案中，接头在位置r2处附接。在一些实施方案中，接头在位置r3处附接。在一些实施方案中，接头在位置r4处附接。在一些实施方案中，接头在位置r5处附接。在一些实施方案中，接头在位置r6处附接。在一些实施方案中，接头在位置r7处附接。在一些实施方案中，接头在位置r8处附接。在一些实施方案中，接头在位置r9处附接。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
在一些实施方案中，细胞毒素是鹅膏素酰胺。在一些实施方案中，鹅膏素酰胺是式iv的化合物。在一些实施方案中，式iv的鹅膏素酰胺经由接头l被附接至抗cd137抗体。接头l可以在若干个可能的位置中的任一个位置(例如，r1-r9中的任一个)被附接至式iv的鹅膏素酰胺。在一些实施方案中，接头在位置r1处附接。在一些实施方案中，接头在位置r2处附接。在一些实施方案中，接头在位置r3处附接。在一些实施方案中，接头在位置r4处附接。在一些实施方案中，接头在位置r5处附接。在一些实施方案中，接头在位置r6处附接。在一些实施方案中，接头在位置r7处附接。在一些实施方案中，接头在位置r8处附接。在一些实施方案中，接头在位置r9处附接。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
在一些实施方案中，细胞毒素是一羟鹅膏素酰胺。在一些实施方案中，一羟鹅膏素酰胺是式iv的化合物。在一些实施方案中，式iv的一羟鹅膏素酰胺经由接头l被附接至抗cd137抗体。接头l可以在若干个可能的位置中的任一个位置(例如，r1-r9中的任一个)被附接至式iv的一羟鹅膏素酰胺。在一些实施方案中，接头在位置r1处附接。在一些实施方案中，接头在位置r2处附接。在一些实施方案中，接头在位置r3处附接。在一些实施方案中，接头在位置r4处附接。在一些实施方案中，接头在位置r5处附接。在一些实施方案中，接头在位置r6处附接。在一些实施方案中，接头在位置r7处附接。在一些实施方案中，接头在位置r8处附接。在一些实施方案中，接头在位置r9处附接。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
在一些实施方案中，细胞毒素是一羟鹅膏毒肽羧酸。在一些实施方案中，一羟鹅膏毒肽羧酸是式iv的化合物。在一些实施方案中，式iv的一羟鹅膏毒肽羧酸经由接头l被附接至抗cd137抗体。接头l可以在若干个可能的位置中的任一个位置(例如，r1-r9中的任一个)被附接至式iv的一羟鹅膏毒肽羧酸。在一些实施方案中，接头在位置r1处附接。在一些实施方案中，接头在位置r2处附接。在一些实施方案中，接头在位置r3处附接。在一些实施方案中，接头在位置r4处附接。在一些实施方案中，接头在位置r5处附接。在一些实施方案中，接头在位置r6处附接。在一些实施方案中，接头在位置r7处附接。在一些实施方案中，接头在位置r8处附接。在一些实施方案中，接头在位置r9处附接。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
在一些实施方案中，细胞毒素是羧基鹅膏毒肽酰胺原。在一些实施方案中，羧基鹅膏毒肽酰胺原是式iv的化合物。在一些实施方案中，式iv的羧基鹅膏毒肽酰胺原经由接头l被附接至抗cd137抗体。接头l可以在若干个可能的位置中的任一个位置(例如，r1-r9中的任一个)被附接至式iv的羧基鹅膏毒肽酰胺原。在一些实施方案中，接头在位置r1处附接。在一些实施方案中，接头在位置r2处附接。在一些实施方案中，接头在位置r3处附接。在一些实施方案中，接头在位置r4处附接。在一些实施方案中，接头在位置r5处附接。在一些实施方案中，接头在位置r6处附接。在一些实施方案中，接头在位置r7处附接。在一些实施方案中，接头在位置r8处附接。在一些实施方案中，接头在位置r9处附接。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
用于与本文描述的组合物和方法一起使用的抗体、抗原结合片段和配体可以使用本领域已知的或本文描述的缀合技术被缀合至鹅膏蕈毒素诸如α-鹅膏蕈碱或其变体。例如，识别和结合cd137的抗体、其抗原结合片段和配体可以被缀合至α-鹅膏蕈碱或其变体，如在us2015/0218220中描述的，该专利的公开内容当其涉及例如鹅膏蕈毒素诸如α-鹅膏蕈碱及其变体以及可以用于共价缀合的共价接头时通过引用并入本文。
与本文描述的方法结合使用的示例性抗体-药物缀合物和配体-药物缀合物可以通过使抗体、其抗原结合片段或配体与缀合至含有适合于与抗体、其抗原结合片段或配体上的反应性残基反应的取代基的接头的鹅膏蕈毒素反应来形成。缀合至含有适合于与抗体、其抗原结合片段或配体上的反应性残基反应的取代基的接头的鹅膏蕈毒素包括但不限于，7'c-(4-(6-(马来酰亚胺基)己酰基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(6-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)己酰基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷羰基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(6-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)己酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(3-羧基丙酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(4-(马来酰亚胺基)丁酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(马来酰亚胺基)乙酰基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(3-(马来酰亚胺基)丙酰基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(4-(马来酰亚胺基)丁酰基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(3-((6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)甲基)吡咯烷-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(3-((6-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)己酰胺基)甲基)吡咯烷-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(3-((4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)甲基)吡咯烷-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(3-((6-((4-(马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)甲基)吡咯烷-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(6-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)己酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(4-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)丁酰胺基)乙基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(4-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)丁酰基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(6-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)己酰基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(6-(马来酰亚胺基)己酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；(r)-7'c-((3-((6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；(s)-7'c-((3-((6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(6-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)己酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(6-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)己酰胺基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-((6-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)己酰胺基)-s-甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-((6-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)己酰胺基)-r-甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-((4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)-s-甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-((4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)-r-甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-((6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(3-羧基丙酰胺基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(6-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)己酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(马来酰亚胺基)乙酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(3-(马来酰亚胺基)丙酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(4-(马来酰亚胺基)丁酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(2-(马来酰亚胺基)乙酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(4-(马来酰亚胺基)丁酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-((6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-(2-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)乙基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-((4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-(2-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)乙基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-(2-(6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)乙基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(((2-(6-(马来酰亚胺基)-n-甲基己酰胺基)乙基)(甲基)氨基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(((4-(6-(马来酰亚胺基)-n-甲基己酰胺基)丁基(甲基)氨基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((2-(2-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)乙基)氮杂环丙烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((2-(2-(6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)乙基)氮杂环丙烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(6-(6-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)己酰胺基)己酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(1-(氨基氧基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十七烷-17-酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)乙酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(3-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)丙酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(4-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)丁酰基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(6-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)己酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(2-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(4-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)丁酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(20-(氨基氧基)-4,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,18-二氮杂二十烷基(diazaicosyl))哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(((2-(6-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)-n-甲基己酰胺基)乙基)(甲基)氨基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(((4-(6-(2-(氨基氧基)乙酰胺基)-n-甲基己酰胺基)丁基)(甲基)氨基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-((6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)甲基)吡咯烷-1-基)-s-甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((3-((6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己酰胺基)-r-甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；7'c-((4-(2-(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺基)乙基)哌啶-1-基)甲基)-鹅膏蕈毒素；6'o-(6-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)己基)-鹅膏蕈毒素；6'o-(5-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)戊基)-鹅膏蕈毒素；6'o-(2-((6-(马来酰亚胺基)己基)氧基)-2-氧代乙基)-鹅膏蕈毒素；6'o-((6-(马来酰亚胺基)己基)氨基甲酰基)-鹅膏蕈毒素；6'o-((6-(4-((马来酰亚胺基)甲基)环己烷甲酰胺基)己基)氨基甲酰基)-鹅膏蕈毒素；6'o-(6-(2-溴乙酰胺基)己基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(6-(叠氮基)己酰胺基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(己-5-炔酰基氨基)哌啶-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)乙基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；7'c-(4-(2-(6-(6-(马来酰亚胺基)己酰胺基)己酰胺基)乙基)哌嗪-1-基)-鹅膏蕈毒素；6'o-(6-(6-(11,12-二脱氢-5,6-二氢-二苯并[b,f]氮杂环辛(azocin)-5-基)-6-氧代己酰胺基)己基)-鹅膏蕈毒素；6'o-(6-(己-5-炔酰基氨基)己基)-鹅膏蕈毒素；6'o-(6-(2-(氨基氧基)乙酰基酰胺基)己基)-鹅膏蕈毒素；6'o-((6-氨基氧基)己基)-鹅膏蕈毒素；和6'o-(6-(2-碘乙酰胺基)己基)-鹅膏蕈毒素。前述接头以及与本文描述的组合物和方法结合使用的其他接头在例如美国专利申请公布第2015/0218220号中描述，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
可以被缀合至用于治疗gvhd或自身免疫性疾病的识别并结合cd137的抗体、其抗原结合片段和配体的另外的细胞毒素包括但不限于，5-乙炔基尿嘧啶、阿比特龙、酰基富烯(acylfulvene)、阿的培诺(adecypenol)、阿多来新(adozelesin)、阿地白介素、六甲蜜胺、氨莫司汀(ambamustine)、艾美多(amidox)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)、氨柔比星(amrubicin)、安吖啶、阿那格雷(anagrelide)、阿那曲唑(anastrozole)、穿心莲内酯、血管生成抑制剂、安雷利克斯(antarelix)、抗背部化形态发生蛋白-1、抗雄激素、前列腺癌、抗雌激素、抗新普拉通(antineoplaston)、反义寡核苷酸、甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolinglycinate)、凋亡基因调节剂、凋亡调节剂、脱嘌呤核酸、奥沙那宁(asulacrine)、阿他美坦(atamestane)、阿莫司汀(atrimustine)、阿新司坦汀1(axinastatin1)、阿新司坦汀2(axinastatin2)、阿新司坦汀3(axinastatin3)、阿扎司琼(azasetron)、阿扎托新(azatoxin)、重氮酪氨酸、巴卡亭iii衍生物(baccatiniiiderivatives)、班兰诺(balanol)、巴马司他(batimastat)、bcr/abl拮抗剂、苯并二氢卟酚(benzochlorins)、苯甲酰基星形孢菌素(benzoylstaurosporine)、β内酰胺衍生物、β-阿立辛(beta-alethine)、β可来霉素b(betaclamycinb)、桦木酸、bfgf抑制剂、比卡鲁胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、双氮丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)、双奈法德(bisnafide)、bistratenea、比折来新(bizelesin)、比锐来特(breflate)、博来霉素a2、博来霉素b2、溴匹立明(bropirimine)、布多替钛(budotitane)、丁硫氨酸亚砜亚胺、卡泊三醇、钙磷酸蛋白c(calphostinc)、喜树碱衍生物(例如，10-羟基-喜树碱)、卡培他滨(capecitabine)、甲酰胺-氨基三唑(carboxamide-amino-triazole)、羧酰胺基三唑(carboxyamidotriazole)、卡折来新(carzelesin)、酪蛋白激酶抑制剂、栗树精胺、杀菌肽b(cecropinb)、西曲瑞克(cetrorelix)、二氢卟吩、氯喹喔啉磺胺、西卡前列素(cicaprost)、顺式卟啉、克拉屈滨(cladribine)、氯米芬及其类似物、克霉唑、collismycina、collismycinb、考布他汀a4(combretastatina4)、考布他汀类似物、康纳京尼(conagenin)、卡那贝西汀816(crambescidin816)、克里斯托(crisnatol)、念珠藻环肽8、念珠藻环肽a衍生物、卡拉新a(curacina)、环戊蒽醌、环普兰姆(cycloplatam)、西匹霉素(cypemycin)、十八烷基磷酸阿糖胞苷(cytarabineocfosfate)、溶细胞因子、磷酸己烷雌酚(cytostatin)、达昔单抗、地西他滨、脱氢膜海鞘素b、2'脱氧柯福霉素(2'deoxycoformycin)(dcf)、地洛瑞林(deslorelin)、右异环磷酰胺(dexifosfamide)、右雷佐生(dexrazoxane)、右维拉帕米(dexverapamil)、地吖醌(diaziquone)、膜海鞘素b、地多西(didox)、二乙基降精胺(diethylnorspermine)、二氢-5-氮杂胞苷(dihydro-5-azacytidine)、二氢紫杉醇(dihydrotaxol)、二恶霉素(dioxamycin)、二苯基螺莫司汀、圆皮海绵内酯、二十二烷醇(docosanol)、多拉司琼、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、屈大麻酚、倍癌霉素sa(duocarmycinsa)、依布硒啉、依考莫司汀、依地福新、依决洛单抗、依氟鸟氨酸(eflornithine)、榄香烯、乙嘧替氟、埃博霉素、epithilones、爱普列特(epristeride)、雌莫司汀及其类似物、依托泊苷、依托泊苷4'-磷酸酯(也被称为etopofos)、依西美坦、法倔唑、法扎拉滨、维甲酰酚胺(fenretinide)、非格司亭、非那雄胺(finasteride)、夫拉平度(flavopiridol)、氟卓斯汀(flezelastine)、夫斯特隆(fluasterone)、氟达拉滨、盐酸氟道诺霉素(fluorodaunorunicinhydrochloride)、福酚美克(forfenimex)、福美司坦(formestane)、福司曲星(fostriecin)、福莫司汀(fotemustine)、钆德卟啉(gadoliniumtexaphyrin)、硝酸镓、加洛他滨(galocitabine)、加尼瑞克(ganirelix)、明胶酶抑制剂、吉西他滨、谷胱甘肽抑制剂、和普苏姆(hepsulfam)、高三尖杉酯碱(homoharringtonine)(hht)、金丝桃素、伊班膦酸、艾多昔芬(idoxifene)、伊决孟酮(idramantone)、伊莫福新(ilmofosine)、伊洛马司他(ilomastat)、咪唑吖啶酮(imidazoacridones)、咪喹莫特(imiquimod)、免疫刺激肽、碘苄胍、碘多柔比星、甘薯醇、伊立替康、伊罗普拉(iroplact)、伊索拉定(irsogladine)、异苯胍唑(isobengazole)、jasplakinolide、kahalalidef、三醋酸层状素n(lamellarin-ntriacetate)、兰乐肽(lanreotide)、leinamycin、来格司亭(lenograstim)、硫酸香菇多糖(lentinansulfate)、雷托他汀(leptolstatin)、来曲唑(letrozole)、亲脂性铂类化合物、立索克林酰胺7(lissoclinamide7)、洛铂、洛美曲索(lometrexol)、氯尼达明(lonidamine)、洛索蒽醌(losoxantrone)、洛索立宾(loxoribine)、勒托替康(lurtotecan)、镥德卟啉(lutetiumtexaphyrin)、立索茶碱(lysofylline)、马索罗酚、丝抑蛋白(maspin)、基质金属蛋白酶抑制剂、美诺立尔(menogaril)、rnerbarone、美替瑞林(meterelin)、甲硫氨酸酶、甲氧氯普胺、mif抑制剂、米非司酮(ifepristone)、米替福新(miltefosine)、米立司亭(mirimostim)、光辉霉素(mithracin)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴卫矛醇、丝裂霉素及其类似物、米托萘胺(mitonafide)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫法罗汀(mofarotene)、莫拉司亭(molgramostim)、mycaperoxideb、美瑞泡仁(myriaporone)、n-乙酰基地那林(n-acetyldinaline)、n-取代苯甲酰胺、那法瑞林(nafarelin)、纳格瑞替(nagrestip)、纳普维(napavin)、萘特非(naphterpin)、那托司亭(nartograstim)、奈达铂(nedaplatin)、奈莫柔比星(nemorubicin)、奈立膦酸、尼鲁米特(nilutamide)、丽沙霉素(nisamycin)、里挫林(nitrullyn)、奥曲肽(octreotide)、奥克恩(okicenone)、奥那司酮(onapristone)、昂丹司琼(ondansetron)、奥拉新(oracin)、奥马铂(ormaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、厄诺霉素(oxaunomycin)、紫杉醇及其类似物、帕诺明(palauamine)、十六酰基根霉素(palmitoylrhizoxin)、帕米膦酸、人参炔三醇、帕诺米芬(panomifene)、帕拉贝新(parabactin)、帕折普汀(pazelliptine)、培门冬酶(pegaspargase)、皮地新(peldesine)、戊聚糖聚硫酸钠、喷司他丁(pentostatin)、喷唑(pentrozole)、潘氟隆(perflubron)、培磷酰胺、苯连氮霉素(phenazinomycin)、皮西板尼(picibanil)、吡柔比星(pirarubicin)、吡曲克辛(piritrexim)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂、雷替曲塞(raltitrexed)、根霉素、罗谷亚胺(rogletimide)、罗希吐碱、鲁滨吉隆b1(rubiginoneb1)、鲁泊塞(ruboxyl)、沙芬戈(safingol)、圣特平(saintopin)、沙卡弗托a(sarcophytola)、沙格司亭(sargramostim)、索布佐生(sobuzoxane)、索纳明(sonermin)、斯帕磷酸、斯皮卡霉素d(spicamycind)、螺莫司汀(spiromustine)、斯替皮米德(stipiamide)、sulfinosine、他莫司汀(tallimustine)、替加氟(tegafur)、替莫唑胺、替尼泊苷、噻立拉斯汀(thaliblastine)、噻考瑞林(thiocoraline)、替拉扎明(tirapazamine)、拓扑替康(topotecan)、托普升替(topsentin)、曲西立滨(triciribine)、三甲曲沙(trimetrexate)、凡拉明、长春瑞滨(vinorelbine)、维萨汀(vinxaltine)、伏罗唑(vorozole)、折尼铂(zeniplatin)和亚苄维c(zilascorb)，以及其他。
用于化学缀合的接头
多种接头可以用于将本文描述的抗体、抗原结合片段和配体(例如，识别和结合cd137的抗体、其抗原结合片段和可溶性配体)与细胞毒性分子缀合。合适的接头包括可以通过以下裂解的那些：通过例如酶促水解、光解、在酸性条件下水解、在碱性条件下水解、氧化、二硫化物还原、亲核裂解或有机金属裂解(参见，例如，leriche等人,bioorg.med.chem.,20:571-582,2012，其公开内容当其涉及适合于共价缀合的接头时通过引用并入本文)。可用于合成药物-抗体缀合物和药物-配体缀合物的接头的实例包括，含有适合于与抗体、抗原结合片段和配体内存在的亲核取代基(诸如胺和硫醇部分)反应的亲电体的那些，该亲电体诸如迈克尔(michael)受体(例如，马来酰亚胺)、活化酯、缺电子羰基化合物和醛，以及其他。例如，适合于合成药物-抗体缀合物和药物-配体缀合物的接头包括但不限于，琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-羧酸酯(smcc)、n-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(sia)、磺基-smcc、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-n-hydroxysuccinimidylester)(mbs)、磺基-mbs和琥珀酰亚胺基碘乙酸酯，以及其他，它们在例如liu等人，18:690-697,1979中描述，其公开内容当其涉及用于化学缀合的接头时通过引用并入本文。另外的接头包括对于微管破坏剂诸如奥瑞他汀的缀合特别有用、由doronina等人,bioconjugatechem.17:14-24,2006描述的不可裂解的马来酰亚胺基己酰基接头，该文献的公开内容当其涉及用于化学缀合的接头时通过引用并入本文。适合于合成如本文描述的药物-抗体缀合物和药物-配体缀合物的另外的接头包括能够通过1,6-消除过程释放细胞毒素的那些，诸如对氨基苄醇(pabc)、6-马来酰亚胺基己酸、ph敏感性碳酸酯和在jain等人,pharm.res.32:3526-3540,2015中描述的其他试剂，该文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。
可以用于将抗体、其抗原结合片段或配体与细胞毒性剂缀合的接头包括那些接头：其在接头的一个末端与细胞毒性剂共价结合，并且在接头的另一个末端含有由接头上存在的反应性取代基与在结合cd137的抗体、其抗原结合片段或配体内存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分。可以存在于结合cd137的抗体、其抗原结合片段或配体内的反应性取代基包括但不限于，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基部分；赖氨酸残基的氨基部分；天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基部分；和半胱氨酸残基的硫醇部分，以及非天然存在的氨基酸的炔丙基、叠氮基、卤代芳基(例如，氟芳基)、卤代杂芳基(例如，氟杂芳基)、卤代烷基和卤代杂烷基部分。与本文描述的抗体-药物缀合物和配体-缀合物结合使用的接头包括但不限于，含有通过如下表1中描绘的偶联反应形成的化学部分的接头。曲线分别表示抗体、抗原结合片段或配体和细胞毒性分子的附接点。
表1.通过在抗体-药物缀合物的形成中的偶联反应形成的示例性化学部分
在一些实施方案中，adc包含经由接头缀合至毒素的抗cd137抗体，其中接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基基团(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab-cit-val。在一些实施方案中，接头包括部分pab-ala-val。在一些实施方案中，接头包括–((c＝o)(ch2)n–单元，其中n是从1-6的整数。在一些实施方案中，接头是–pab-cit-val-((c＝o)(ch2)n–。在一些实施方案中，接头是–pab-ala-val-((c＝o)(ch2)n–。
抗体药代动力学概况
在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或药物-抗体缀合物具有确定的血清半衰期。可用于本文的方法的抗体、其抗原结合片段和缀合物包括具有例如从1小时-24小时的血清半衰期的那些。在一些实施方案中，当循环抗体的水平处于治疗有效水平时，在抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物之前、同时或之后施用移植。通过测量血清水平的药代动力学分析可以通过本领域已知的测定来进行。
施用和给药的途径
本文描述的抗体、其抗原结合片段、adc和配体可以以多种剂型被施用至患者(例如，罹患gvhd或自身免疫性疾病或处于gvhd或自身免疫性疾病风险的人类患者)。例如，本文描述的抗体、其抗原结合片段、adc和配体可以以水性溶液诸如含有一种或更多种药学上可接受的赋形剂的水性溶液的形式被施用至罹患gvhd或处于gvhd风险的患者。用于与本文描述的组合物和方法一起使用的合适的药学上可接受的赋形剂包括粘度调节剂。水性溶液可以使用本领域已知的技术进行灭菌。
包含如本文描述的抗cd137adc的药物制剂通过将这样的adc与一种或更多种任选的药学上可接受的载体(remington'spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.编著(1980))混合来制备，呈冻干制剂或水性溶液的形式。药学上可接受的载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)。
本文描述的抗体、抗原结合片段、adc和配体可以通过多种途径施用，所述多种途径诸如口服、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、眼内或肠胃外。在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于所施用的特定抗体、抗原结合片段或adc、患者、药物配制方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、患者的年龄、体重、性别、所治疗的疾病的严重程度、患者的饮食和患者的排泄速率。
本文描述的抗体、其抗原结合片段、adc或配体的有效剂量可以在例如每单次(例如，推注(bolus))施用、多次施用或连续施用从约0.001mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围内，或者可以在达到抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体的最佳血清浓度(例如，0.0001μg/ml-5000μg/ml的血清浓度)的范围。剂量可以每天、每周或每月一次或更多次(例如，2次-10次)被施用至罹患gvhd或自身免疫性疾病或处于gvhd或自身免疫性疾病风险的受试者(例如，人类)。抗体、其抗原结合片段、adc或配体可以在造血干细胞移植之前以足以将宿主反应性t细胞的数量减少例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的量施用。
治疗方法
本文描述的组合物和方法可以用于耗尽与移植失败和自身免疫性疾病相关的被激活的t细胞，以便获得移植耐受性。本文描述的组合物和方法对于预防和治疗gvhd和自身免疫性疾病是特别有用的。本文公开的方法和组合物在降低接受同种异体移植的人类患者的移植失败风险也是有用的。优选的受试者是人类。施用的抗体、抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物的量应足以耗尽促进gvhd或自身免疫性疾病的细胞，例如被激活的t细胞。治疗有效剂量的确定在本领域从业者的能力内，然而，作为实例，在本文利用抗体的全身性施用来治疗ghvd或自身免疫性疾病描述的方法的实施方案中，有效的人类剂量将在0.1mg/kg-150mg/kg的范围内(例如，5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、150mg/kg等)。施用途径可以影响推荐剂量。取决于所采用的施用模式，考虑重复的全身性剂量以便维持有效水平，例如，以减轻或抑制gvhd或自身免疫性疾病。
抗体、抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物可以在细胞或实体器官移植到患者之前、同时或之后被施用至有需要的人类患者。在一个实施方案中，在移植细胞或实体器官之前(例如，之前3天、之前2天、之前12小时)，抗cd137adc被施用至有相应需要的人类患者。在一个实施方案中，在移植细胞或实体器官之后(例如，之后1天、之后2天、之后3天或之后4天)，抗cd137adc被施用至有相应需要的人类患者。在移植细胞或器官之前、同时或之后，单个剂量的抗cd137adc可以被施用至人类患者，其中这样的单个剂量足以治疗或预防gvhd或移植失败。
抗cd137adc可以用作用于促进接受移植包括同种异体移植的传统的剂(例如，化疗和/或放射)的替代物。传统的剂通常减少患者的免疫应答，以便促进植入和移植的细胞或器官的接受。本文描述的方法和组合物提供了更具选择性的疗法，该疗法允许患者的大部分免疫系统保持完整，同时靶向和耗尽表达cd137的被激活的t细胞。因此，在移植背景下，特别是考虑到同种异体激活的免疫细胞可以被靶向并耗尽以便实现细胞或实体器官的成功移植，本文公开的抗cd137adc选择性地耗尽被激活的t细胞的能力提供了相比于传统疗法有利的疗法。
本文公开的方法和组合物可以用于预防或治疗移植失败。移植失败或移植物排斥，包括同种异体造血干细胞移植之后的失败，通常可以表现为供体细胞初始植入的缺乏，或初始植入之后供体细胞的损失(关于综述参见mattsson等人(2008)biolbloodmarrowtransplant.14(增刊1):165–170)。本文公开的组合物和方法可以用于在移植物或移植方案中耗尽表达cd137的被激活的t细胞，在该方案中，例如，当人类患者在移植实体器官或细胞后处于发展移植失败的风险时，特别是当移植的细胞或器官是同种异体的时，移植失败是令人担忧的。
在一个实施方案中，抗cd137抗体、抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物用于通过在将细胞、移植物或器官移植到人类患者之前使细胞、移植物或实体器官与抗cd137抗体、抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物接触来耗尽表达cd137的供体细胞，例如表达cd137的被激活的t细胞。在一个实施方案中，细胞、移植物或器官是同种异体的。
在用目前的疗法移植后，gvhd的风险仍然是高的。本文公开的方法和组合物可以用于抑制人类患者中的移植物抗宿主疾病(gvhd)。抗cd137adc可以用于选择性地靶向将接受移植诸如干细胞移植的患者中的被激活的t细胞。如本文描述的抗cd137adc也可以用于通过靶向和耗尽将要接受或已经接受移植(诸如但不限于hsc移植)的人类患者中的cd137阳性细胞来降低gvhd的风险。在某些实施方案中，本文公开的组合物和方法用于在移植疗法(例如，同种异体的hsc)后在患者中出现gvhd症状之前治疗gvhd。
本文描述的方法对于预防宿主抗移植物(hvg)反应也是有用的。抗cd137-adc也可以用作免疫抑制剂，以预防宿主抗移植物(hvg)反应，从而预防或降低同种异体移植失败的风险。在处于hvg反应风险的患者中使用抗cd137adc将使得能够植入具有高度hla错配的供体细胞。另外的用途包括实体器官移植中的耐受性诱导，其中宿主抗移植物反应被cd137-adc防止或遏制。这些将包括使用或不使用造血干细胞移植进行的实体器官移植，包括其中器官是非人类来源的和/或被基因修饰的异种移植。
在一个实施方案中，在其中使用两个供体的同种异体移植的背景下，抗cd137-adc用于预防移植物抗移植物(gvg)。实例包括在成人患者和儿科患者中使用2个脐带血干细胞供体。gvg的预防将使得能够在移植后更快的造血细胞(例如嗜中性粒细胞和血小板)重建，因为两种干细胞来源都将成功地移植。
在一些实施方案中，移植是同种异体的。在一些实施方案中，移植是自体的。
在一些实施方案中，移植是骨髓移植、外周血移植或脐带血移植。
在一些实施方案中，移植包括造血细胞(例如，造血干细胞)。
在本文描述的任何实施方案中，移植可以是任何实体器官或皮肤移植。在一些实施方案中，移植选自由以下组成的组：肾脏移植、心脏移植、肝移植、胰腺移植、肺移植、肠移植和皮肤移植。
本文描述的方法对治疗多发性硬化(ms)是有用的。ms是破坏性的中枢神经系统的自身免疫性炎性疾病。广泛接受的是，中枢神经系统(cns)的损伤由针对髓鞘内(自身)抗原的自身免疫性攻击引起。负责ms的组织损伤的机制涉及攻击髓鞘中蛋白质的自反应性t细胞的激活。个体在15岁和50岁之间经历第一个迹象是常见的。受影响的个体遭遇炎性脱髓鞘发作，产生疾病加重的典型过程—加剧(remittance)。
本文描述的方法对治疗人类系统性红斑狼疮(sle)也是有用的。sle或狼疮是一种系统性慢性自身免疫性疾病，其特征在于针对自身抗原的自身抗体产生。自身反应性b细胞被自身抗原驱动，包括双链dna的抗体、核蛋白抗原的抗体和核糖核蛋白的抗体。促进b细胞耐受性损失和驱动自身抗体产生的因素是未知的。系统性狼疮几乎可以影响身体的任何器官或系统。系统性狼疮可以包括其中很少的症状(如果存在)是明显的时期(“缓解”)和疾病变得更加活跃的其他时间(“加剧”)。
本文描述的方法对治疗类风湿性关节炎(ra)也是有用的。ra是一种最初攻击滑膜的系统性自身免疫性疾病，滑膜是内衬关节之间的腔并且分泌润滑液的结缔组织膜。虽然ra的原因是未知的，但感染因素、遗传因素和激素因素可能对ra有贡献。ra与异常的免疫相关，因为罹患ra的患者的关节严重浸润白细胞，诸如巨噬细胞和树突细胞，以及t细胞和b细胞。该疾病可以在任何年龄发生，但疾病发作的峰发生率在25岁和55岁之间。发生率随着年龄增加。疾病的发作通常是渐进的，伴有疲劳、持续多于一小时的晨僵、弥漫性肌肉疼痛、食欲不振和虚弱。最终，关节疼痛出现，伴有在不活动之后关节的发热、肿胀、压痛和僵硬。
本文描述的方法对治疗炎性肠病(ibd)也是有用的。ibd的表现包括溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(crohn'sdisease)、淋巴细胞性结肠炎和胶原性结肠炎。ibd是一种自发复发、免疫介导的胃肠道紊乱，其特征在于不受控制的炎症和粘膜免疫系统的持续激活。cd4t细胞被认为在人类ibd的发病机制中发挥关键作用，因为它们流入发炎的粘膜。
本文描述的方法对治疗银屑病是特别有用的。银屑病是一种慢性炎性皮肤病，其特征在于红色、鳞状、凸起的斑块。银屑病由t细胞介导并且与导致细胞分裂增加和异常分化的细胞因子水平的升高相关。银屑病是一种具有不同的严重程度的慢性复发性皮肤状况，并且也与严重的共病(co-morbidities)相关，所述共病包括银屑病关节炎、抑郁症、恶性肿瘤、代谢综合征、心血管发病率和死亡率以及自身免疫性疾病诸如炎性肠病(ibd)。
本文描述的方法对治疗1型糖尿病(type1diabetesmellitus)(1型糖尿病(type1diabetes))也是有用的。1型糖尿病是一种人类的代谢紊乱，包括相对于他们的年龄和身高不超重的青少年发作患者，虽然1型糖尿病可以在任何年龄发生，但在早期年龄疾病快速发作，通常在30岁之前。1型糖尿病被认为是自身免疫性病因学的疾病。cd4t细胞和cd8t细胞涉及作为β细胞(胰岛素产生细胞)损伤的病原体。
本文描述的方法对治疗其他自身免疫性疾病也是有用的，所述其他自身免疫性疾病包括但不限于，急性播散性脑脊髓炎(adem)、爱迪生氏病(addison'sdisease)、全身脱毛、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(aps)、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(aied)、自身免疫性淋巴组织增生性综合征(alps)、自身免疫性卵巢炎、巴洛病(balodisease)、白塞氏病(behcet'sdisease)、大疱性类天疱疮、心肌病、恰加斯氏病(chagas'disease)、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(cfids)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、克罗恩氏病、瘢痕性类天疱疮、乳糜泻性疱疹样皮炎、冷凝集素病、crest综合征、degos病、盘状狼疮、家族性自主神经异常、子宫内膜异位、特发性混合性冷球蛋白血症(essentialmixedcryoglobulinemia)、纤维肌痛-纤维肌炎、goodpasture综合征、格雷夫斯病(grave'sdisease)、格林-巴利综合征(gbs)、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、特发性和/或急性血小板减少性紫癜、特发性肺纤维化、iga神经病变、间质性膀胱炎、青少年关节炎、川崎病、扁平苔藓、莱姆病(lymedisease)、梅尼埃病(menieredisease)、混合性结缔组织病(mctd)、重症肌无力、神经性肌强直、斜视眼阵挛肌阵挛综合征(oms)、视神经炎、奥德氏甲状腺炎(ord'sthyroiditis)、寻常型天疱疮、恶性贫血、多软骨炎、多肌炎和皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、结节性多动脉炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、原发性无丙种球蛋白血症、雷诺现象、reiter综合征、风湿热、结节病、硬皮病、干燥
本文描述的组合物和方法可以用于治疗多种紊乱，包括但不限于，非恶性血红蛋白病(例如，选自由以下组成的组的血红蛋白病：镰状细胞性贫血、地中海贫血、范科尼贫血和wiskott-aldrich综合征)。另外地或可选择地，本文描述的组合物和方法可以用于治疗免疫缺陷，诸如先天性免疫缺陷。另外地或可选择地，本文描述的组合物和方法可以用于治疗获得性免疫缺陷(例如，选自由以下组成的组的获得性免疫缺陷：hiv和aids)。本文描述的组合物和方法可以用于治疗代谢紊乱(例如，选自由以下组成的组的代谢紊乱：糖原贮积病、黏多糖贮积病、戈谢氏病、hurler病、鞘脂贮积病和异染性脑白质营养不良)。另外地或可选择地，本文描述的组合物和方法可以用于治疗恶性肿瘤，诸如血液癌症(例如，白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征)，以及其他癌症状况，包括成神经细胞瘤。
可以通过施用本文描述的组合物和方法治疗的另外的紊乱包括腺苷脱氨酶缺乏症和重症综合性免疫缺陷、高免疫球蛋白m综合征、chediak-higashi病、遗传性淋巴组织细胞增多症、骨硬化病、成骨不全症、贮积病、重型地中海贫血、系统性硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化和青少年类风湿性关节炎。
实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供可以如何使用、制备和评价本文描述的组合物和方法的描述，并且意图对本发明仅仅是示例性的，并且不意图限制本发明人认为是其发明的范围。
实施例1.将抗cd137抗体或adc施用至人类患者以准备造血干细胞移植疗法
根据本文公开的方法，本领域的技术医师可以向人类患者施用能够结合cd137的抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体，诸如本文描述的抗cd137抗体。抗体、其片段、adc或可溶性配体可以共价地缀合至毒素，诸如本文描述的或本领域已知的细胞毒性分子、或fc结构域。例如，抗cd137抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体可以共价地缀合至细胞毒素，诸如微管结合剂、美登素、美登木素生物碱、鹅膏蕈毒素、假单胞菌外毒素a、debouganin、白喉毒素、诸如α-鹅膏蕈碱、皂草素、奥瑞他汀、蒽环霉素、加利车霉素、伊立替康、sn-38、倍癌霉素、吡咯并苯二氮卓类、吡咯并苯二氮卓类二聚体、吲哚并苯二氮卓类和吲哚并苯二氮卓类二聚体或其变体。
可以使用本文描述的或本领域已知的共价键形成技术进行该缀合。随后可以通过例如静脉内施用，将抗体、其抗原结合片段或药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物施用至患者，然后将外源性造血干细胞(诸如同种异体的造血干细胞)移植到患者。
抗cd137抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在造血干细胞移植疗法之前、同时或之后以足以将宿主反应性t细胞的量减少例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的量来施用。可以使用本领域已知的常规技术，诸如通过facs分析从患者抽取的血液样品中的表达特征性造血细胞表面抗原的细胞来监测供体t细胞计数的减少。例如，本领域的技术医师可以在不同时间点从患者抽取血液样品，并且通过进行facs分析来确定供体cd137+t细胞减少的程度，以使用与供体t细胞抗原结合的抗体来阐明样品中t细胞的相对浓度。
抗cd137抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以以含有一种或更多种药学上可接受的赋形剂诸如粘度调节剂的水性溶液被施用至患者。水性溶液可以使用本文描述的或本领域已知的技术进行灭菌。在将造血干细胞移植物施用至患者之前，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以以例如从0.001mg/kg至100mg/kg的剂量被施用至患者。抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在最佳地促进外源性造血干细胞的植入的时间被施用至患者，例如，在施用外源性造血干细胞移植体之前1小时至7天(例如，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天)或更长时间。例如，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在移植之前约3天被施用。可选择地，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在最佳地促进外源性造血干细胞的植入的时间例如在施用外源性造血干细胞移植体的同时被施用至患者。此外，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在最佳地促进外源性造血干细胞的植入的时间被施用至患者，例如，在施用外源性造血干细胞移植体之后1小时至10天(例如，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天)或更长时间。例如，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在移植之后约3天至4天被施用。抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物的量可以通过本领域已知的方法在患者的血浆中定量，以确定抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物的浓度何时达到其最大值。
然后，患者可以诸如从施用抗体或其抗原结合片段或药物-抗体缀合物的同一医师或从不同医师接受外源性造血干细胞的输注(例如，静脉内输注)。医师可以例如以从1×103至1×109个cd34+细胞/kg的剂量向患者施用自体、同基因或同种异体的造血干细胞的输注剂。医师可以例如通过在施用移植后从患者抽取血液样品并且确定造血干细胞或造血谱系细胞(诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞，粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、t细胞和b细胞)的浓度的增加来监测造血干细胞移植体的植入。该分析可以在造血干细胞移植疗法后例如1小时至6个月或更长时间(例如，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周或更长时间)进行。这一发现，即在移植疗法后造血干细胞或造血谱系细胞浓度相对于在移植疗法之前对应的细胞类型的浓度已经增加(例如，增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％或更多)，提供了用抗cd137抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物的治疗已经成功地促进移植的造血干细胞移植物的植入的一个指示。
实施例2.通过噬菌体展示产生抗cd137抗体
用于与本文描述的组合物和方法一起使用的抗cd137抗体的体外演化的示例性方法是噬菌体展示。噬菌体展示文库可以通过在抗体的cdr或抗体样支架的类似区域(例如，10fn3结构域的bc、cd和de环)的编码序列内进行被设计的一系列突变或变异来创建。被引入了这些突变的模板抗体编码序列可以是例如天然人类种系序列。可以使用本领域已知的标准诱变技术进行这些突变。因此，每个突变体序列编码对应于模板的保留了一个或更多个氨基酸变异的抗体。可以使用本领域已知的标准载体构建技术工程化逆转录病毒和噬菌体展示载体。p3噬菌体展示载体连同相容的蛋白表达载体可以用来产生用于抗体多样化的噬菌体展示载体。
突变的dna提供序列多样性，并且每个转化体噬菌体展示由dna编码的初始模板氨基酸序列的一个变体，产生展示大量不同但结构相关的氨基酸序列的噬菌体群体(文库)。由于抗体高变区的定义明确的(well-defined)结构，噬菌体展示筛选中引入的氨基酸变异被预期改变结合肽或结合结构域的结合性质而不显著改变其整体分子结构。
在典型的筛选中，噬菌体文库可以与cd137或其表位接触并且允许结合cd137或其表位。为了促进结合物(binders)和非结合物的分离，将靶固定在固体支持物上是方便的。携带cd137-结合部分的噬菌体可以与固体支持物上的靶形成复合物，而非结合噬菌体保持在溶液中并且可以用过量缓冲液洗去。然后，结合的噬菌体可以通过将缓冲液改变至极端ph(ph2或ph10)、改变缓冲液的离子强度、添加变性剂或其他已知的手段从靶释放。
然后，回收的噬菌体可以通过感染细菌细胞来扩增，并且可以使用被耗尽非结合抗体并富集结合cd137的抗体的新的汇集物(pool)来重复筛选过程。甚至少数结合噬菌体的回收足以扩增用于随后的筛选迭代的噬菌体。在几轮选择之后，编码源自结合池中的选择的噬菌体克隆的抗体或其抗原结合片段的基因序列通过常规方法确定，从而揭示赋予噬菌体对靶的结合亲和力的肽序列。在淘选过程期间，群体的序列多样性随着每轮选择而减少，直到留下期望的肽结合抗体。序列可以会聚在少量相关抗体或其抗原结合片段上。在每轮选择中回收的噬菌体数目的增加指示在筛选中已经发生文库的会聚(convergence)。
实施例3.产生人源化抗cd137抗体
可以例如根据以下程序将结合cd137的非人类抗体人源化。共有人类抗体重链和轻链序列是本领域已知的(参见例如，“vbase”人类种系序列数据库；kabat等人sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nih公布第91-3242号,1991；tomlinson等人,j.mol.biol.227:776-798,1992；和cox等人eur.j.immunol.24:827-836,1994，它们中的每一篇的公开内容当它们涉及共有人类抗体重链和轻链序列时通过引用并入本文。本领域技术人员可以使用已建立的程序鉴定共有抗体序列的可变结构域框架残基和cdr(例如，通过序列比对)。人们可以将共有人类抗体的重链和/或轻链可变结构域的一个或更多个cdr取代为结合cd137的非人类抗体的一个或更多个对应的cdr，以便产生人源化抗体。可以使用本文描述的或本领域已知的基因编辑技术进行该cdr交换。
共有人类抗体的可变结构域的一个实例含有在美国专利第6,054,297号中鉴定的重链可变结构域evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdyamswvrqapgkglewvavisengsdtyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycardrggavsyfdvwgqgtlvtvss(seqidno:21)和轻链可变结构域
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvssylawyqqkpgkapklliyaasslesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqynslpytfgqgtkveikrt(seqidno:22)，该专利的公开内容当其涉及人类抗体共有序列时通过引用并入本文。上文的序列中的cdr以粗体示出。
为了产生人源化抗体，人们可以重组表达编码上文的共有序列的多核苷酸，该共有序列中一个或更多个可变区cdr已经被结合cd137的非人类抗体的一个或更多个可变区cdr序列代替。由于抗体对cd137的亲和力主要由cdr序列确定，因此所得到的人源化抗体被预期对cd137表现出与该人源化抗体源自的非人类抗体约相同的亲和力。确定抗体对靶抗原的亲和力的方法包括例如本文描述的和本领域已知的基于elisa的技术，以及表面等离子体共振、荧光各向异性和等温滴定量热法，以及其他。
实施例4.将抗cd137抗体或adc施用至处于gvhd风险或罹患gvhd的人类患者
根据本文公开的方法，本领域的技术医师可以向人类患者施用能够结合cd137的抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体，诸如本文描述的抗cd137抗体或adc。抗体、其片段、adc或可溶性配体可以共价地缀合至毒素，诸如本文描述的或本领域已知的细胞毒性分子、或fc结构域。例如，抗cd137抗体、其抗原结合片段或可溶性配体可以共价地缀合至细胞毒素，诸如微管结合剂、美登素、美登木素生物碱、鹅膏蕈毒素、假单胞菌外毒素a、debouganin、白喉毒素、诸如α-鹅膏蕈碱、皂草素、奥瑞他汀、蒽环霉素、加利车霉素、伊立替康、sn-38、倍癌霉素、吡咯并苯二氮卓类、吡咯并苯二氮卓类二聚体、吲哚并苯二氮卓类和吲哚并苯二氮卓类二聚体或其变体。
可以使用本文描述的或本领域已知的共价键形成技术进行该缀合。抗体、其抗原结合片段、或药物-抗体缀合物、或药物-配体缀合物随后可以通过例如静脉内施用被施用至处于gvhd风险的患者。抗体、其抗原结合片段、或药物-抗体缀合物、或药物-配体缀合物随后可以通过例如静脉内施用被施用至罹患gvhd的患者。例如，抗体、其抗原结合片段、或药物-抗体缀合物、或药物-配体缀合物可以在移植外源性造血干细胞(诸如同种异体造血干细胞)之前、同时或之后被施用至患者。
抗cd137抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在造血干细胞移植疗法后以足以将宿主反应性t细胞的数量减少例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的量来施用。可以使用本领域已知的常规技术，诸如通过facs分析从患者抽取的血液样品中的表达特征性造血细胞表面抗原的细胞来监测供体t细胞计数的减少。例如，本领域的技术医师可以在不同时间点从患者抽取血液样品，并且通过进行facs分析来确定供体cd137+t细胞减少的程度，以使用与供体t细胞抗原结合的抗体来阐明样品中t细胞的相对浓度。
抗cd137抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以以含有一种或更多种药学上可接受的赋形剂诸如粘度调节剂的水性溶液被施用至患者。水性溶液可以使用本文描述的或本领域已知的技术进行灭菌。在将造血干细胞移植物施用至患者之前，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以以例如从0.001mg/kg至100mg/kg的剂量被施用至患者。抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在最佳地促进gvhd的预防和治疗的时间被施用至患者，例如，在施用外源性造血干细胞移植体之前1小时至7天(例如，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天)或更长时间。例如，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在移植之前约3天被施用。可选择地，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在最佳地促进外源性造血干细胞的植入的时间例如与施用外源性造血干细胞移植体的同时被施用至患者。此外，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在最佳地促进外源性造血干细胞的植入的时间被施用至患者，例如，在施用外源性造血干细胞移植体之后1小时至10天(例如，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天)或更长时间。例如，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在移植之后约3天至4天被施用。抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物的量可以通过本领域已知的方法在患者的血浆中定量，以确定抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物的浓度何时达到其最大值。
然后，患者可以诸如从施用抗体或其抗原结合片段或药物-抗体缀合物的同一医师或从不同医师接受外源性造血干细胞的输注(例如，静脉内输注)。医师可以例如以从1×103至1×109个cd34+细胞/kg的剂量向患者施用自体或同种异体的造血干细胞的输注剂。
本领域的技术医师可以在向人类患者施用能够结合cd137的抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体诸如本文描述的抗cd137抗体之后，评估gvhd的临床表现。
实施例5.将抗cd137抗体或adc施用至由于造血干细胞移植而发展自身免疫性疾病的人类患者
根据本文公开的方法，本领域的技术医师可以向人类患者施用能够结合cd137的抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体，诸如本文描述的抗cd137抗体或adc。抗体、其片段或可溶性配体可以共价地缀合至毒素，诸如本文描述的或本领域已知的细胞毒性分子、或fc结构域。例如，抗cd137抗体、其抗原结合片段或可溶性配体可以共价地缀合至细胞毒素，诸如微管结合剂、美登素、美登木素生物碱、鹅膏蕈毒素、假单胞菌外毒素a、debouganin、白喉毒素，诸如α-鹅膏蕈碱、皂草素、奥瑞他汀、蒽环霉素、加利车霉素、伊立替康、sn-38、倍癌霉素、吡咯并苯二氮卓类、吡咯并苯二氮卓类二聚体、吲哚并苯二氮卓类和吲哚并苯二氮卓类二聚体或其变体。
可以使用本文描述的或本领域已知的共价键形成技术进行该缀合。抗体、其抗原结合片段、或药物-抗体缀合物、或药物-配体缀合物随后可以通过例如静脉内施用被施用至处于自身免疫性疾病(例如，多发性硬化、类风湿性关节炎、肠道疾病、银屑病、狼疮和1型糖尿病)风险的患者。例如，抗体、其抗原结合片段、或药物-抗体缀合物、或药物-配体缀合物可以被施用至罹患在移植外源性造血干细胞(诸如自体或同种异体的造血干细胞)之后发展的自身免疫性疾病的患者。
抗cd137抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在造血干细胞移植疗法之前以足以将宿主反应性淋巴细胞的数量减少例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的量来施用。可以使用本领域已知的常规技术，诸如通过facs分析从患者抽取的血液样品中的表达特征性造血细胞表面抗原的细胞来监测供体淋巴细胞计数的减少。例如，本领域的技术医师可以在不同时间点从患者抽取血液样品，并且通过进行facs分析来确定cd137+t细胞减少的程度，以使用与t细胞抗原结合的抗体来阐明样品中t细胞的相对浓度。针对自身免疫性疾病的功效可以通过本领域已知的测定法来测量(例如，来自血清样品的自身抗体应答测量，以及响应于自身抗原的t细胞增殖)。
抗cd137抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以以含有一种或更多种药学上可接受的赋形剂诸如粘度调节剂的水性溶液被施用至患者。水性溶液可以使用本文描述的或本领域已知的技术进行灭菌。在将造血干细胞移植物施用至患者之前，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以以例如从0.001mg/kg至100mg/kg的剂量被施用至患者。抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在最佳地促进自身免疫性疾病的预防和治疗的时间被施用至患者，例如，在施用外源性造血干细胞移植体之前1小时至7天(例如，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天)或更长时间。例如，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在移植之前约3天被施用。可选择地，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在最佳地促进外源性造血干细胞的植入的时间，例如与施用外源性造血干细胞移植体的同时被施用至患者。此外，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在最佳地促进外源性造血干细胞的植入的时间被施用至患者，例如，在施用外源性造血干细胞移植体之后1小时至10天(例如，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天)或更长时间。例如，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在移植之后约3天至4天被施用。抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物的量可以通过本领域已知的方法在患者的血浆中定量，以确定抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物的浓度何时达到其最大值。
然后，患者可以诸如从施用抗体或其抗原结合片段或药物-抗体缀合物的同一医师或从不同医师接受外源性造血干细胞的输注(例如，静脉内输注)。医师可以例如以从1×103至1×109个cd34+细胞/kg的剂量向患者施用自体或同种异体的造血干细胞的输注剂。
本领域的技术医师可以在向人类患者施用能够结合cd137的抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体诸如本文描述的抗cd137抗体或adc之后，评估自身免疫性疾病的临床表现。
实施例6.将抗cd137抗体施用至处于自身免疫性疾病风险或罹患自身免疫性疾病的人类患者
根据本文公开的方法，本领域的技术医师可以向人类患者施用能够结合cd137的抗体、其抗原结合片段、adc或可溶性配体，诸如本文描述的抗cd137抗体或adc。抗体、其片段或可溶性配体可以共价地缀合至毒素，诸如本文描述的或本领域已知的细胞毒性分子、或fc结构域。
可以使用本文描述的或本领域已知的共价键形成技术进行该缀合。抗体、其抗原结合片段、或药物-抗体缀合物、或药物-配体缀合物随后可以通过例如静脉内施用被施用至处于自身免疫性疾病(例如，多发性硬化、类风湿性关节炎、肠道疾病、银屑病、狼疮和1型糖尿病)风险的患者。抗体、其抗原结合片段、或药物-抗体缀合物、或药物-配体缀合物随后可以通过例如静脉内施用被施用至罹患自身免疫性疾病(例如，多发性硬化、类风湿性关节炎、肠道疾病、银屑病、狼疮和1型糖尿病)的患者。
抗cd137抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以以足以将宿主反应性淋巴细胞的数量减少例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的量来施用。可以使用本领域已知的常规技术，诸如通过facs分析从患者抽取的血液样品中的表达特征性造血细胞表面抗原的细胞来监测供体淋巴细胞计数的减少。例如，本领域的技术医师可以在不同时间点从患者抽取血液样品，并且通过进行facs分析来确定cd137+t细胞减少的程度，以使用与t细胞抗原结合的抗体来阐明样品中t细胞的相对浓度。针对自身免疫性疾病的功效可以通过本领域已知的测定法来测量(例如，来自血清样品的自身抗体应答测量，以及响应于自身抗原的t细胞增殖)。
抗cd137抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以以含有一种或更多种药学上可接受的赋形剂诸如粘度调节剂的水性溶液被施用至患者。水性溶液可以使用本文描述的或本领域已知的技术进行灭菌。在将造血干细胞移植物施用至患者之前，抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以以例如从0.001mg/kg至100mg/kg的剂量被施用至患者。抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物可以在最佳地促进自身免疫性疾病的预防和治疗的时间被施用至患者。抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物的量可以通过本领域已知的方法在患者的血浆中定量，以确定抗体、其抗原结合片段、药物-抗体缀合物或药物-配体缀合物的浓度何时达到其最大值。
本领域的技术医师可以在向人类患者施用能够结合cd137的抗体、其抗原结合片段或可溶性配体诸如本文描述的抗cd137抗体或adc之后，评估自身免疫性疾病的临床表现。
实施例7.体外细胞系结合测定
将特征在于稳定、过表达hcd137的jurkat细胞(即，永生化人类t淋巴细胞系)以20,000个细胞/孔接种，并且在4℃用原代鼠抗cd137抗体bbk2(bbk2-migg1)滴定染色持续4小时。在4℃以恒定量添加第二抗小鼠af488染色持续30分钟。在洗涤之后，将板在流式细胞仪上运行，并且基于af488通道中的几何平均荧光强度确定bbk2-migg1(以及阴性对照，即，migg1)的结合。这些测定的结果在图1a和图1b中提供。
如图1a和图1b所示，鼠bbk2抗体与人类t细胞(即表达cd137的jurkat细胞)结合，ec50＝35pm。
实施例8.使用体外t细胞杀伤测定的抗cd137-鹅膏蕈碱抗体药物缀合物(adc)的体外分析
将低温保存的阴性选择的原代人类t细胞解冻并且以0.5:1的珠:细胞的比率用抗cd3/抗cd28珠(invitrogen)刺激。在测定开始时，将2e4t细胞接种在384孔板的每个孔中，并且以在0.003nm和30nm之间的不同浓度将adc添加至孔中，然后置于37℃和5％co2的培养箱中。在培养4天后，通过流式细胞术分析细胞。将细胞用存活的标志物live/deadyellow(invitrogen)染色，并且在体积流式细胞仪上运行。存活的被激活的细胞(图2a)和存活的未被激活的细胞(图2b)的数目由fsc对ssc来确定。与鹅膏蕈碱缀合的非特异性人类igg(higg-鹅膏蕈碱)用作阴性对照。因此，将对照与两种不同的adc进行比较：1)与鹅膏蕈碱缀合的嵌合抗cd137抗体bbk2(cd137-鹅膏蕈碱)；和2)包含与鹅膏蕈碱缀合的对t细胞抗原特异性的抗体的adc(抗t细胞-鹅膏蕈碱)。抗t细胞-鹅膏蕈碱adc用作阳性对照，因为预期它结合并杀死被激活的t细胞和未被激活的t细胞两者。
如图2a和图2b所示，抗cd137-鹅膏蕈碱adc(即，“cd137-鹅膏蕈碱”)特异性地杀死被激活的t细胞，并且不明显地杀死未被激活(静息、稳态)的t细胞。此外，阳性对照(即，“抗t细胞-鹅膏蕈碱”adc)，作为特异性地靶向被激活的t细胞和未被激活的t细胞两者的adc，杀死被激活的t细胞和未被激活的t细胞两者。
实施例9.使用异种-gvhd小鼠模型的gvhd预防的分析
使用异种-gvhd小鼠模型体内评估抗cd137-鹅膏蕈碱adc预防gvhd的形成或发生的能力。对雌性6-8周龄的nsg小鼠进行辐照(200cgy)，并且在第二天移植6×106个人类外周血单核细胞(pbmc)，以产生gvhd小鼠模型。一天后，向动物给药(以3mg/kg)抗cd137-鹅膏蕈碱adc(即，“cd137-鹅膏蕈碱”)或各种对照试剂(即，单独的缓冲液(“pbs”)、抗cd137抗体(“裸cd137”)或对cd137无特异性的基于鹅膏蕈碱的adc(“同种型-鹅膏蕈碱”))。在本实施例中使用的在adc中的和作为裸抗体的抗cd137抗体是嵌合bbk2。
在给药之后，每天密切跟踪动物的gvhd的病征和/或身体状况下降，包括但不限于弓背姿势、毛皮起皱、体重减轻和/或有限的活动。将具有严重身体状况问题的动物或示出体重减轻>20％的那些动物处死，并且分析组织的人类细胞。将小鼠的外周血和脾用抗体混合物染色，该抗体混合物包含hcd45抗体、mcd45抗体、hcd3抗体和hcd137抗体，将红细胞裂解，并且通过流式细胞术分析。将血液中人类t细胞的数目限定为hcd45+cd3+并且相对于输入血液体积归一化。图3中提供了存活百分比随治疗后天数的变化。图4中提供了外周血中人类t细胞的数目随移植后天数的变化。
如图3所示，用单个剂量的抗cd137-鹅膏蕈碱adc(“cd137-鹅膏蕈碱”)处理的动物示出基本上完全预防gvhd，即使在移植后80天，而用对照(即，pbs、抗cd137抗体(裸)和同种型-鹅膏蕈碱)处理的动物都在移植后11天至13天内死亡。这些结果还指示，抗cd137-鹅膏蕈碱adc在所有动物中是良好耐受的，并且单个剂量的抗cd137-鹅膏蕈碱adc足以完全预防gvhd(与需要多个剂量相反)。如图4所示，在抗cd137-鹅膏蕈碱处理的小鼠中移植后至少70天的时间段内，在小鼠的外周血中未检测到人类t细胞，而用对照处理的动物的特征在于在移植后若干天在小鼠的外周血中具有可检测到的人类t细胞，这指示用对照处理的动物中gvhd的发展。
实施例10.hnsg-sgm3小鼠模型中植入率和稳态t细胞耗尽的确定
使用hcd45抗体、mcd45抗体、hcd3抗体和hcd137抗体，通过流式细胞术评估雌性人源化nsg-sgm3小鼠的外周血中的基线人类造血细胞(总体和t细胞)植入率。将小鼠随机化，并且然后用每种为3mg/kg的剂量的cd137-鹅膏蕈碱adc(嵌合bbk2-鹅膏蕈碱adc)、同种型-鹅膏蕈碱adc或抗t细胞鹅膏蕈碱adc处理。在处理后第5天、第9天、第14天、第22天和第27天测量小鼠的外周中的植入和t细胞耗尽(图5a和图5b)。将外周血染色以评估嵌合性和t细胞数目的变化。将等量的血液在体积流式细胞仪上运行，并且基于事件数目确定绝对计数。将植入和t细胞数目的减少相对于基线值归一化。
图5a和图5b中的结果指示，抗cd137-鹅膏蕈碱adc在该小鼠模型中是良好耐受的。此外，植入和t细胞频率(在相对于基线归一化之后)保持在基线水平附近，抗cd137-鹅膏蕈碱adc处理的小鼠的植入和t细胞频率有中度至短暂的下降。这些数据指示，在稳态的人源化nsg小鼠中通常缺乏t细胞耗尽，这指示在抗cd137-鹅膏蕈碱adc处理的小鼠中可以保持免疫功能，因为大多数t细胞未被耗尽。相反，用特异性地靶向可选的t细胞标志物的adc(“抗t细胞-鹅膏蕈碱”)处理的小鼠证明了植入和t细胞数目的完全消融。
上文的实施例中描述的嵌合bbk2的重链和轻链氨基酸序列分别在seqidno:23和24中列出。
其他实施方案
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入的相同程度。
虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应该理解，本发明能够具有进一步的修改，并且本申请意图覆盖本发明的任何变化、用途或修改，所述本发明的任何变化、用途或修改在总体上遵循本发明的原则，并且包括在本发明所属领域内已知或惯用实践之内的并且可以被应用于上文阐述的必要特征并且落入权利要求的范围的本发明的此类偏离。
其他实施方案在权利要求内。
序列表
<110>美真达治疗公司
<120>用于耗尽cd137+细胞的组合物和方法
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<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的肽
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1510
<210>20
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<213>智人(homosapiens)
<400>20
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<220>
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<400>23
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leuserproglylys
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gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser
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pheasnargglyglucys
210
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<220>
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<400>26
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151015
asp
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<400>27
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<400>29
argalaserglnaspleuserasnhisleutyr
1510
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15
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15
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15
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15
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1
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15
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