相关申请的交叉引用本申请要求2018年5月4日提交的美国临时申请号62/666,981和2017年9月25日提交的美国临时申请号62/562,723的优先权权益，以上申请中的每一项据此通过引用全文并入。本公开整体涉及用于将生物活性化合物包封在无染色体和/或无核细胞内的制剂、平台、组合物和方法。本公开提供了包封在无染色体和/或无核细胞中的生物活性化合物到期望靶标的可规模化递送。另外，本文公开了用于以稳定和可规模化方式包封并递送生物活性化合物到靶标上和/或靶标中的方法。关于序列表的声明与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且据此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称为agro_004_02wo_seqlist_st25.txt。文本文件为约89.5kb，创建于2018年9月24日，并通过efs-web以电子方式提交。
背景技术：
：：预计到2050年，世界人口将增长到90亿以上，人类社会将面临的最大挑战就是养活人民。联合国粮食及农业组织(fao)估计，粮食生产与人口增长保持同步的必要增长中，预计有80％来自产量的增加以及每年可以在同一土地上种植作物的次数的增加。预计只有20％的新粮食生产来自农田扩张。需要全球作出努力来增加未来的作物收成和粮食生产，从而应对未来的挑战。农药在农业和粮食生产中起着重要作用，可防止大量作物损失。农药可以通过防治害虫(诸如昆虫)、啮齿动物、杂草、细菌、霉菌和真菌并且通过增加产量以及每年可以在同一土地上种植作物的次数来帮助生产粮食。然而，人们一直担心农药对人类健康和周围环境的负面影响。农药可能对人类而言是有毒的，并且可能具有急性和慢性健康影响，这取决于人体暴露于其中的数量和方式。有些农药可以在土壤和水中保留数年，这会使环境更易受到污染和伤害。因暴露于农药而面临最大健康风险的人是那些在工作中、在家或花园中与农药接触的人。由于常规农药给社会带来意想不到的后果，因此采用替代施加方式在没有农药的有害影响下防止害虫破坏作物至关重要。另一方面，肥料作为生长刺激剂对于增加作物产量非常重要。然而，基于化学的常规肥料使人们遭受农药所具有的类似负面影响。由于喷洒时从靶标上滴落或者由于降雨期间被冲刷，不仅作为防治试剂的农药而且作为刺激剂的肥料都存在化学物质功效降低和化学物质流失到土壤中的问题，这可能会导致地下水污染、环境破坏、功能活性丧失以及人类和动物健康问题。因此，还有必要开发一种新型递送系统，以确保生物活性化合物诸如生物防治剂和/或生物刺激剂的靶向递送。另外，非常需要一种有效的包封和递送平台，用于维持生物防治剂和/或生物刺激剂的生物活性，直到以可规模化、靶向、成本有效的方式将生物活性化合物递送到其预期靶标。技术实现要素：本公开涉及包含完整小细胞的农业制剂，所述完整小细胞用于包封和递送生物活性化合物并将所述农业制剂施加于期望位点，诸如植物或害虫。本公开还涉及一种无核小细胞，所述无核小细胞用于包封和递送生物活性化合物并将所述平台施加于期望位点，诸如植物或害虫。本公开提供了用于将生物活性化合物包封在无染色体和/或无核小细胞内的平台、组合物、制剂和方法。本公开提供了包封在无染色体和/或无核小细胞中的生物活性化合物到期望靶标的可规模化递送。另外，本文公开了用于以稳定和可规模化方式包封生物活性化合物并将其递送到靶标上和/或靶标中的方法。在一些实施方案中，提供了一种农业制剂，所述农业制剂包含a)完整小细胞，所述小细胞在所述小细胞内包含至少一种生物活性化合物，其中所述生物活性化合物选自由以下各项组成的组：i)核酸，其中所述核酸靶向靶标的细胞内编码多肽的转录物，ii)生物防治化合物，其中所述生物防治化合物对害虫具有活性，以及iii)生物刺激剂化合物，其中所述生物刺激剂化合物刺激植物的生长或健康。在一些实施方案中，所述靶标是植物或害虫。在一些实施方案中，所述小细胞与至少一种农业上适合的添加剂或佐剂一起施加。在一些实施方案中，所述小细胞来源于原核细胞、革兰氏阴性细菌细胞、革兰氏阳性细菌细胞或真核细胞。在其他实施方案中，所述小细胞来源于内生菌或植物病原细菌。在一些实施方案中，所述小细胞是蛋白酶缺乏的或是核糖核酸酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是蛋白酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是核糖核酸酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是蛋白酶缺乏的和是核糖核酸酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是蛋白酶缺乏的，并且其中所述生物活性化合物是蛋白质。在一些实施方案中，所述小细胞是核糖核酸酶缺乏的，并且其中所述生物活性化合物是核酸。在一些实施方案中，所述生物活性化合物是所述核酸，所述核酸选自由以下各项组成的组：反义核酸、双链rna(dsrna)、短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、核酶、适体及其组合。在一些实施方案中，所述生物活性化合物对除所述靶标的细胞以外的细胞是惰性的。在一些实施方案中，所述生物防治化合物是肽、多肽、发酵产物、代谢物、抗体、化学信息素或微量营养素。在一些实施方案中，所述生物刺激剂化合物是肽、多肽、发酵产物、代谢物、抗体、化学信息素或微量营养素。在一些实施方案中，所述靶标包括植物、昆虫、蠕虫、细菌、真菌、病毒和水生动物，其中所述水生动物包括鱼、贝类和甲壳动物。在一些实施方案中，所述农业制剂还在所述小细胞内包含多肽，其中所述多肽在所述小细胞内表达，其中所述多肽与所述核酸结合。在一些实施方案中，所述多肽是dsrna结合蛋白，并且其中所述dsrna结合蛋白增加负载并增强dsrna的稳定性。在一些实施方案中，所述小细胞还包含至少一种融合蛋白，并且其中所述融合蛋白在所述小细胞的表面上表达。在其他实施方案中，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分，并且其中所述靶细胞粘附部分包含由纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域组成的碳水化合物结合模块。在一些实施方案中，所述小细胞用溶剂、试剂、固定剂、防腐剂或交联剂处理以具有更好的溶解性、增加的稳定性或增强的完整性。在一些实施方案中，所述小细胞表现出所述生物活性化合物的控制释放速率，其中所述释放可以是稳定释放或初始突释然后稳定释放。在一些实施方案中，提供了一种递送至少一种生物活性化合物的方法，所述方法包括：将所述小细胞施加于靶细胞。在一些实施方案中，将所述小细胞施加于靶标并通过内吞作用将其递送到所述靶标的细胞中。在其他实施方案中，提供了一种递送至少一种生物活性化合物的方法，所述方法还包括：将所述小细胞与试剂一起施加于所述靶细胞，其中所述试剂是用于改善所述小细胞穿透到所述靶细胞中的佐剂。在一些实施方案中，提供了一种递送至少一种生物活性化合物的方法，所述试剂是表面活性剂、乳化剂、作物油浓缩液、穿透剂、盐或其组合。在一些实施方案中，提供了一种递送至少一种生物活性化合物的方法，所述方法包括：将农业制剂施加于靶细胞，其中所述农业制剂包含：a)来源于细菌亲代细胞的完整无核细胞，所述完整无核细胞在其中包含所述生物活性化合物，其中所述生物活性化合物选自由以下各项组成的组：i)核酸，其中所述核酸靶向所述靶细胞内编码多肽的转录物，ii)生物防治化合物，以及iii)生物刺激剂化合物。在一些实施方案中，所述生物活性化合物是所述核酸，所述核酸选自由以下各项组成的组：反义核酸、双链rna(dsrna)、短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、核酶、适体及其组合。在一些实施方案中，所述生物防治化合物是肽、多肽、发酵产物、代谢物、抗体、化学信息素或微量营养素。在一些实施方案中，所述生物刺激剂化合物是肽、多肽、发酵产物、代谢物、抗体、化学信息素或微量营养素。在一些实施方案中，所述靶细胞包括植物细胞、昆虫细胞、蠕虫细胞、细菌细胞、真菌细胞、病毒和水生动物的细胞，其中所述水生动物包括鱼、贝类和甲壳动物。在一些实施方案中，所述无核细胞还包含至少一种融合蛋白，并且其中所述融合蛋白在所述细胞的表面上表达。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分，并且其中所述靶细胞粘附部分包含由纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域组成的碳水化合物结合模块。附图说明图1示出了用于minc敲除以产生核糖核酸酶缺乏的和/或蛋白酶缺乏的小细胞的示例性细菌小细胞诱导载体。在puc57载体中插入重组dna插入物，该插入物包含minc基因的5'端核苷酸序列、带有cat启动子的氯霉素抗性基因(cmr)以及minc基因的3'端核苷酸序列。将两侧为minc基因的5'和3'端的发夹环插入插入物中，以终止整合插入物的基因组中其他相邻基因的转录调控。图2示出了用于mind敲除以产生核糖核酸酶缺乏的和/或蛋白酶缺乏的小细胞的示例性细菌小细胞诱导载体。在puc57载体中插入重组dna插入物，该插入物包含mind基因的5'端核苷酸序列、带有cat启动子的氯霉素抗性基因(cmr)以及mind基因的3'端核苷酸序列。将两侧为mind基因的5'和3'端的发夹环插入插入物中，以终止整合插入物的基因组中其他相邻基因的转录调控。图3示出了用于minc/mind敲除以产生核糖核酸酶缺乏的和/或蛋白酶缺乏的小细胞的示例性细菌小细胞诱导载体。在puc57载体中插入重组dna插入物，该插入物包含mind基因的5'端、带有cat启动子的氯霉素抗性基因(cmr)以及minc基因的3'端。将两侧为mind基因的5'和minc基因的3'端的发夹环插入插入物中，以终止整合插入物的基因组中其他相邻基因的转录调控。图4a示出了具有aida-1表面表达系统的示例性paida-1-cbm载体，该表面表达系统用于在小细胞的表面上展示两侧为6xhis、gfp纳米抗体和myc标签的cbm(碳水化合物结合模块)蛋白。图4b示出了示例性paida-1cbm表面表达盒，该表达盒包含编码aida-1自转运蛋白信号肽、gfp纳米抗体、cbm和aida-1自转运蛋白易位结构域的核苷酸序列，并且具有标签(包括6xhis标签和myc标签)以及两个蛋白酶切割位点(包括hrv3c和tev)。图5a示出了具有aida-1表面表达系统的示例性pgex-6p-1aida-1-cbm载体，该表面表达系统用于在小细胞的表面上展示两侧为6xhis、gfp纳米抗体和myc标签的cbm。图5b示出了示例性aida-1cbm表面表达盒，该表达盒包含编码aida-1自转运蛋白信号肽、gfp纳米抗体、cbm和aida-1自转运蛋白易位结构域的核苷酸序列，并且具有标签(包括6xhis标签和myc标签)以及两个蛋白酶切割位点(包括hrv3c和tev)。图6a示出了具有血清抗性自转运蛋白brka表面表达系统的示例性pgex-6p-1brk-cbm载体，该表面表达系统用于在小细胞的表面上展示两侧为6xhis、gfp纳米抗体和myc标签的cbm蛋白。图6b示出了示例性brk-cbm表面表达盒，该表达盒包含编码brk自转运蛋白信号肽、gfp纳米抗体、cbm和brk自转运蛋白易位结构域的核苷酸序列，并且具有标签(包括6xhis标签和myc标签)以及两个蛋白酶切割位点(包括hrv3c和tev)。图7a示出了具有冰核蛋白inak表面表达系统的示例性pgex-6p-1inak-cbm载体，该表面表达系统用于在小细胞的表面上展示cbm蛋白。编码cbm的核苷酸序列在其5'端连接到inak，在其3'端连接到6xhis、gfp纳米抗体和myc标签。图7b示出了示例性inak-cbm表面表达盒，该表面表达盒包含编码inak自转运蛋白易位结构域、cbm和gfp纳米抗体的核苷酸序列，并且具有标签(包括6xhis标签和myc标签)以及两个蛋白酶切割位点(包括hrv3c和tev)。图8a-d显示了小细胞表面上与aida-1接头蛋白融合的cbm蛋白的his-tag染色结果。小细胞是非透化的(图8a和8c)或透化的(图8b和8d)。与不具有重组aida-1cbm表达载体的对照小细胞(图8c和8d)相比，融合cbm由重组融合cbm表达载体在转化小细胞表面上表达(图8a和8b)。图8a显示了由未透化的蛋白酶缺乏的小细胞表达的cbm的his-tag染色。图8b显示了由透化的蛋白酶缺乏的小细胞表达的cbm的his-tag染色。图8c显示了未透化的对照小细胞几乎没有表达cbm。图8d还显示了透化的对照小细胞几乎没有表达cbm。箭头指出表达的cbm。图9a-b显示了在两个不同温度下用戊二醛处理以显示细胞保留三周的小细胞的光密度。图9a示出了将小细胞在25℃下用1％(v/v)戊二醛处理15天以及保持未处理(0％(v/v)戊二醛)。图9b示出了与未处理对照相比，将小细胞在37℃下用三种不同浓度的戊二醛(5％、1％和0.25％(v/v))处理15天。图10a示出了具有血清抗性自转运蛋白brka表面表达系统的示例性pgex-6p-1brk-acc_deaminase载体，该表面表达系统用于在小细胞的表面上展示两侧为6xhis、gfp纳米抗体和myc标签的acc脱氨酶蛋白。图10b示出了示例性brk-acc_deaminase表面表达盒，该表达盒包含编码brk自转运蛋白信号肽、gfp纳米抗体、acc脱氨酶和brk自转运蛋白易位结构域的核苷酸序列，并且具有标签(包括6xhis标签和myc标签)以及两个蛋白酶切割位点(包括hrv3c和tev)。图11显示了来自内部产生dsrna的小细胞的rna提取物。将rna样品上样到tae运行缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上。泳道1：来自invitrogen的1kbplus梯状物(箭头表示500bp标记)。泳道2：100ug从包含dsrna质粒(l4440)的小细胞捕获的rna，所述rna经消化以去除dsrna以外的任何核酸。泳道3：10ul未消化的实验捕获的rna，泳道4：100ug从未包含质粒的小细胞捕获的rna，所述rna经消化去除dsrna以外的任何核酸。泳道5：10ul未消化的对照捕获的rna。图12显示了来自包封外源产生的dsrna的小细胞的rna提取物。将rna样品上样到tae运行缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上。泳道1：来自invitrogen的1kbplus梯状物(箭头表示500bp标记)。泳道2：e9总rna提取物。泳道3：e10总rna提取物。泳道4：来自样品e1-e8的总rna提取物，将这些样品合并且用rna酶t1处理以去除任何单链rna。泳道5：c9总rna提取物。泳道6：c10总rna提取物。泳道7：来自样品c1-c8的总rna提取物，将这些样品合并且用rna酶t1处理以去除任何单链rna。泳道8：cacl2过程对照，以通过该程序确定dsrna损失(在实验过程中，将1582ngivt生成后未消化的500bpdsrna加载到200ul冷cacl2中)。泳道9：泳道8的重复。泳道10：te缓冲液对照，以通过该程序确定dsrna损失(在实验过程中，将1582ng体外转录(ivt)产物生成后未消化的500bpdsrna加载到200ul冷pbs中)。泳道11：泳道10的重复。泳道12：dsrna的对照消化物，以确定装载进行封装的dsrna相对于ssrna的组成(消化3ugivt产物以去除所有dna和单链rna并确定t1消化后ivt产物内dsrna的相对量)图13显示了将小细胞在4℃下用0.25％戊二醛处理五天后来自包封外源产生的dsrna的小细胞的rna提取物。将rna样品上样到tae运行缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上。泳道1：来自invitrogen的1kbplus梯状物(箭头表示500bp标记)。泳道2：t1消化的小细胞总rna提取物，因此仅存在dsrna。泳道3：t1消化的对照细胞总rna提取物，对照细胞是ht115b10小细胞。图14显示了将小细胞在室温下用rna酶a(50ug/ml)处理30分钟后来自包封外源产生的dsrna的小细胞的rna提取物。将rna样品上样到tae运行缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上。泳道1：来自invitrogen的1kbplus梯状物(箭头表示500bp标记)。泳道2：用cacl2处理并装载有80ugivt产物但未暴露于rna酶a的小细胞的总rna提取物。泳道3：用pbs处理并装载有80ugivt产物且暴露于rna酶a(50ug/ml)的小细胞的总rna提取物。泳道4：用cacl2处理并装载有80ugivt产物且暴露于rna酶a的小细胞的总rna提取物。泳道5：暴露于rna酶a(50ug/ml)的80ugivt产物。泳道6：暴露于dsrna的相同数量细胞(亲本和小细胞)的内部产生的rna酶a。图15a和图15b示出了用于包封和递送生物活性化合物(诸如dsrna、sirna或shrna)的基于无核细胞的平台的产生过程。图15a示出了缺核细胞和dsrna由不同的宿主细胞产生，并且在独立产生完成后一起孵育。缺核细胞缺少核糖核酸酶iii，从而确保dsrna一旦被包封就不会被分解。图15b示出了将我们的缺核细胞平台用来内部表达dsrna并包封一种或多种dsrna序列，目的是靶向一种或多种不同的害虫。这需要包封与缺核细胞中内部表达的dsrna序列同源或异源的dsrna。缺核细胞缺少核糖核酸酶iii，从而确保dsrna一旦被包封就不会被分解。图16示出了用于蛋白酶wpra敲除的示例性puc18载体，以由具有wpra蛋白酶的细菌菌株产生蛋白酶缺乏的小细胞。在puc18载体中插入重组dna插入物，该插入物包含wpra核苷酸序列基因的5'端核苷酸序列、带有cat启动子的氯霉素抗性基因(cmr)以及wpra基因的3'端。将两侧为wpra基因的5'和3'端的发夹环插入插入物中，以终止整合插入物的基因组中其他相邻基因的转录调控。图17a-b显示了大肠埃希氏菌(e.coli)中小细胞形成(图17a)以及其中敲除和/或移除了minc、mind和/或minc/d基因的核糖核酸酶缺乏的缺核小细胞(白色箭头)(图17b)的扫描电子显微图像。示例性小细胞的尺寸小于一微米，如图17b所示。图18a示出了用于在具有t7rna聚合酶的核糖核酸酶缺乏的菌株中表达目标蛋白的示例性pet-9a载体。图18b示出了用于在没有t7rna聚合酶的核糖核酸酶缺乏的菌株中表达目标蛋白的示例性pgex-6p-1载体。图19显示了在1.5mm、4-12％nupagebis-tris凝胶上运行以在sds-mes运行缓冲液中根据大小电泳分离蛋白质而得到的gst纯化级分。使用simplyblutmsafestain可视化凝胶内的蛋白质。对由ht115-b10细胞系产生的澄清细胞裂解物进行gst纯化，该细胞系被设计为使用pgex-6p-2_drb4_cal_t7质粒产生gst融合的drb4蛋白。将由该细胞系产生的所有级分指定为实验，而将使用未包含质粒的细胞系ht115-b10(其不会产生任何gst标记的蛋白质)的整个纯化过程设置为对照。泳道1：pagerulerplus预染蛋白梯状物，为10至250kda。泳道2和3：来自对照和实验裂解物的澄清裂解物。泳道4和5：通过使裂解物通过谷胱甘肽琼脂糖4bgst标记的蛋白质纯化树脂而产生的流过级分。泳道6-11：cw3：由对照裂解物产生的对照洗涤级分3，e：由实验裂解物产生的后续洗涤级分(从洗涤级分3开始)，表明在洗脱目标蛋白质(drb4*)之前已经充分洗涤树脂以去除几乎所有非特异性结合的蛋白质。泳道12和13：从相应的对照裂解物和实验裂解物产生的第一洗脱级分。明显可见，在实验裂解物产生的第一洗脱级分中在目标蛋白的大约预期大小(drb4*，约62kda)处存在蛋白质，而在第一对照级分中则不存在。在第二实验洗脱级分(泳道15)中再次看到相同的条带，而在对照洗脱级分(泳道14)中仍然没有。从这些结果可以确定，已经成功产生并完全纯化了drb4*蛋白。(cl：对照裂解物，el：实验裂解物，cft：对照流过物，eft：实验流过物，cw3：对照洗涤级分3，ew3：实验洗涤3，cw4：对照洗涤4，ew4：实验洗涤4，cw5：对照洗涤5，ew5：实验洗涤5，ce1：对照洗脱1；ee1：实验洗脱1；ce2：对照洗脱2；ee2：实验洗脱3)图20a显示了在存在drb4蛋白的情况下用cacl2溶液处理时，在包封内部产生的dsrna和外源产生的dsrna的小细胞中的dsrna包封和保留都有所增加。将rna样品上样到tae运行缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上。泳道1：来自invitrogen的1kbplus梯状物(箭头表示500bp标记)。泳道2：来自ht115野生型小细胞的总rna提取物，所述野生型小细胞与dsrna一起在pbs中孵育，所述pbs由于缺少ca2+阳离子的静电吸引而不允许dsrna进入细胞，但由于洗涤不完全而作为存在dsrna的对照。泳道3：来自ht115野生型小细胞的总rna提取物，所述野生型小细胞与dsrna一起在cacl2溶液中孵育，所述溶液允许dsrna进入细胞。明显可见，根据梯状物，在500bp标记处存在条带，表明成功包封。泳道4：泳道3的第一rna洗脱的t1核糖核酸酶消化物的第二洗脱级分。泳道5：来自ht115小细胞的总rna提取物，所述小细胞包含被设计为内部产生500bpdsrna的质粒，所述dsrna在具有外部产生的dsrna的pbs溶液中孵育。该dsrna在装载前表达过夜。泳道6：与泳道5的条件相同，但与dsrna在cacl2溶液中孵育，所述溶液允许dsrna进入细胞。明显可见，cacl2溶液使得在500bp处存在更强的条带，表明dsrna的产生和dsrna的装载会使得更多dsrna被包封。泳道7：泳道6的第一rna洗脱的t1核糖核酸酶消化物的第二洗脱级分。泳道8：来自ht115小细胞的总rna提取物，所述小细胞包含被设计为产生drb4*蛋白的质粒，所述蛋白与细胞内的dsrna结合且不允许其离开。将小细胞在具有外部产生的dsrna的pbs溶液中孵育。该蛋白质在装载前表达过夜。该蛋白质的存在以及在500bp标记处出现的所得条带表明，dsrna对ca2+阳离子的静电吸引可以在一定程度上被蛋白质的存在替换，以便将dsrna包封在小细胞内。第9泳道：条件与泳道8相同，但是将具有drb4蛋白的小细胞与外部产生的dsrna在cacl2溶液中孵育，这使得在500bp标记处存在更强的条带。泳道10：泳道9的第一rna洗脱的t1核糖核酸酶消化物的第二洗脱级分。图20b显示了在存在drb4蛋白的情况下用cacl2溶液处理时，在包封内部产生的dsrna和外源产生的dsrna的小细胞中的dsrna包封和保留都有所增加。将rna样品上样到tae运行缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上。泳道1：来自invitrogen的1kbplus梯状物(箭头表示500bp标记)。泳道2：来自与图20a的泳道3和4相同条件的第三洗脱级分。泳道3和4：来自与图20a的泳道5相同条件的相应第二洗脱级分和第三洗脱级分。泳道5：来自与图20a的泳道6和7相同条件的第三洗脱级分。泳道6和7：来自与图20a的泳道8相同条件的相应第二洗脱级分和第三洗脱级分。泳道8：来自与图20a的泳道9和10相同条件的第三洗脱级分。图21a示出了用于产生ubc9dsrna的具有秀丽隐杆线虫(c.elegans)ubc9靶基因插入物的示例性l4440dsrna载体。图21b示出了秀丽隐杆线虫ubc9靶基因的插入物的示例性插入，该插入物与l4440dsrna载体融合。图22a示出了用于产生ubc9dsrna的具有科罗拉多马铃薯甲虫b-肌动蛋白靶基因插入物的示例性l4440dsrna载体。图22b示出了科罗拉多马铃薯甲虫b-肌动蛋白的插入物的示例性插入，该插入物与l4440dsrna载体融合。图23示出了用于包封和递送生物活性化合物(诸如核酸和多肽)的基于无核细胞的平台。例如，可以将核酸(包括dsrna)包封在基于无核细胞的平台内。基于无核细胞的平台可以捕获内部产生或外部产生的dsrna并将其递送到靶标。另外，基于无核细胞的平台可以在其表面上具有一种或多种表面表达的融合蛋白。表面表达的融合蛋白中的一种可以是表面表达的结合蛋白，诸如cbm。另一方面，表面表达的融合蛋白可以是表面表达的活性蛋白/多肽，它们是生物活性化合物中的一种。因此，基于无核细胞的平台能够在其表面上表达至少两种不同的表面表达的融合蛋白并同时在平台内携带其他生物活性化合物，以便将它们递送到靶标。图24a-d示出了小细胞表面上与brk接头蛋白融合的acc脱氨酶蛋白的his-tag染色结果。小细胞是非透化的(图24a和24c)或透化的(图24b和24d)。与不具有重组brk_acc脱氨酶表达载体的对照小细胞(图24c和24d)相比，融合acc脱氨酶蛋白由重组融合brk-acc脱氨酶表达载体在转化小细胞表面上表达(图24a和24b)。图24a示出了由未透化的脱氨酶缺陷小细胞表达的acc脱氨酶的his-tag染色。图24b示出了由透化的蛋白酶缺乏的小细胞表达的acc脱氨酶的his-tag染色。图24c示出了未透化的对照小细胞没有表达acc脱氨酶。图24d还示出了透化的对照小细胞没有表达acc脱氨酶。箭头指出表达的acc脱氨酶。图25a-c示出了与三种表面表达机制(分别包括aida-1、brk和inak)融合的纯化脂肪酶蛋白的脂肪酶活性结果。从小细胞中纯化脂肪酶，并使用脂肪酶探针4-硝基苯基丁酸酯测试其活性。图25a示出了从表达重组aida-1脂肪酶融合表达载体的蛋白酶缺乏的小细胞中纯化的脂肪酶的活性。图25b示出了从表达重组brk-脂肪酶融合表达载体的蛋白酶缺乏的小细胞中纯化的脂肪酶的活性。图25c示出了从表达重组inak-脂肪酶融合表达载体的蛋白酶缺乏的小细胞中纯化的脂肪酶的活性。(蛋白酶缺乏对照：没有融合脂肪酶的蛋白酶缺乏的b8菌株，野生菌株对照：没有融合脂肪酶的野生型p678-54菌株，融合蛋白对照：没有脂肪酶活性的his标签纯化的cbm蛋白)图26a-c示出了小细胞表面上的融合脂肪酶蛋白的脂肪酶活性结果。通过在400nm下进行连续分光光度速率测定来分析反应的动力学分析。图26a示出了与aida-1融合的表面表达的脂肪酶的活性。图26b示出了与brk融合的表面表达的脂肪酶的活性。图26c示出了与inak融合的表面表达的脂肪酶的活性。具体实施方式本公开整体涉及一种新型递送系统的开发，以确保生物活性化合物诸如生物防治剂和/或生物刺激剂的靶向递送并以特定方式对靶标产生预期效果。另外，本公开涉及一种有效的包封和递送平台，所述平台用于维持生物防治剂和/或生物刺激剂的生物活性，直到以可规模化、靶向、成本有效的方式将生物活性化合物递送到其预期靶标。本公开整体涉及一种基于无核细胞的平台，所述平台用于包封生物活性化合物并以增加的特异性将其可规模化递送到靶标。另外，公开了用于将无染色体和/或无核细胞内的生物活性化合物稳定且靶向递送到靶细胞上和/或靶细胞中的组合物。本公开还提供了一种基于无核细胞的平台，所述平台除了具有包封生物活性化合物并将其可规模化递送到靶标的特征外，还在其表面上具有固定的酶活性多肽及其用途。此外，本公开提供了改善生物活性化合物在无染色体和/或无核细胞中的包封和保留以及将生物活性化合物局部递送到靶细胞中的方法。定义虽然相信以下术语很好被本领域普通技术人员理解，但是提出以下定义以有利于解释当前公开的主题。术语“一”或“一个”指该实体中的一个或多个，即可以指复数指示物。因此，术语“一”或“一个”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。此外，不定冠词“一”或“一个”所指的“要素”并不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个要素。如本文所用，“工业上适合的”是指在内部施用的动物宿主应用之外(例如在施用的人类疗法之外)的情况下基于无核细胞的递送平台的利用和应用。术语“生物活性”表示组合物或化合物本身具有生物作用，或者其修饰、引起、促进、增强、阻断、减少、限制具有生物作用的内源性分子的产生或活性或者与之反应或与结合。“生物作用”可以是但不限于影响植物中的生物过程；影响害虫、病原体或寄生虫中的生物过程；生成或引起生成可检测信号；等等。生物活性组合物、复合物或化合物可用于农业应用和组合物中。生物活性组合物、复合物或化合物可以引起或刺激对植物、昆虫、蠕虫、细菌、真菌或病毒的所需作用。所需作用的非限制性实例包括例如预防、治疗或治愈患有疾病或病症的植物中的所述疾病或病症；限制感染植物的害虫、病原体或寄生虫的生长或者杀死所述害虫、病原体或寄生虫；增加植物的表型或基因型；刺激植物对发芽、营养生长、开花、受精、结果和/或结籽和收获的积极反应；防治害虫引起疾病或障碍。在本公开的农业应用的上下文中，术语“生物活性”表示组合物、复合物或化合物具有以下活性：以积极的意义影响植物的营养和生殖生长，以积极的意义影响患有疾病或障碍的植物，和/或以消极的意义影响害虫、病原体或寄生虫。因此，生物活性组合物、复合物或化合物可在植物内引起或促进对以下各项的生长和/或维持有害的生物或生化活性：害虫、病原体或寄生虫；或具有异常生长或生化特性的植物细胞、组织或器官，和/或在宿主诸如植物内引起疾病或障碍的害虫、病原体或寄生虫。如本文所用，术语“生物防治”是指通过干扰害虫的生态状况(如通过将天敌或病原体引入环境中)来防治害虫。“生物防治剂”可与“生物防治试剂”互换使用，后者通常被称为拮抗剂。成功的生物防治可以降低目标物种的种群密度。术语“生物防治”作为生物防治试剂是指起源于生物物质并且可有效治疗、预防、改善、抑制、消除或延迟细菌、真菌、病毒、昆虫或任何其他植物害虫感染或侵染中的至少一种的发作并抑制孢子萌发和菌丝生长的化合物或组合物。应当理解，任何生物防治试剂对环境都是安全的，也就是说，它对目标物种有害，但是不会以非特异性方式严重破坏其他物种。此外，应当理解，术语“生物防治试剂”或“生物防治化合物”还涵盖术语“生化防治试剂”或“生化防治化合物”。生化防治试剂是半化学物质，例如植物生长调节剂、激素、酶、信息素、利己素和利它素，这些物质天然存在或与天然产物相同，可以激起、阻碍、破坏或以其他方式发挥农药活性。在一些实施方案中，生物防治剂是指生物活性化合物，即多肽、代谢物、化学信息素、激素、信息素和核酸(诸如rna生物分子，包括反义核酸、dsrna、shrna、sirna、mirna、核酶和适体)。如本文所用，术语“生物刺激剂”、“生物刺激剂类”或“生物刺激剂化合物”是指以提供给使用者、施加于植物、种子或根系环境土壤的形式存在的基于天然资源的任何微生物或物质，以及旨在刺激植物的自然过程以有益于其养分利用效率和/或其胁迫耐受性(无论其养分含量如何)的任何其他物质，或者旨在用于该用途的此类物质和/或微生物的任何组合。在一些实施方案中，生物刺激剂是指生物活性化合物，即多肽、代谢物、化学信息素、激素、信息素、微量营养素和核酸(诸如rna生物分子，包括反义核酸、dsrna、shrna、sirna、mirna、核酶和适体)。如本文所用，术语“生物农药”或“生物农药类”是指旨在预防、破坏或防治任何害虫的物质或物质混合物。具体地，该术语涉及可有效治疗、预防、改善、抑制、消除或延迟细菌、真菌、病毒、昆虫或其他害虫相关感染或侵染的发作、孢子萌发和菌丝生长的物质或混合物。在收获前或收获后也用作施加于作物的物质，以保护商品在储存和运输过程中不致变质。作为“生物农药类”的缩写，生物农药包括通过掠夺关系、寄生关系或化学关系进行的几种害虫管理干预措施。该术语在历史上一直与生物防治(暗示对活生物的操纵)相关。在一些实施方案中，生物农药是指生物活性化合物，即多肽、代谢物、化学信息素、激素、信息素、大量营养素、微量营养素和核酸(诸如rna生物分子，包括反义核酸、dsrna、shrna、sirna、mirna、核酶和适体)。术语“害虫”在本文中被定义为涵盖植物、人类或家畜疾病的载体；细菌、真菌、病毒、昆虫、线虫、螨虫、蜱虫或在生产、加工、储存、运输或销售食品、农产品、木材和木制品或动物饲料过程中造成损害或以其他方式造成干扰的任何生物的有害物种。昆虫害虫包括选自以下各项的昆虫：鞘翅目(coleoptera)、双翅目(diptera)、膜翅目(hymenoptera)、鳞翅目(lepidoptera)、食毛目(mallophaga)、同翅目(homoptera)、半翅目(hemiptera)、直翅目(orthroptera)、缨翅目(thysanoptera)、革翅目(dermaptera)、等翅目(isoptera)、虱亚目(anoplura)、隐翅目(siphonaptera)、毛翅目(trichoptera)等，尤其是鳞翅目和鞘翅目。本领域技术人员将认识到，并非所有化合物都对所有害虫同样有效。实施方案的化合物对昆虫害虫展示出活性，所述昆虫害虫可包括经济上重要的农学、森林、温室、苗圃观赏植物、食物和纤维、公共和动物健康、住宅和商业结构、家用和储存产品害虫。如本文所用，术语“细胞生物”或“微生物”应广义地理解。这些术语可互换使用，包括但不限于两个原核域即细菌和古细菌，以及某些真核真菌和原生生物。术语“原核生物”是本领域公认的，是指不包含细胞核或其他细胞器的细胞。通常将原核生物分类为两个域即细菌和古细菌中的一种。古细菌域与细菌域的生物之间的明确差异是基于16s核糖体rna中核苷酸碱基序列的基本差异。术语“古细菌”是指疵壁菌(mendosicutes)门的生物的分类，通常在不寻常的环境中发现并且通过几个标准与其余原核生物区别开来，包括核糖体蛋白的数量和细胞壁中缺少胞壁酸。根据ssrrna分析，古细菌由两个系统发生不同的组组成：泉古菌门(crenarchaeota)和广古菌门(euryarchaeota)。根据生理学，古细菌可以分为三种类型：产甲烷菌(产生甲烷的原核生物)；极端嗜盐菌(生活在很高浓度的盐(nacl)中的原核生物)；以及极端(超)嗜热菌(生活在很高温度下的原核生物)。这些原核生物除了具有使它们与细菌区别开来的统一古细菌特征(即，细胞壁中没有胞壁质，具有酯连接的膜脂质等)以外，还表现出使它们适应其特定生境的独特结构或生化属性。泉古菌门主要由超嗜热硫依赖性原核生物组成，而广古菌门包含产甲烷菌和极端嗜盐菌。“细菌”或“真细菌”是指原核生物域。细菌包括至少以下11个不同的组：(1)革兰氏阳性(gram+)细菌，其中有两个主要细分组：(1)高g+c组(放线菌(actinomycetes)、分枝杆菌(mycobacteria)、微球菌(micrococcus)等)，(2)低g+c组(芽孢杆菌(bacillus)、梭状芽孢杆菌(clostridia)、乳杆菌(lactobacillus)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、支原体(mycoplasmas))；(2)变形细菌(proteobacteria)，例如紫色光合+非光合革兰氏阴性细菌(包括最“常见”的革兰氏阴性细菌)；(3)蓝细菌(cyanobacteria)，例如含产氧光养生物；(4)螺旋菌(spirochetes)及相关种；(5)浮霉状菌(planctomyces)；(6)拟杆菌(bacteroides)、黄杆菌(flavobacteria)；(7)衣原体(chlamydia)；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也是厌氧光养生物)；(10)抗辐射微球菌及其亲属；(11)热袍菌(thermotoga)和嗜热栖热腔菌(thermosiphothermophiles)。“真核生物”是指其细胞内包含封闭在膜中的细胞核和其他细胞器的任何生物。真核生物属于类群真核域或真核生物域。将真核细胞与原核细胞(上述细菌和古细菌)区分开的定义特征是它们具有膜界定的细胞器，特别是细胞核，所述细胞核包含遗传物质并且被核膜包裹。术语“遗传修饰的宿主细胞”、“重组宿主细胞”和“重组菌株”在本文中可互换使用，是指已通过本公开的克隆和转化方法进行遗传修饰的宿主细胞。因此，这些术语包括已经过遗传改变、修饰或工程化以使其与其来源的天然存在的生物相比表现出改变、修饰或不同的基因型和/或表型(例如，当基因修饰影响微生物的编码核酸序列时)的宿主细胞(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞、cho、人细胞等)。应当理解，在一些实施方案中，这些术语不仅指所讨论的特定重组宿主细胞，而且还指这种宿主细胞的后代或潜在后代。术语“野生型微生物”或“野生型宿主细胞”描述了自然界中存在的细胞，即未经过遗传修饰的细胞。在本公开中，“野生型菌株”或“野生菌株”或“野生型细胞系”是指可以产生小细胞的细胞株/系。在一些实施方案中，野生型细菌菌株和/或细胞系诸如大肠埃希氏菌(e.coli)菌株p678-54和枯草芽孢杆菌(b.subtilis)菌株cu403可以使微型细胞缺乏dna。用于产生这种小细胞的方法是本领域已知的。参见例如adler等人,1967,proc.natl.acad.sci.usa57:321-326；inselburgj,1970j.bacteriol.102(3):642-647；frazer1975,curr.topicsmicrobiol.immunol.69:1-84；reeve等人,1973,j.bacteriol.114(2):860-873；以及mendelson等人,1974j.bacteriol.117(3):1312-1319。术语“遗传工程化”可指对宿主细胞的基因组进行任何操纵(例如，通过插入、缺失、突变或置换核酸)。术语“对照”或“对照宿主细胞”是指用于确定遗传修饰或实验处理的效果的适当的比较宿主细胞。在一些实施方案中，对照宿主细胞是野生型细胞。在其他实施方案中，对照宿主细胞在遗传上与遗传修饰的宿主细胞相同，除了使处理宿主细胞分化的遗传修饰外。如本文所用，术语“遗传连锁”是指在育种期间被高比率共同继承使得难以通过杂交进行分离的两个或更多个性状。如本文所用，“重组”或“重组事件”是指染色体互换或自由组合。如本文所用，术语“表型”是指个体细胞、细胞培养物、生物或生物组的可观察特征，其是由该个体的基因组成(即，基因型)与环境之间的相互作用产生的。如本文所用，术语“嵌合体”或“重组体”在描述核酸序列或蛋白质序列时是指将至少两个异源多核苷酸或两个异源多肽连接成单个大分子或者对至少一种天然核酸或蛋白质序列的一个或多个元件进行重排的核酸序列或蛋白质序列。例如，术语“重组”可以指通过例如化学合成或通过遗传工程化技术对分离的核酸片段进行操纵而将两个原本分离的序列片段进行人工组合。如本文所用，“合成核苷酸序列”或“合成多核苷酸序列”是自然界中不存在或非天然存在的核苷酸序列。通常，当与任何其他天然存在的核苷酸序列相比时，这种合成核苷酸序列将包含至少一个核苷酸差异。如本文所用，“合成氨基酸序列”或“合成肽”或“合成蛋白质”是自然界中不存在或非天然存在的氨基酸序列。通常，当与任何其他天然存在的蛋白质序列相比时，这种合成蛋白质序列将包含至少一个氨基酸差异。如本文所用，术语“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，其是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其类似物。该术语是指分子的一级结构，因此包括双链和单链dna以及双链和单链rna。它还包括修饰的核酸，诸如甲基化和/或加帽核酸、包含修饰碱基、骨架修饰的核酸等。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换使用。如本文所用，术语“基因”是指与生物学功能相关的任何dna片段。因此，基因包括但不限于其表达所需的编码序列和/或调控序列。基因还可以包括例如形成其他蛋白质的识别序列的未表达dna片段。基因可以从多种来源获得(包括从目标来源克隆或者从已知或预测的序列信息合成)，并且可包括被设计成具有所需参数的序列。如本文所用，术语“同源”或“同源物”或“直系同源物”在本领域中是已知的，是指拥有共同祖先或家族成员并且基于序列同一性程度确定的相关序列。术语“同源性”、“同源”、“基本上相似”和“基本上对应”在本文中可互换使用。它们是指以下核酸片段：其中一个或多个核苷酸碱基的变化不影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语还指本公开的核酸片段的修饰，诸如相对于未修饰的初始片段，基本上不改变所得核酸片段的功能特性的一个或多个核苷酸的缺失或插入。因此，本领域技术人员应当理解，本公开不仅仅涵盖特定的示例性序列。这些术语描述了在一个物种、亚种、变种、栽培品种或菌株中发现的基因与另一个物种、亚种、变种、栽培品种或菌株中发现的对应或等效基因之间的关系。出于本公开的目的，对同源序列进行了比较。认为、相信或已知“同源序列”或“同源物”或“直系同源物”在功能上相关。功能关系可以多种方式中的任何一种来表示，包括但不限于：(a)序列同一性程度和/或(b)相同或相似生物学功能。优选地，同时表示(a)和(b)。同源性可以使用本领域中容易获得的软件程序来确定，诸如在currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel等人编辑，1987)增刊30，第7.718节，表7.71中讨论的那些软件程序。一些比对程序是macvector(oxfordmolecularltd,oxford,u.k.)、alignplus(scientificandeducationalsoftware,pennsylvania)和lignx(vectornti,invitrogen,carlsbad,ca)。另一个比对程序是sequencher(genecodes,annarbor,michigan)，其使用默认参数。如本文所用，术语“内源”或“内源基因”是指其在宿主细胞基因组内天然发现的位置处的天然存在的基因。在本公开的上下文中，将异源启动子可操作地连接到内源基因是指在现有基因天然存在的位置中将异源启动子序列遗传插入该基因前面。本文所述的内源基因可以包括已经根据本公开的任何方法进行突变的天然存在的基因的等位基因。如本文所用，术语“外源”与术语“异源”可互换使用，是指来自天然来源以外的某个来源的物质。例如，术语“外源蛋白质”或“外源基因”是指来自非天然来源或位置并且已被人工提供给生物系统的蛋白质或基因。如本文所用，术语“核苷酸改变”是指例如核苷酸取代、缺失和/或插入，这是如本领域所熟知的。例如，突变包含产生沉默取代、添加或缺失但不改变编码蛋白质的特性或活性或蛋白质的形成方式的改变。如本文所用，术语“蛋白质修饰”是指例如氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失和/或插入，这是如本领域所熟知的。如本文所用，术语核酸或多肽的“至少一部分”或“片段”是指具有此类序列的最小大小特征的部分或全长分子的任何较大片段，直至并包括完全长分子。本公开的多核苷酸的片段可编码遗传调控元件的酶促活性部分。遗传调控元件的酶促活性部分可以通过分离本公开的多核苷酸中的一种的包含遗传调控元件的一部分并且如本文所述评估活性来制备。类似地，多肽的一部分可以是4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸，依此类推，直至全长多肽。要使用的部分的长度将取决于特定的应用。可用作杂交探针的核酸的一部分可短至12个核苷酸；在一些实施方案中，为20个核苷酸。可用作表位的多肽的一部分可短至4个氨基酸。执行全长多肽的功能的多肽的一部分通常将长于4个氨基酸。变体多核苷酸还涵盖来源于诱变和重组过程诸如dna改组的序列。这种dna改组的策略是本领域已知的。参见例如stemmer(1994)pnas91:10747-10751；stemmer(1994)nature370:389-391；crameri等人(1997)naturebiotech.15:436-438；moore等人(1997)j.mol.biol.272:336-347；zhang等人(1997)pnas94:4504-4509；crameri等人(1998)nature391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。对于本文公开的多核苷酸的pcr扩增，可以将寡核苷酸引物设计用于pcr反应，以从从任何目标生物中提取的cdna或基因组dna扩增对应的dna序列。设计pcr引物和pcr克隆的方法是本领域公知的，公开于sambrook等人(2001)molecularcloning:alaboratorymanual(第3版,coldspringharborlaboratorypress,plainview,newyork)。还可参见innis等人编辑(1990)pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(academicpress,newyork)；innis和gelfand编辑(1995)pcrstrategies(academicpress,newyork)；以及innis和gelfand编辑(1999)pcrmethodsmanual(academicpress,newyork)。pcr的已知方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。如本文所用，术语“引物”是指当置于诱导引物延伸产物合成的条件下(即，在存在核苷酸和聚合试剂诸如dna聚合酶的情况下并且在合适的温度和ph下)时能够退火至扩增靶标以允许dna聚合酶附着从而作为dna合成的起始点的寡核苷酸。(扩增)引物优选地是单链的，以实现最大扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在存在聚合试剂的情况下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度和引物的组成(a/t与g/c含量)。一对双向引物由一个正向引物和一个反向引物组成，这在dna扩增领域中(诸如pcr扩增中)很常用。如本文所用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能rna的表达的dna序列。在一些实施方案中，启动子序列由近端和远端的上游元件组成，后者元件通常被称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的dna序列，并且可以是启动子的固有元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可整体来源于天然基因，或由来源于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成dna片段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可指导基因在不同的组织或细胞类型中或者在不同的发育阶段或者响应于不同的环境条件而表达。应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全定义，因此某些变异的dna片段可能具有相同的启动子活性。如本文所用，短语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组dna构建体”在本文中可互换使用。另外，“构建体”、“载体”和“质粒”在本文中可互换使用。重组构建体包含核酸片段例如自然界中都未发现的调控和编码序列的人工组合。例如，嵌合构建体可包含来源于不同来源的调控序列和编码序列，或者来源于相同来源但以不同于自然界中发现的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可单独使用或可与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解载体上必须存在的遗传元件才能成功地转化、选择和繁殖包含本公开的任何分离核酸片段的宿主细胞。本领域技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式(jones等人,(1985)emboj.4:2411-2418；dealmeida等人,(1989)mol.gen.genetics218:78-86)，因此必须筛选多个事件才能获得展示出所需表达水平和模式的品系。这种筛选可通过dna的southern分析、mrna表达的northern分析、蛋白质表达的免疫印迹分析或表型分析等来完成。载体可以是质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等，它们可以自主复制或可以整合到宿主细胞的染色体中。载体也可以是不能自主复制的裸rna多核苷酸、裸dna多核苷酸、在同一链内由dna和rna组成的多核苷酸、多赖氨酸结合的dna或rna、肽结合的dna或rna、脂质体结合的dna等。如本文所用，术语“表达”是指产生功能性终产物，例如mrna或蛋白质(前体或成熟)。在本文中，“可操作地连接”是指将根据本公开的启动子多核苷酸与另外的寡核苷酸或多核苷酸进行顺序排列，从而引起所述另外的多核苷酸转录。如本文所用，术语“展示”是指目标多肽暴露在小细胞的外表面上。作为非限制性实例，展示的多肽可以是在小细胞膜上表达或与小细胞膜结合的蛋白质或蛋白质结构域，使得细胞外结构域或目标结构域暴露在小细胞膜的外表面上(在小细胞的表面上表达和展示，或在亲代细胞中表达以在分体/出芽小细胞的表面上展示)。在所有情况下，“展示的”蛋白质或蛋白质结构域可用于与细胞外组分相互作用。膜结合蛋白可具有多于一个细胞外结构域，并且本公开的小细胞可展示多于一种膜结合蛋白。如本文所用，术语“多肽”、“蛋白质”和“蛋白质结构域”是指由通过肽键连接的氨基酸的单链组成的大分子。本发明的多肽可包含天然存在的氨基酸、合成氨基酸、遗传编码的氨基酸、非遗传编码的氨基酸及其组合。多肽可包括l型和d型氨基酸。如本文所用，术语“酶促活性多肽”是指编码酶促功能蛋白的多肽。术语“酶促活性多肽”包括但不限于执行生物学功能的融合蛋白。示例性酶促活性多肽包括但不限于与特定受体或生物/化学底物特异性结合以实现诸如生物学信号转导或化学灭活的生物学功能的酶/酶部分(例如野生型、变体或工程化的变体)。如本文所用，术语“蛋白酶缺乏菌株”是指缺乏一种或多种内源蛋白酶的菌株。例如，蛋白酶缺乏可以通过缺失、去除、敲除、沉默、抑制或以其他方式下调至少一种内源蛋白酶而产生。所述蛋白酶可以包括灾难性蛋白酶。例如，bl21(de3)大肠埃希氏菌菌株缺乏蛋白酶lon和ompt。大肠埃希氏菌菌株具有可以大大减少蛋白质在细胞膜上的产生和定位的细胞质蛋白酶和膜蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶缺乏菌株可以使目标蛋白质在细胞膜上的的产生和定位最大化。在本公开中，“蛋白酶缺乏”可以互换地用作“无蛋白酶”。如本文所用，术语“核糖核酸酶缺乏菌株”是指缺乏一种或多种内源核糖核酸酶的菌株。例如，核糖核酸酶缺乏可以通过缺失、去除、敲除、沉默、抑制或以其他方式下调至少一种内源核糖核酸酶而产生。所述核糖核酸酶可以包括核糖核酸酶iii。例如，ht115大肠埃希氏菌菌株缺乏rna酶iii。在一些实施方案中，核糖核酸酶缺乏菌株不能识别dsrna并在特定的靶向位置对其进行切割和/或识别dsrna并在特定的靶向位置对其进行切割的能力有所降低。在本公开中，“核糖核酸酶缺乏”可以互换地用作“无核糖核酸酶”。如本文所用，术语“无核细胞”是指缺少细胞核并且也缺少染色体dna的细胞，也可以被称为“缺核细胞”。由于真细菌和古细菌细胞与真核细胞不同，天然没有核(包含染色体的独特细胞器)，因此当然可以更准确地将这些非真核细胞描述为“没有染色体”或“无染色体”。但是，本领域技术人员除了提及其他真核小细胞外，还在提及细菌小细胞时经常使用术语“无核”。因此，在本公开中，术语“小细胞”涵盖缺少染色体的真细菌细胞的衍生物；缺少染色体的古细菌细胞的衍生物，以及缺少细胞核因此缺少染色体的真核细胞的缺核衍生物。因此，在本公开中，“无核细胞”或“缺核细胞”可以与术语“无染色体细胞”互换使用。如本文所用，术语“结合位点”是指一种分子结构或化合物，诸如这种分子结构或化合物中的蛋白质、多肽、多糖、糖蛋白、脂蛋白、脂肪酸、脂质或特定区域，或这种分子结构或化合物的特定构象，或这类分子结构或化合物的组合或复合物。在某些实施方案中，至少一个结合位点在完整的活植物上。如本文所用，“完整的活植物”是指其生长时的植物，无论其在土壤中、在水中还是在人工基质中生长，以及无论其在田间、在温室里、在院子里、在花园中、在花盆中还是在水培系统中生长。完整的活植物优选地包括自然界中通常存在于植物上的所有植物部分(根、茎、枝、叶、针、刺、花、种子等)，但是某些植物部分诸如花在植物生命周期的某些时期可能不存在。如本文所用，“结合结构域”是指能够使用特定的分子间相互作用与靶分子结合的似蛋白质(蛋白质、蛋白质样或含蛋白质)分子的全部或部分。结合结构域可以是天然存在的分子，其可以来源于天然存在的分子，或者其可以是完全人工设计的。结合结构域可以基于蛋白质(包括但不限于微生物蛋白质、抗体、酶、蛋白酶抑制剂、蛋白质毒素、纤连蛋白、脂蛋白、单链反平行卷曲螺旋蛋白或重复基序蛋白)中存在的结构域。此类结合结构域的非限制性实例是碳水化合物结合模块(cbm)(诸如要靶向植物的纤维素结合结构域)、acc脱氨酶、角质酶、纤维素等。在一些实施方案中，细胞粘附部分包含结合结构域。在其他实施方案中，细胞刺激部分包含结合结构域。在其他实施方案中，细胞降解部分包含结合结构域。如本文所用，“载剂”、“可接受载剂”或“生物活性可接受载剂”是指可与组合物一起施用到靶标并且不会不利地影响该组合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。在一些实施方案中，生物活性化合物可以用作已经成为新时代保护和增强作物的生物防治剂和生物刺激剂。生物防治的一个实例是rnai或rna干扰，其用于沉默靶标害虫中的基因，从而将它们杀死，同时使非靶标害虫不受伤害。在无脊椎动物中，长dsrna可以有效地用于沉默基因表达，而不会激活dsrna激活的蛋白激酶(pkr)或已经表明在哺乳动物细胞系统中发生的干扰素反应。另一个实例是递送蛋白质毒素来对抗害虫。蛋白质毒素的一个实例是口服活性杀虫肽-1(oaip-1)，其对昆虫具有很高的毒性，效力与合成杀虫剂吡虫啉相似。该oaip-1毒素可以从澳大利亚狼蛛的毒液中分离，其可以用作本公开中教导的生物活性化合物中的一种。可以将几丁质酶作为杀真菌剂递送到植物中。植物抗体是生物防治剂的另一种形式，可以用于特异性靶害虫。可以将免疫球蛋白结构域、轻链、重链以及cdr、fv、fab和fc区域包封为活性化合物并递送到靶标。本公开提供了杀真菌抗体，诸如由葡糖神经酰胺产生的抗体。植物生长调节剂、激素、酶、信息素、利己素和利它素也是生物防治剂。信息素可以作为生物防治剂以防止臭虫和/或昆虫交配。从种子发芽到植物成熟，生物刺激剂可以在整个作物生命周期中以多种经证实的方式促进植物发育。可以将它们施加于植物、种子、土壤或可增强植物吸收养分并正常发育的能力的其他生长介质。通过促进互补的土壤微生物并改善代谢效率、根系发育和养分输送，生物刺激剂可以在重量、种子和果实方面增加产量，提升品质(从而影响糖含量、颜色和贮藏寿命)，提高用水效率，以及增强胁迫耐受性和恢复力。这些生物刺激剂可以包括信息素或酶，如acc脱氨酶。生物刺激剂是产生非营养植物生长反应并且通过增强胁迫耐受性来降低胁迫的化合物。可将产生营养反应的肥料视为生物刺激剂。生物刺激剂的许多重要益处基于它们影响激素活性的能力。植物中的激素(植物激素)是调节植物正常发育以及对环境的反应的化学信使。根和芽生长以及其他生长反应受植物激素的调节。生物刺激剂中的化合物可以改变植物的激素状态并对其生长和健康产生重大影响。海藻、腐殖酸和维生素b是生物刺激剂的常见组分，它们是影响植物生长和激素活性的重要化合物来源。抗氧化剂是另一组植物化学物质，在调节植物对环境和化学胁迫(干旱、热、紫外光和除草剂)的反应中很重要。当植物受到胁迫时，“自由基”或活性氧分子(例如过氧化氢)会损害植物细胞。抗氧化剂可抑制自由基毒性。抗氧化剂水平高的植物在正常和胁迫环境下都能产生更好的根和芽生长、保持较高的叶水分含量并降低疾病发生率。施加生物刺激剂可增强抗氧化剂活性，从而增强植物的防御系统。维生素c、维生素e和诸如甘氨酸的氨基酸是生物刺激剂中所含的抗氧化剂。生物刺激剂可起到刺激土壤或其他植物生长介质中存在的微生物生长的作用。生物刺激剂能够刺激微生物接种剂中包括的微生物生长。因此，期望获得一种生物刺激剂，当与微生物接种剂一起使用时，其能够增强天然微生物和接种剂微生物的种群。在一些实施方案中，本公开提供了一种工业上适合的基于无核细胞的平台和/或工业制剂，其可以通过使用本文所述的基于无核细胞的平台和/或工业制剂以可规模化、成本有效的方式局部递送生物防治剂和生物刺激剂。还可以修饰该基于无核细胞的平台和/或工业制剂，以将生物防治剂和生物刺激剂侵入性地递送到植物(包括水产养殖植物)。一方面，该基于无核细胞的平台和/或工业制剂使用缺少核糖核酸酶(核糖核酸酶iii)的细菌细胞，并且具有t7、t3或sp6rna聚合酶启动子来产生用于靶标rna干扰(rnai)的dsrna。然后修饰该细菌细胞，以产生其中包封有dsrna的小细胞。这有助于简化纯化和包封并降低纯化和包封的成本。通过包封dsrna，可保护dsrna分子免受环境rna酶的影响。例如，害虫(包括昆虫)口服消耗小细胞以递送dsrna。进入昆虫体内后，dsrna成为rna酶iii样蛋白(称为dicer或dicer样蛋白)的底物。dicer似乎优先在dsrna的末端启动dsrna切割，从而进行连续切割以生成21至24bp的小干扰(si)rna双链体，进而沉默和/或抑制其靶标转录物并抑制转录物翻译。将所得的sirna双链体装载到称为rna诱导的沉默复合物(risc)的多蛋白复合物中，在该复合物中，去除了随员(有义)链，而引导(反义)链仍保留在靶mrna上以便进行沉默。risc中的引导链使复合物与互补的mrna转录物进行碱基配对，并通过称为argonaute蛋白的一类蛋白质对靶mrna进行酶切，从而阻止靶mrna翻译。这就是导致靶标害虫死亡同时使非靶标害虫不受伤害的原因。另外，该基于无核细胞的平台和/或工业制剂可以用来包封dsrna、sirna、shrna或mirna。在其他方面，可以将反义核酸、核酶或适体包封在该平台内。在一些实施方案中，该基于无核细胞的平台和dsrna由不同的宿主细胞产生，并且在独立产生完成后一起孵育。在一些实施方案中，该基于无核细胞的平台可以用来从能够在缺核小细胞内产生dsrna的重组质粒中内部表达dsrna。然后，将内部产生的dsrna递送到缺核小细胞内的靶标。在其他实施方案中，该基于无核细胞的平台可以用来包封外部和/或外源产生的dsrna(其首先在缺核小细胞外部产生)。然后，将包封在小细胞中的外部产生的dsrna递送到缺核小细胞内的靶标。在其他实施方案中，该基于无核细胞的平台可以用来在该平台内内部表达dsrna，并将外源产生的dsrna的一个或多个序列包封到该平台中，以靶向一种或多种不同害虫。这需要包封与缺核细胞中内部表达的dsrna序列同源或异源的dsrna。因此，该基于无核细胞的平台可以将内部表达的dsrna和外部表达但包封的dsrna两者运载到达其预期靶标。本公开教导了该基于无核细胞的平台和/或工业制剂可以将内部产生的dsrna和外部/外源产生的dsrna单独或一起递送到靶细胞。靶细胞不是哺乳动物细胞。本公开教导了一种用于包封和递送至少一种生物活性化合物的工业上适合的基于无核细胞的平台和/或工业制剂，其包含：来源于核糖核酸酶缺乏的亲代细胞的完整无核细胞，所述细胞在所述细胞内包含至少一种生物活性化合物，其中所述生物活性化合物是核酸，其中所述核酸靶向靶细胞内编码多肽的转录物，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。该基于无核细胞的平台和/或工业制剂还包含至少一种生物学上可接受的载剂。在一些实施方案中，对于蛋白质介导的生物防治剂，本公开使用缺少蛋白酶的细菌细胞，并且具有t7、t3或sp6聚合酶启动子来产生大量的蛋白质。然后修饰该细菌细胞，以产生其中包封有蛋白质或蛋白质固定到其表面的小细胞。将表达蛋白质的质粒整合到细菌的类核dna中，以安全有效地产生蛋白质。然后昆虫与表达或保留所需蛋白质的小细胞相互作用或口服消耗这些小细胞。对于抗体介导的生物防治剂，小细胞可以表达或包封抗体，以特异性靶向有害害虫。小细胞可以递送作为针对昆虫或真菌病原体的高度特异性生物农药的抗体或重组抗体(raymond等人,fungalbiologyreview25(2):84-88,2011)。在一些实施方案中，对于生物刺激剂，本公开教导了小细胞可以将大范围的促进植物生长的生物分子递送到植物的表面、种子和根系。许多这些生物分子是由于某些微生物与植物之间存在的且响应于某些环境诱因或胁迫而自然产生的动态共生关系而产生的。可以对小细胞进行工程化，以为在细胞外固定在表面上或在细胞内包封的这些促进植物生长的生物分子提供高有效载荷能力，而无需依靠微生物或植物自然产生这些生物分子。这使得可以将更高有效浓度的这些生物分子递送到植物微环境，同时还允许对农业投入需求作出更可控制的适应性响应。许多这些生物分子是细菌在细胞内或细胞外产生的酶，它们在促进土壤肥力和防御植物病原体方面起着重要作用(jog等人,journalofappledmicorbiology113:1154-1164,2012；sathya等人3biotech7:102,2017)。其他生物分子如1-氨基环丙烷-1-羧酸酯(acc)脱氨酶可以通过降低植物微环境中的乙烯水平来在激素水平上调节植物生长(souza等人,genet.mol.biol.38(4):401-419,2015)。在一些实施方案中，生物活性化合物是可以使用小细胞产生并递送到植物或其根系的有价值的酶，包括但不限于纤维素酶、植酸酶、几丁质酶、蛋白酶、磷酸酶、核酸酶、脂肪酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、肽酶、过氧化物酶、木质素酶、果胶酶、半纤维素酶和角蛋白酶。除了能够有效递送酶以促进植物生长之外，本文所述的小细胞还可以递送在促进植物生长中起作用的其他高价值生物分子。这些生物分子包括但不限于植物激素(诸如生长素iaa)、肽、初级代谢物和次级代谢物。在一些实施方案中，生物活性化合物是信息素，用于改善和修饰化学反应，从而作为生物刺激剂帮助植物生长并抵抗胁迫。在其他实施方案中，生物防治剂和生物刺激剂的递送可以通过在小细胞的表面上表达的结合结构域来辅助。例如，小细胞可以表达要靶向植物的结合结构域，诸如碳水化合物结合模块(cbm)。这些结构域可以更好地保留在植物表面上，从而防止径流或漂移。在一些实施方案中，小细胞表达包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分的融合蛋白，其中所述靶细胞粘附部分包含碳水化合物结合模块。靶细胞粘附部分包含选自由以下各项组成的组的碳水化合物结合模块：纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域。在其他实施方案中，小细胞还可以表达促使其被植物吸收以通过叶表面或根进行侵入性递送的各种蛋白质。在一些实施方案中，小细胞可以在其表面上表达和展示生物活性化合物，诸如多肽和/或蛋白。在其他实施方案中，小细胞可以在其表面上表达和展示表面表达的结合蛋白和生物活性化合物，诸如多肽和/或蛋白。表面表达的结合蛋白作为上述碳水化合物结合模块(cbm)。表面表达的具有生物/酶促活性的多肽/蛋白包含细胞刺激部分和/或细胞降解部分。此类活性蛋白的非限制性实例包括但不限于acc脱氨酶、几丁质酶、纤维素酶、植酸酶、几丁质酶、蛋白酶、磷酸酶、核酸酶、脂肪酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、肽酶、过氧化物酶、木质素酶、果胶酶、半纤维素酶和角蛋白酶。在一些实施方案中，这些蛋白质是外源表达的并且被包封在小细胞中。在其他实施方案中，这些蛋白质在小细胞的表面上内部表达并固定。诸如此类蛋白质的生物活性化合物在小细胞外部表达后被包封在小细胞内，或者在小细胞内部表达并在小细胞的表面上展示。在其他实施方案中，小细胞在其表面上表达至少一种生物活性化合物并同时包封另一种生物活性化合物。因此，小细胞可以在小细胞内和小细胞的表面上运载至少两种生物活性化合物。此类蛋白质的非限制性实例包括但不限于acc脱氨酶、纤维素酶、植酸酶、几丁质酶、蛋白酶、磷酸酶、核酸酶、脂肪酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、肽酶、过氧化物酶、木质素酶、果胶酶、半纤维素酶和角蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白质是用作生物防治化合物的脂肪酶。在其他实施方案中，蛋白质是用作生物刺激剂化合物的脂肪酶。在其他实施方案中，蛋白质是用作生物刺激剂化合物的acc脱氨酶。在一些实施方案中，蛋白质是用作生物防治化合物的脂肪酶。在其他实施方案中，蛋白质是用作生物刺激剂化合物的脂肪酶。在其他实施方案中，蛋白质是用作生物刺激剂化合物的acc脱氨酶。在一些实施方案中，小细胞表达包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞降解部分的融合蛋白，其中所述靶细胞降解部分包含角质酶和纤维素。本公开教导了通过利用微生物的rna合成和不对称分裂能力在发酵周期中产生和包封rna生物分子，包括反义核酸、dsrna、shrna、sirna、mirna、核酶或适体。该基于无核细胞的平台和/或工业制剂解决了对将核糖核酸(rna)递送到系统提出巨大挑战的三个关键问题：(1)可规模化合成和包封rna，(2)合成/包封的寡核苷酸有效载荷必须在此过程中得以生存；(3)靶向递送该rna生物分子，使其到达目标组织或细胞并引起所需的表型反应。目前的rna递送形式是将sirna直接偶联到n-乙酰半乳糖胺(galnac)，用阳离子脂质和其他赋形剂配制rna(通常经化学修饰)可以保护寡核苷酸免受环境的影响以压缩其大小，进行化学修饰以稳定用于rnai应用的寡核苷酸，诸如用2'-甲氧基和2'-氟部分替换核糖环上的2'-羟基基团。对于dsrna产生，与体内细菌产生dsrna相比，体外转录非常昂贵。还存在用于产生dsrna的无细胞和蛋白质衣壳过程。由于修饰物种的繁殖，细菌模型伴随有环境污染的风险。这种繁殖会对环境中天然存在的物种产生不利和无法预料的后果。小细胞是天然突变产生的。将小细胞用于rna的纯化和递送允许利用发酵的益处来大规模产生dsrna，而没有与使用遗传修饰的细菌相关的风险。使用小细胞递送前毒素和酶也比使用遗传修饰的细菌作为生物农药更好。生物活性化合物本公开提供了一种用于包封和递送生物活性化合物的新型基于无核细胞的平台和/或工业制剂。在一些实施方案中，该基于无核细胞的平台和/或工业制剂包含完整无核细胞，所述细胞包含至少一种生物活性化合物。作为非限制性实例，生物活性化合物是核酸、多肽、代谢物、化学信息素或微量营养素。目前，农业行业对开始用合成化合物的生物衍生对应物代替一些这些合成化合物有很大的兴趣。这些生物活性化合物可以大致分为生物防治剂和生物刺激剂。生物防治剂本公开教导了生物活性化合物作为生物防治剂，包括但不限于rnai、前毒素、代谢物、抗体、发酵产物、激素、信息素和化学信息素。在一些实施方案中，生物活性化合物是多肽。在其他实施方案中，多肽是蛋白质毒素，包括bt毒素。在其他实施方案中，多肽不是bt毒素。rnai相关核酸即rnai生物分子包括dsrna、mirna、sirna和mirna。这些rnai生物分子可以通过在小细胞内内部产生或通过外部产生并将rna装载到小细胞中来获得。rnai生物分子可用于：i)生物胁迫，通过将rnai生物分子靶向递送到靶细胞内的靶转录物并随时间释放来防治昆虫、杂草、真菌、病毒或寄生虫，ii)非生物胁迫诸如干旱，通过靶向递送rnai生物分子以增强植物的耐旱性(也可以用作生物刺激剂)，以及iii)水产养殖，通过预防、治疗、控制鱼、贝类、甲壳动物的疾病。在一些实施方案中，作为生物防治剂的生物活性化合物是核酸，所述核酸选自由以下各项组成的组：反义核酸、双链rna(dsrna)、短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、核酶、适体及其组合。毒素可以通过在小细胞内内部产生或通过蛋白质/毒素在小细胞的表面上表面表达来获得。例如，由金龟子绿僵菌(metarhiziumanisopliaecan)分泌的脂肪酶可以通过小细胞将递送到靶标，并作为参与宿主感染过程的重要生物防治试剂起作用(beysdasilva等人,fungalbiol.114(1):10-15,2010)。在一些实施方案中，生物活性化合物是多肽。在其他实施方案中，多肽是蛋白质毒素。在其他实施方案中，多肽不是bt毒素。在一些实施方案中，多肽是用作生物防治化合物的脂肪酶。代谢物可以在小细胞内内部表达或被包封在小细胞中。微生物挥发性有机化合物可以用作生物防治剂和生物刺激剂。抗体可以在小细胞内内部表达或被包封在小细胞中。高度特异性生物试剂可以表面表达或内部表达。例如，具有重链抗体及其抗原结合片段但缺少轻链的纳米抗体由于尺寸较小而具有较高的稳定性，由于更快速清除未结合抗体而具有较低的毒性，具有附加的施用途径，并且具有增加的制造生产效率。纳米抗体可以通过小细胞递送，以作为作物的生物防治剂。发酵产物诸如多杀菌素可以在小细胞内内部表达或被包封在小细胞中。化学信息素诸如信息素、利己素、利它素和互利素可以在小细胞内内部表达或被包封在小细胞中。信息素是一类微生物挥发性有机化合物，可以作为昆虫和其他无脊椎动物的引诱剂和驱避剂。它们可以用作防治各种病原体的生物防治试剂以及用作促进植物生长的生物肥料。它们甚至在收获后用于预防植物病害(kanchiswamy等人,trendsplantsci.40(4):206-211,2015)。信息素可以是天然产生的或合成产生的。信息素可以用于促进植物生长。来源于微生物的某些信息素能够在各种胁迫条件下促进某些植物生长。例如，已经表明来源于芽孢杆菌属的2,3-丁二醇可以诱导系统抗性并在如高盐度的胁迫条件下促进植物生长(ryu等人,plantphysiol.134(3):1017-1026,2004；ryu等人,pnas100(8):4927-2932,2003)。信息素也可以用于害虫管理。通常来源于昆虫的某些信息素能够用作生物防治试剂。它们可以是可以吸引并杀死靶害虫的制剂的一部分，或者它们可以用于大量捕获害虫种群(witzgall等人,jchemecol.36(1):80-100,2010)。例如，已证实信息素((z)-9-十六烷烯醛、(z)-ll-十六烷烯醛和(z)-9-十八烷烯醛，即三化螟(scirpophagaincertulas)信息素的组分)能够防治水稻上的稻黄螟(三化螟)的种群(cork等人,bulletinofentomologicalresearch,86(5):515-524)。信息素的类型如下：i)聚集信息素在配偶选择中起作用，通过大量攻击和防御捕食者来克服宿主抵抗力。一个位置的一组个体被称为聚集，无论是由一种性别还是两种性别组成，ii)警报信息素在某些物种中起作用，以在受到可以触发相同物种成员飞行(在蚜虫中)或侵略(在蚂蚁、蜜蜂、白蚁中)的捕食者攻击时释放挥发性物质，iii)疏散信息素用于产卵方面的领域标记，iv)释放信息素是引起接受者行为改变的信息素。例如，某些生物使用强大的引诱剂分子从两英里或更远的距离处吸引配偶，v)信号信息素引起短期变化，诸如激活反应的神经递质释放，vi)引物信息素触发发育事件变化，vii)领域信息素标记生物领域的边界和身份，viii)踪迹信息素常被昆虫使用。例如，蚂蚁用由挥发性碳氢化合物组成的信息素标记其路径。某些蚂蚁带着食物返回巢穴时会留下最初的信息素踪迹，ix)性信息素指示雌性对育种的可用性。雄性动物也可发射传达关于它们的物种和基因型的信息的信息素，以及其他信息素，诸如那氏信息素(工蜂)、蜂后信息素(蜜蜂)、镇静(缓和)信息素(哺乳动物)、由油酸和亚油酸组成的坏死素(由死亡并分解的生物体发出)。另外，z-9-乙酸十四碳烯酯用作引诱剂。在一些实施方案中，信息素可以用作生物防治剂的形式。信息素提出了用于昆虫防治的新型环境安全策略。信息素遵循通过化学通信抑制剂、信息素和基于植物的挥发物以及引诱剂-杀死和推-拉策略进行破坏交配的过程。在一些实施方案中，本文公开的基于无核细胞的平台和/或工业制剂可以包封生物活性化合物作为生物防治剂并以可规模化、靶向、成本有效的方式递送它们。在一些实施方案中，生物防治化合物是肽、多肽、发酵产物、代谢物、抗体、化学信息素或微量营养素。在一些实施方案中，多肽是用作生物防治化合物的脂肪酶。生物刺激剂本公开教导了生物活性化合物作为生物刺激剂。这些生物刺激剂的非限制性实例包括激素和生化生长剂。这些活性物质包括脱落酸(与胁迫下的休眠机制有关)、生长素(正面影响植物生长)、细胞分裂素(影响细胞分裂和芽形成)、acc脱氨酶(降低乙烯的抑制生长作用)、赤霉素(通过延长茎和刺激花粉管生长正面影响植物生长)以及用于正面和负面调节植物生长的许多其他活性物质(油菜素内酯、水杨酸、茉莉酸酯、植物肽激素、多胺、一氧化氮、独脚金内酯、卡里金(karrikin)和三十烷醇)。在一些实施方案中，本文公开的基于无核细胞的平台和/或工业制剂可以包封生物活性化合物作为生物刺激剂并以可规模化、靶向、成本有效的方式递送它们。在一些实施方案中，生物活性化合物是信息素，用于改善和修饰化学反应，从而作为生物刺激剂帮助植物生长并抵抗胁迫。在一些实施方案中，生物活性化合物是肥料、植物微量营养素和植物大量营养素(包括但不限于氮、钾和磷)以及痕量营养素(诸如铁、铜、锌、硼、锰、钙、钼和镁)。在一些实施方案中，生物刺激剂包括微生物特性(诸如根瘤菌(pgpr)特性、真菌特性)、细胞分裂素、植物激素、肽和acc脱氨酶。例如，固氮可以通过经由小细胞递送脲酶和/或固氮酶以辅助固氮来实现。在一些实施方案中，生物刺激剂包括酸(诸如腐殖物质、腐黑物、富里酸、维生素b、氨基酸、脂肪酸/脂质)、提取物(诸如羧基类、植物药类、化感物质、甜菜碱、多胺、多酚、壳聚糖和其他生物聚合物)、亚磷酸盐、磷酸盐增溶剂、含氮化合物、无机盐、蛋白质水解物和有益元素。作为一个实例，壳聚糖是由无规分布的(1-4)-连接的d-葡萄糖胺和n-乙酰基-d-葡萄糖胺组成的线性多糖。它是通过几丁质的脱乙酰作用商业生产的，几丁质是自然界中第二丰富的多糖，通常在真菌和节肢动物的外骨骼的细胞壁中发现。它由几丁质、n-乙酰基-d-葡萄糖胺和d-葡萄糖胺的共聚物形成。基于壳聚糖的物质在植物中诱导多个防御基因，诸如病程相关基因(即葡聚糖酶和几丁质酶)。壳聚糖在活性氧清除系统中诱导酶，诸如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶。来自壳聚糖的引发其反应的信号转导途径涉及过氧化氢和一氧化氮信号，并且还可通过与染色质相互作用直接控制基因表达。壳聚糖可以用于刺激植物生长和非生物胁迫抗性，并诱导病原体抗性(pichyangkura等人,scientiahorticulturae196(30:49-65,2015)。作为另一个实例，蛋白质水解物具有增加大范围作物的发芽、生产和质量的潜力。蛋白质水解物还可以减轻盐度、干旱和重金属的负面影响。蛋白质水解物可以刺激碳和氮代谢，并干扰激素活性。蛋白质水解物可以提高植物生长底物中的养分有效性，并增加植物中的养分吸收和使用效率。蛋白质水解物也可以刺激植物微生物组；蛋白质水解物提供的底物诸如氨基酸可以为植物相关微生物提供食物来源。在一些实施方案中，所述生物刺激剂化合物是肽、多肽、发酵产物、代谢物、抗体、化学信息素或微量营养素。在一些实施方案中，多肽是用作生物刺激剂化合物的脂肪酶。在一些实施方案中，多肽是用作生物刺激剂化合物的acc脱氨酶。小细胞小细胞是异常的不对称细胞分裂的结果，并且含有膜、肽聚糖、核糖体、rna、蛋白质，通常还含有质粒，但没有染色体。(frazerac和curtissiii,production,propertiesandutilityofbacterialminicells,curr.top.microbial.immunol.69:1-84(1975))。因为小细胞缺少染色体dna，所以小细胞不能分裂或生长，但是它们可以继续其他细胞过程，诸如atp合成、质粒dna的复制和转录以及mrna的翻译。尽管染色体不分离成小细胞，但是染色体外和/或游离遗传表达元件可分离，或者可在与亲本细胞分离后被引入小细胞。在实施方案中，本文所述的小细胞是非天然存在的。在一些实施方案中，本公开提供了包含多个小细胞的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了包含多个小细胞的组合物，所述小细胞在所述细胞内包含至少一种生物活性化合物。在一些实施方案中，本公开提供了包含多个小细胞的组合物，其中所述多个小细胞中的每个小细胞包含展示在小细胞的表面上的酶促活性多肽，其中所述酶促活性多肽具有酶活性。酶活性来源于本公开中公开的酶促活性多肽。在一些实施方案中，本发明提供了一种包含多个完整细菌来源的小细胞的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了一种包含多个完整细菌来源的小细胞的组合物，所述小细胞在所述细胞内包含至少一种生物活性化合物。在一些实施方案中，本发明提供了一种包含多个完整细菌来源的小细胞的组合物，其中所述多个小细胞中的每个小细胞包含展示在细菌小细胞的表面上的酶促活性多肽，其中所述酶促活性多肽具有酶活性。在一些实施方案中，所述组合物包含小细胞，所述小细胞还包含展示在细菌小细胞的表面上的第二多肽，以增加与一个和/或多个受试对象的粘附，所述受试对象包括但不限于酶的底物、受体、金属、塑料、土壤、细菌、真菌、病原体、病菌、植物、动物、人类等。在一些实施方案中，所述组合物包含小细胞的混合物，其中混合的小细胞群体内的某些小细胞展示酶促活性多肽或展示包括增加受试对象粘附的多肽在内的第二多肽或展示两者。真细菌小细胞小细胞的一种类型是真细菌小细胞。有关真细菌细胞周期和分裂过程的综述，参见rothfield等人,annu.rev.genet.,33:423-48,1999；jacobs等人,proc.natl.acad.sci.usa,96:5891-5893,1999年5月；koch,appl.andenvir.microb.,第66卷，第9期，第3657-3663页；bouche和pichoff,molmicrobiol,1998.29:19-26；khachatourians等人,jbacteriol,1973.116:226-229；cooper,resmicrobiol,1990.141:17-29；以及danachie和robinson,“celldivision:parametervaluesandtheprocess”,escherichiacoliandsalmonellatyphimurium:cellularandmolecularbiology,neidhardt,frederickc.主编,americansocietyformicrobiology,washington,d.c.,1987,第2卷,第1578-1592页，以及其中引用的参考文献；以及lutkenhaus等人,“celldivision”第101章,escherichiacoliandsalmonellatyphimurium:cellularandmolecularbiology,第2版,neidhardt,frederickc.主编,americansocietyformicrobiology,washington,d.c.,1996,第2卷,第1615-1626页，以及其中引用的参考文献。当dna复制和/或染色体分配发生变化时，在完成染色体dna转移之前，膜结合囊泡从亲本细胞“夹断”。由于这种类型的分裂功能失调，产生了含有完整外膜、内膜、细胞壁和所有细胞质组分但不含有染色体dna的小细胞。在一些实施方案中，细菌来源的小细胞是由包括但不限于以下各项的菌株产生的：大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、芽孢杆菌属某些种(bacillusspp.)、沙门氏菌属某些种(salmonellaspp.)、李斯特菌属某些种(listeriaspp.)、分枝杆菌属某些种(mycobacteriumspp.)、志贺菌属某些种(shigellaspp.)或耶尔森氏菌属某些种(yersiniaspp.)。在一些实施方案中，细菌来源的小细胞是由天然产生小细胞的菌株产生的。这种产生天然小细胞的菌株例如以2:1的比例产生小细胞(每一个小细胞2个细菌细胞)。在某些实施方案中，天然产生小细胞的示例性细菌菌株包括但不限于大肠埃希氏菌菌株编号p678-54(大肠埃希氏菌遗传保藏中心(cgsc)编号：4928)和枯草芽孢杆菌菌株cu403。作为一个实例，枯草芽孢杆菌smc基因突变会导致小细胞的产生(britton等人,1998,genesanddev.12:1254-1259；moriya等人,1998,molmicrobiol29:179-87)。预计各种细胞中的smc基因破坏会导致由此产生小细胞。作为另一个实例，枯草芽孢杆菌的diviva基因突变会导致小细胞产生。当在大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌或粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)中表达时，diviva-gfp蛋白被靶向其中的细胞分裂位点，即使在大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌或粟酒裂殖酵母中似乎不存在diviva的清晰同源物(david等人,2000,emboj.19:2719-2727)。枯草芽孢杆菌过表达或低表达diviva或其同源物可用于减少多种细胞中的小细胞产生。在一些实施方案中，产生小细胞的细菌是革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠埃希氏菌、沙门氏菌属某些种(包括鼠伤寒沙门氏菌)、志贺菌属某些种(包括弗氏志贺菌)、铜绿假单胞菌、土壤杆菌属、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、乳杆菌属某些种、淋病奈瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae)和嗜肺军团菌(legionellapneumophila)。在一些实施方案中，产生小细胞的革兰氏阴性细菌可以产生由与细胞分裂和/或染色体分配相关的内源或外源突变天然引起的小细胞。在一些实施方案中，产生小细胞的细菌包含与细胞分裂和/或染色体分配有关的一个或多个内源或外源基因，其中与对应的野生型基因相比，所述基因经过遗传修饰，诸如通过同源重组。在一些实施方案中，产生小细胞的革兰氏阴性细菌天然和/或通过本文公开的遗传工程化技术缺乏蛋白酶和/或其活性。在一些实施方案中，产生蛋白酶缺乏的小细胞的革兰氏阴性细菌包含重组表达载体，所述重组表达载体包含与本公开中公开的目标蛋白质有关的一个或多个基因。在一些实施方案中，产生小细胞的细菌可以是革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性菌包括但不限于枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、葡萄球菌属某些种(streptococcusspp.)或链球菌属某些种(streptococcusspp.)。在一些实施方案中，产生小细胞的革兰氏阳性细菌可以产生由与细胞分裂和/或染色体分配有关的内源或外源突变天然引起的小细胞。在一些实施方案中，产生小细胞的革兰氏阳性细菌包含与细胞分裂和/或染色体分配有关的一个或多个内源或外源基因，其中与对应的野生型基因相比，所述基因经过遗传修饰，诸如通过同源重组。在一些实施方案中，产生小细胞的革兰氏阳性细菌天然和/或通过本文公开的遗传工程化技术缺乏蛋白酶和/或其活性。在一些实施方案中，产生蛋白酶缺乏的小细胞的革兰氏阳性细菌包含重组表达载体，所述重组表达载体包含与本公开中公开的目标蛋白质有关的一个或多个基因。产生小细胞的细菌可以是嗜极细菌。嗜极细菌包括但不限于嗜热菌(包括水生栖热菌(thermusaquaticus))、嗜冷菌、嗜压菌、嗜盐细菌、嗜酸菌、嗜碱菌、厌氧菌、无机自养菌、贫营养菌、耐金属菌、贫营养菌、嗜干菌或聚嗜极菌。在一些实施方案中，产生小细胞的嗜极端细菌可以产生由与细胞分裂和/或染色体分配相关的内源或外源突变天然引起的小细胞。在一些实施方案中，产生小细胞的嗜极端细菌包含与细胞分裂和/或染色体分配有关的一个或多个内源或外源基因，其中与对应的野生型基因相比，所述基因经过遗传修饰，诸如通过同源重组。在一些实施方案中，产生小细胞的嗜极端细菌天然和/或通过本文公开的遗传工程化技术缺乏蛋白酶和/或其活性。在一些实施方案中，产生蛋白酶缺乏的小细胞的嗜极端细菌包含重组表达载体，所述重组表达载体包含与本公开中公开的目标蛋白质有关的一个或多个基因。真核微细胞无染色体真核小细胞(即缺核细胞)在本发明的范围内。酵母细胞用于产生真菌小细胞。参见例如lee等人,ibd1p,apossiblespindlepolebodyassociatedprotein,regulatesnucleardivisionandbudseparationinsaccharomycescerevisiae,biochimbiophysacta3:239-253,1999；kopecka等人,amethodofisolatinganucleateyeastprotoplastsunabletosynthesizetheglucanfibrillarcomponentofthewalljgenmicrobiol81:111-120,1974；以及yoo等人,fissionyeasthrp1,achromodomainatpase,isrequiredforproperchromosomesegregationanditsoverexpressioninterfereswithchromatincondensation,nuclacidsres28:2004-2011,2000。酵母中的细胞分裂由gould和simanis,thecontrolofseptumformationinfissionyeast,genes&dev11:2939-51,1997)综述。在一些实施方案中，真核微细胞可以由酵母细胞诸如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(pichiapastoris)和/或粟酒裂殖酵母产生。作为一个实例，编码trf拓扑异构酶的酵母基因突变会导致小细胞的产生，并且已经有人指出存在酵母trf基因的人类同源物(castano等人,1996,nucleicacidsres24:2404-10)。酵母克罗莫结构域atp酶hrp1突变会导致异常的染色体分离(yoo等人,2000nuc.acidsres.28:2004-2011)。预计trf和/或hrp1功能破坏会导致各种细胞中的小细胞产生。裂变酵母中与隔膜形成有关的基因(参见例如gould等人,1997genesanddev.11:2939-2951)可以以类似的方式使用。血小板是真核小细胞的非限制性实例。血小板是缺核细胞，几乎没有能力进行从头蛋白质合成。血小板中蛋白质合成的严格调控(smith等人,1999,vascmed4:165-72)可允许外源蛋白质产生过量，同时允许内源蛋白质产生不足。凝血酶激活的表达元件诸如与bcl-3相关的表达元件(weyrich等人,signal-dependenttranslationofaregulatoryprotein,bcl-3,inactivatedhumanplatelets,cellbiology95:5556-5561,1998)可用于调节血小板中外源基因的表达。作为另一个非限制性实例，真核小细胞由肿瘤细胞系产生(gyongyossy-issa和khachatourians,tumourminicells:single,largevesiclesreleasedfromculturedmastocytomacells(1985)tissuecell17:801-809；melton,cellfusion-inducedmouseneuroblastomashprtrevertantswithvariantenzymeandelevatedhprtproteinlevels(1981)somaticcellgenet.7:331-344)。酵母细胞用于产生真菌小细胞。参见例如lee等人,ibd1p,apossiblespindlepolebodyassociatedprotein,regulatesnucleardivisionandbudseparationinsaccharomycescerevisiae,biochimbiophysacta3:239-253,1999；kopecka等人,amethodofisolatinganucleateyeastprotoplastsunabletosynthesizetheglucanfibrillarcomponentofthewalljgenmicrobiol81:111-120,1974；以及yoo等人,fissionyeasthrp1,achromodomainatpase,isrequiredforproperchromosomesegregationanditsoverexpressioninterfereswithchromatincondensation,nuclacidsres28:2004-2011,2000。酵母中的细胞分裂由gould和simanis,thecontrolofseptumformationinfissionyeast,genes&dev11:2939-51,1997)综述。在一些实施方案中，本公开教导了酵母小细胞的产生。古细菌小细胞术语“古细菌”被定义为如本领域所用，并且包括极端嗜热菌和其他古细菌(woese,c.r.,l.magrum.g.fox.1978.archaebacteria.journalofmolecularevolution.11:245-252)。三种古细菌是嗜盐菌、嗜热菌和产甲烷菌。根据生理学定义，古细菌(非正式地，古生菌)是单细胞极端嗜热菌(包括嗜热嗜酸菌)、硫酸盐还原菌、产甲烷菌和极端嗜盐菌。古细菌的嗜热成员包括实验室中培养的最嗜热生物。需氧嗜热菌也是嗜酸的；它们将其环境中的硫氧化为硫酸。极端嗜盐菌是需氧的或微需氧的，并且包括已知的最耐盐的生物。硫酸盐还原古细菌在极端环境中将硫酸盐还原为硫化物。产甲烷菌是严格的厌氧菌，但它们产生了至少两个单独的需氧组：嗜盐菌和嗜热嗜酸谱系。嗜盐菌的非限制性实例包括红皮盐杆菌(halobacteriumcutirubrum)和地中海盐富饶菌(halogeraxmediterranei)。产甲烷菌的非限制性实例包括沃氏甲烷球菌(methanococcusvoltae)；香草甲烷球菌(methanococcusvanniela)；嗜热自养甲烷杆菌(methanobacteriumthermoautotrophicum)；沃氏甲烷球菌(methanococcusvoltae)；甲烷嗜热菌(methanothermusfervidus)；以及巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)。嗜热菌的非限制性实例包括棕色固氮菌(azotobactervinelandii)；嗜酸热原体(thermoplasmaacidophilum)；掘越氏火球菌(pyrococcushorikoshii)；激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)；以及泉古菌门(极端嗜热古细菌)物种，诸如硫磺矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)和嗜酸热硫化叶菌(sulfolobusacidocaldarius)。古细菌小细胞在本发明的范围内。古细菌具有真细菌小细胞基因和蛋白质的同源物，诸如来自激烈热球菌的mind多肽(hayashi等人,emboj.20:1819-28,2001)。因此，作为非限制性实例，可以通过诸如以下方法产生古细菌小细胞：过表达从原核生物或古细菌分离的小基因的产物；或通过例如引入目标古细菌中小基因的突变或反义分子来破坏该小基因的表达。参见例如laurence等人,genetics152:1315-1323,1999。根据生理学定义，古细菌(非正式地，古生菌)是单细胞极端嗜热菌(包括嗜热嗜酸菌)、硫酸盐还原菌、产甲烷菌和极端嗜盐菌。古细菌的嗜热成员包括实验室中培养的最嗜热生物。需氧嗜热菌也是嗜酸的；它们将其环境中的硫氧化为硫酸。极端嗜盐菌是需氧的或微需氧的，并且包括已知的最耐盐的生物。硫酸盐还原古细菌在极端环境中将硫酸盐还原为硫化物。产甲烷菌是严格的厌氧菌，但它们产生了至少两个单独的需氧组：嗜盐菌和嗜热嗜酸谱系。在一些实施方案中，本公开教导了古细菌小细胞的产生。来源于内生菌的小细胞内生菌是在植物内生存至少其生命周期的一部分的内共生体，通常是细菌或真菌。内生菌可以将其自身从环境运输到植物的内部器官。内生菌的非限制性实例包括敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)、慢生根瘤菌属(bradyrhizobium)、根瘤菌属(rhizobium)、紫红红球菌(rhodococcusrhodochrous)、炭疽菌属(colletotrichum)、弯孢属(curvularia)、香柱菌属镰刀菌属(fusarium)、球腔菌属(mycosphaerella)、内生真菌(neotyphodium)、梨形孢属(piriformospora)和梨型孢菌属(serendipita)。在一些实施方案中，本公开教导了内生菌来源的小细胞的产生。在其他实施方案中，内生菌来源的小细胞可以进入内部植物细胞、组织或器官，并用作侵入性小细胞。真菌内生菌具有在细胞间或细胞内定殖的能力。定殖过程涉及几个步骤，包括宿主识别、孢子萌发、表皮穿透和组织繁殖。一旦内生菌成功地在宿主组织中定殖，内生菌生态位就得以建立。在内生菌生态位中，内生菌将从植物碎片、渗出液和浸出液获得可靠的营养来源，并保护宿主免受其他微生物影响(gao等人,2010)。在一些实施方案中，由真菌内生菌产生的小细胞可以使用其侵入性能力将其表面内和/或表面上的活性化合物传递到靶标。来源于植物病原体细菌的小细胞本公开提供了可以用于小细胞产生的植物病原体细菌，包括但不限于(1)丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)致病变种；(2)青枯罗尔斯通菌(ralstoniasolanacearum)；(3)根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)；(4)水稻黄单胞菌水稻致病变种(xanthomonasoryzaepv.oryzae)；(5)野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)致病变种；(6)地毯草黄单胞菌(xanthomonasaxonopodis)致病变种；(7)淀粉欧文氏菌(erwiniaamylovora)；(8)苛养木杆菌(xylellafastidiosa)；(9)迪基氏菌(dickeya)(达旦提迪基氏菌(dickeyadadantii)和茄迪基氏菌(dickeyasolani))；(10)胡萝卜软腐果胶杆菌(pectobacteriumcarotovorum)和黑腐果胶杆菌(pectobacteriumatrosepticum)，(11)棍状杆菌(clavibacter)(密执安棍状杆菌(clavibactermichiganensis)和马铃薯环腐棍状杆菌(clavibactersepedonicus))，(12)萨氏假单胞菌(pseudomonassavastanoi)，以及(13)候选柑橘黄龙病菌(candidatusliberibacterasiaticus)。这种植物病原体细菌天然具有在其自然状态下穿透并侵入内部宿主组织的能力。在一些实施方案中，来源于上述植物病原体细菌的小细胞可以以其天然的侵入、穿透和/或传递到靶标的内部部分中的能力将本文公开的生物活性化合物天然地递送到靶宿主的内部细胞、组织和/或器官中。例如，发现某些病原体细菌会分泌降解细胞壁的内切葡聚糖酶和内聚半乳糖醛酸酶，这可能解释了穿透到根内球中的原因。其他病原体细菌可以通过气孔穿透到气孔下腔，并在叶肉的细胞间空间定殖。由这些病原体细菌产生的小细胞具有天然的侵入、穿透和/或传递能力并利用该能力来可规模化和靶向递送本文公开的活性化合物。细菌小细胞产生小细胞是由与细胞分裂和/或染色体分配有关的基因发生突变和/或过表达或低表达该基因的亲本细胞产生的，或者是由暴露于某些条件下导致细胞裂变(分裂)过程中细菌细胞异常裂变和/或异常染色体分离分配的亲本细胞产生的。术语“亲本细胞”或“亲代细胞”是指产生小细胞的细胞。小细胞(大多数缺少染色体dna(mulder等人,molgengenet,221:87-93,1990))通常但不是必须小于其亲本细胞。小细胞是无染色体的膜包封的生物纳米颗粒(≤400nm)，由细菌在细菌细胞的正常分裂装置被破坏后形成。小细胞的尺寸也可以为400nm至650nm。本质上，小细胞是正常细菌细胞的具有代谢活性的小型复制品，不同之处在于它们不含染色体dna，因此它们是不可分裂且不可存活的。尽管小细胞不含染色体dna，但已经证明质粒、rna、天然和/或重组表达蛋白质以及其他代谢物都能够分离成为小细胞。产生小细胞的细菌菌株的一些构建方法在美国专利申请序列号10/154,951(美国公开号us/2003/0194798a1)中详细讨论，该申请全部据此通过引用并入。破坏染色体复制与细胞分裂之间的协调会导致大多数杆状原核生物的极性区域形成小细胞。破坏染色体复制与细胞分裂之间的协调可以通过过表达与隔膜形成和二分裂有关的某些基因来促进。替代地，小细胞可以在调节隔膜形成和二分裂的基因发生突变的菌株中产生。如在许多不同的原核生物中所证明，染色体分离机制受损也会导致小细胞形成。基于质粒的小细胞产生方法在一些实施方案中，小细胞产生可以通过过表达或突变与将新生染色体分离成子细胞的基因来实现。例如，已经证实大肠埃希氏菌的parc或mukb基因座发生突变可以产生小细胞。在一个家族成员中过表达或突变能够驱动小细胞产生的细胞分裂基因可以用于在另一个家族成员中产生小细胞。例如，已经证明在其他肠杆菌科(enterobacteriacea)家族成员(诸如沙门氏菌属和志贺菌属)以及其他种类成员(诸如假单胞菌属)中过表达大肠埃希氏菌ftsz基因将导致相似水平的小细胞产生。在一些实施方案中，小细胞可以在大肠埃希氏菌中通过过量产生蛋白质ftsz(其是大肠埃希氏菌操作的min分裂系统必不可少的组分)来产生。在大肠埃希氏菌中过量产生该蛋白质会导致该环不能在空间上被限制在细胞的中部，因此会导致在细胞分裂时产生小细胞。由于过量产生ftsz可以产生小细胞，因此可以使用基于质粒的系统过表达ftsz。在基于突变的小细胞产生细菌菌株中也可以证实这一点。例如，任何细菌菌株中缺失min基因座都会导致小细胞产生。其中突变可以导致小细胞形成的细胞分裂基因包括但不限于小基因(诸如minc、mind和mine)。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌依赖于小系统以确保亲本细胞正确复制成子细胞。该小系统(称为minb操纵子)由mind、minc和mine3部分组成。这些基因共同作用以控制由聚合的ftsz蛋白组成的z环的位置。minc由两个不同的结构域组成，这两个结构域都与ftsz蛋白直接相互作用以抑制聚合(z环形成)。mind是一种与在细胞的一极处形成并朝向细胞的中点聚合的膜相关的蛋白质。它结合分布在整个细胞质中的minc。mine是一种也与mind结合并释放minc的蛋白质。它聚合成环状并在细胞中从一极振动到另一极。在一些实施方案中，可以操纵该系统以在复制完成时将z-环移动到细胞的不包括类核dna的极端。可以通过不允许细胞将minc隔绝到细胞的极端来移动z-环。在缺少minc或mind或者过表达mine的情况下，大肠埃希氏菌细胞将形成无染色体和/或缺核细胞。引起不对称细胞分裂的ftsz和min系统在piet等人,1990,proc.natl.acad.sci.usa87:1129-1133以及xuan-chuan等人,2000,j.bacteriol.182(21):6203-62138中举例说明，上述文献中的每一者通过引用并入本文。可以使用同源重组以位点定向方式引入基因。同源重组允许对内源基因进行位点特异性修饰，因此可纠正遗传或获得突变，并且/或者可将新的改变工程化到基因组中。植物中的同源重组和位点定向整合在例如美国专利号5,451,513、5,501,967和5,527,695中讨论。在一些实施方案中，通过利用包括同源重组在内的传统基因工程化技术缺失、突变、敲除或破坏细菌中的minc、mind和/或minc和mind基因来产生小细胞。在其他实施方案中，通过在细菌中过表达某些基因诸如ftsz和/或mine来产生小细胞。小细胞的控制产生在一些实施方案中，本公开教导了通过引入、缺失或替换基因组dna的选定部分来突变细胞群体。因此，在一些实施方案中，本公开教导了用于将突变靶向特定基因座(诸如ftsz、minc、mind、minc/d和mine)的方法。在其他实施方案中，本公开教导了使用基因编辑技术(诸如zfn、talens、crispr或归巢内切核酸酶)来选择性地编辑靶dna区域。在各方面，靶向的dna区域是ftsz、minc、mind、minc/d和mine。工程化的核酸酶(诸如锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、工程化的归巢内切核酸酶以及rna或dna引导的内切核酸酶(诸如crispr/cas，诸如cas9或cpf1))特别适合执行本公开的某些方法。另外或替代地，可以使用rna靶向系统，诸如具有rna靶向核酸酶的crispr/cas系统。在一些实施方案中，本领域技术人员可以理解，本文公开的cas9可以是文献中描述的任何变体，包括但不限于以下文献中描述的功能性突变：fonfara等人nucleicacidsres.2014年2月，42(4):2577-90；nishimasuh.等人cell.2014年2月27日，156(5):935-49；jinekm.等人science.2012337:816-21；以及jinekm.等人science.2014年3月14日，343(6176)；另外参见提交于2013年3月15日的美国专利申请号13/842,859，该专利据此通过引用并入；进一步参见美国专利号8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,895,308、8,906,616、8,932,814、8,945,839、8,993,233、和8,999,641，这些专利全部据此通过引用并入。因此，在一些实施方案中，本文公开的系统和方法可以与具有双链核酸酶活性的野生型cas9蛋白、作为单链切口酶的cas9突变体、不具有核酸酶活性的失活cas9(dcas9)或具有修饰的核酸酶活性的突变体一起使用。在一些实例中，ii型核酸酶可以是催化死亡的(例如dcas9、“死亡cas9”、“失活cas9”)，使得其与靶序列结合但不裂解。dcas9是cas9蛋白(crispr)的变体，其活性位点发生改变，不再能够编辑基因组，但仍可以使用引导rna与基因组的高度特异性片段结合。如果结合，该蛋白质可以终止基因的转录。在一些实施方案中，可以将dcas9基因置于诱导控制下，使得其表达将受到控制。可以将min系统内与敲除相对应的引导rna包括在质粒中或切入基因组并置于诱导控制下。在用该系统诱导后，引导rna会将dcas9蛋白引导到min系统内的基因，以终止其表达。终止该基因(诸如minc、mind和minc/d)表达将导致小细胞形成。抗生素抗性敲入-敲除在一些实施方案中，本公开教导了使用利用lambda-red重组系统的遗传操作技术来编辑与外源表达盒(诸如选择标记，诸如抗生素抗性基因)整合的基因组。在一些实施方案中，将选择标记诸如抗生素抗性基因整合到宿主基因组(例如细菌)中，以敲除minc/d/cd基因从而诱导小细胞产生。如果在成功选择靶基因(诸如minc/d/cd)被敲除的小细胞后不再需要具有抗生素抗性的标记，则可以使用翻转酶从宿主基因组中去除整合的抗生素抗性基因盒。将线性dna的片段插入基因组中，该片段由与该基因组同源的片段指导。这可以用于通过用抗生素抗性盒进行替换来敲入目标基因或敲除目标基因，诸如氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、大观霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、红霉素抗性基因、博来霉素抗性基因和博来霉素抗性基因。然后选择成功的遗传操作来使用该抗生素抗性盒。如果在抗性盒内包括翻转酶重组靶标(frt)位点以进行进一步的遗传操作，则可以在选择靶小细胞后将其用于体内去除整合到基因组中的抗生素抗性基因。用于这一目的的酶是重组酶翻转酶，通常使用温度敏感复制起点从可以从细胞系中去除的质粒表达。重组酶翻转酶在抗生素抗性盒的5'和3'端识别两个相同的frt位点，并去除这两个位点之间的dna。在一些实施方案中，frt位点可以包括在抗生素抗性盒内以在其使用后去除抗生素抗性盒。小细胞产生菌株大肠埃希氏菌p678-54菌株是从大肠埃希氏菌遗传保藏中心(cgsc)获得的，并用于产生小细胞(adler等人,1967,proc.natl.acad.sci.usa57:321-326；inselburgj,1970j.bacteriol.102(3):642-647；frazer1975,curr.topicsmicrobiol.immunol.69:1-84)。在一些实施方案中，无核细胞是从p678-54大肠埃希氏菌亲代菌株产生的。由p678-54亲代细菌菌株产生的无核细胞被用作用于包封和递送生物活性化合物的基于无核细胞的平台和/或工业制剂。蛋白酶缺乏细菌菌株本公开提供了使用遗传工程化技术从b菌株产生小细胞，所述b菌株包括缺乏lon蛋白酶(细胞质)和ompt蛋白酶(外膜)的bl21、bl21(de3)和bl21-ai。因此，可以利用作为蛋白酶缺乏菌株的b菌株来产生蛋白酶缺乏和/或蛋白酶缺乏的小细胞。de3名称表示相应的菌株包含λde3溶菌原，该溶菌原在lacuv5启动子的控制下携带t7rna聚合酶的基因。需要iptg最大限度地诱导t7rna聚合酶的表达，以表达克隆到t7启动子下游的重组基因。bl21(de3)适合从t7或t7-lac启动子或者被大肠埃希氏菌rna聚合酶识别的启动子(例如lac、tac、trc、parabad、prhabad和t5启动子)表达。bl21(de3)的基因型为：fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5。bl21-ai大肠埃希氏菌包含将编码t7rna聚合酶(rnap)的基因染色体插入arabad操纵子的arab基因座中，从而将t7rnap的调控置于阿拉伯糖诱导的arabad启动子的控制之下。因此，该菌株对于表达可能对t7rnap基础表达有漏洞的其他bl21菌株来说有毒的基因特别有用。bl21-ai菌株不含离子蛋白酶，并且缺乏外膜蛋白酶ompt。bl21-ai的基因型为f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcmarab::t7rnap-teta。bl21-ai具有控制t7rna聚合酶产生的阿拉伯糖启动子，而bl21(de3)具有控制t7rna聚合酶产生的lac启动子。这很重要，因为lac启动系统有漏洞。因此，bl21-ai蛋白产生由于阿拉伯糖启动系统而受到更严格的调控。本公开教导了可以使用lps(脂多糖)修饰的bl21(de3)细胞。对大肠埃希氏菌的lps进行修饰以使其毒性显著降低。如果必要，对bl21(de3)细胞的lps进行这种修饰。这也可以扩展到其他革兰氏阴性细菌细胞。安全使用革兰氏阴性细胞可能对基于无核细胞的平台和/或工业制剂是有益的。bl21(de3)细胞是具有修饰lps(脂质iva)的可商购获得的感受态细胞，其不会在不同细胞中触发内毒素反应。例如，clearcoli细胞缺少用于htlr4/md-2激活的外膜激动剂；因此，与大肠埃希氏菌野生型细胞相比，对htlr4/md-2信号传导的激活作用要低几个数量级。由制备的异源蛋白质几乎没有内毒素活性。从clearcoli细胞中最小限度纯化后，蛋白质或质粒(可含有脂质iva)可以用于大多数应用，而不会在人细胞中引起内毒素反应。在clearcoli细胞中，正常六酰基化lps的两个二级酰基链已经缺失，从而消除了真核细胞中内毒性的关键决定因素。lps的六个酰基链是toll样受体4(tlr4)识别的与骨髓分化因子2(md-2)复合的触发剂，从而引起的激活和促炎细胞因子的产生。缺失两个二级酰基链会形成脂质iva，脂质iva不会诱导激活的异四聚体tlr4/md-2复合物形成，因此不会触发内毒素反应。在添加4ma145rev.31oct2016的bl21(de3)电感受态细胞中，缺失了寡糖链，使得更容易从任何下游产物中去除所得的脂质iva。在一些实施方案中，本文公开的蛋白酶缺乏的小细胞是由蛋白酶缺乏的亲代菌株(包括但不限于bl21(de3)、bl21-ai和lps修饰的bl21(de3))产生的。在其他实施方案中，通过缺失、突变、敲除或破坏minc、mind和/或minc和mind基因来对bl21(de3)、bl21-ai和lps修饰的bl21(de3)菌株进行遗传工程化，以诱导小细胞产生。在其他实施方案中，通过过表达ftsz和/或mine基因来对bl21(de3)、bl21-ai和lps修饰的bl21(de3)菌株进行遗传工程化，以诱导小细胞产生。在其他实施方案中，本公开提供了一种名为b8的产生小细胞的新型菌株。该菌株是没有t7rna聚合酶的产生蛋白酶缺乏的小细胞的菌株。该小细胞菌株是由bl21(de3)菌株产生的。当敲除minc/d/cd时，由于通过lambdared转化技术引入的敲除具有同源性，t7rna聚合酶被沉默。该菌株可以用于对蛋白酶缺乏的小细胞的需要，但不具有t7rna聚合酶。在一些实施方案中，需要对在表面上展示酶促活性多肽(诸如复杂或有毒蛋白质)的小细胞进行更多控制并且需要对所需的复杂或有毒蛋白质进行更慢表达。本公开教导了包含以下各项的新产生的蛋白酶缺乏的小细胞菌株的基因型：i)minc缺失的bl21(de3)；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δminc，ii)mind缺失的bl21(de3)；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δmind，iii)minc/d缺失的bl21(de3)；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δmincδmind；iv)minc缺失的bl21-ai；f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcmarab::t7rnap-tetaδminc，v)mind缺失的bl21-ai；f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcmarab::t7rnap-tetaδmind，vi)minc/d缺失的bl21-ai；f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcmarab::t7rnap-tetaδmincδmind；vii)minc缺失的lps修饰的bl21(de3)；msba148δgutqδkdsdδlpxlδlpxmδpagpδlpxpδeptaδminc，viii)mind缺失的lps修饰的bl21(de3)；msba148δgutqδkdsdδlpxlδlpxmδpagpδlpxpδeptaδmind，ix)minc/d缺失的lps修饰的bl21(de3)；msba148δgutqδkdsdδlpxlδlpxmδpagpδlpxpδeptaδminc,δmind，x)minc缺失的b8，其对t7rna聚合酶活性具有抑制性；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δminc；xi)mind缺失的b8，其对t7rna聚合酶活性具有抑制性；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δmind；以及xii)minc/d缺失的b8，其对t7rna聚合酶活性具有抑制性；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δmincδmind。与亲本细胞分离的小细胞缺少染色体和/或核组分，但保留了细胞质及其内容物，包括蛋白质表达所需的细胞机器。在一些实施方案中，小细胞是蛋白酶缺乏的，因为亲本细胞是蛋白酶缺乏菌株。尽管染色体不分离成小细胞，但是染色体外和/或游离遗传表达元件可分离，或者可在与亲本细胞分离后被引入小细胞。在一些实施方案中，本公开涉及包含表达元件的蛋白酶缺乏的小细胞，所述表达元件可以是诱导型表达元件。可以将诱导型表达元件(诸如诱导型启动子)引入以下各项中：用于同源重组以敲除和/或缺失与细胞分裂和/或染色体分配有关的基因(诸如minc、mind和minc/d)的重组质粒；用于过表达与细胞分裂和/或染色体分配有关的基因(诸如ftsz和mine)的重组表达载体；以及用于表达酶促活性多肽(包括本文公开的目标蛋白质)的重组表达载体。在其他实施方案中，诱导型表达元件包含可操作地连接到编码本文公开的目标蛋白质的开放阅读框(orf)的表达序列。任选地，在该方法的任何点处，提供诱导剂以诱导编码本文公开的目标蛋白质的orf的表达。在一些实施方案中，本公开教导了制备蛋白酶缺乏细菌小细胞的方法，所述细菌小细胞包含并非在亲代细胞中天然发现的重组融合蛋白。在一些实施方案中，本公开教导了由宿主细胞制备蛋白酶缺乏的小细胞的方法。在其他实施方案中，本公开教导了通过缺失、突变、敲除或破坏编码wpra蛋白酶的基因由枯草芽孢杆菌菌株(诸如cu403diviva、cu403,divivb,spo-、cu403,divivb和cu403,divivb1)产生蛋白酶缺乏的小细胞。图16示出了用于抑制和/或去除wpra蛋白酶活性以在枯草芽孢杆菌中产生蛋白酶缺乏条件的示例性重组载体。枯草芽孢杆菌中的遗传操作与大肠埃希氏菌中的遗传操作略有不同。如果插入与现有基因组同源的dna，则已知枯草芽孢杆菌很容易进行同源重组。这与大肠埃希氏菌不同；大肠埃希氏菌具有降解存在的任何非天然线性dna的机制。可以利用这种差异通过设计两侧为同源臂的抗生素抗性盒来敲除基因，所述同源臂与希望被敲除的基因的开始和末端相对应。本公开提供了使用遗传工程化技术由枯草芽孢杆菌产生小细胞。在一些实施方案中，枯草芽孢杆菌菌株(包括但不限于cu403diviva(bgsc号1a196)、cu403,divivb,spo-(bgsc号1a197)、cu403,divivb(bgsc号1a292)、cu403,divivb1(bgsc号1a513)、ko7)可以用作亲代细菌细胞来产生小细胞。枯草芽孢杆菌菌株可商购获得，并且可以从芽孢杆菌遗传保藏中心(bgsc)获得。菌株目录可在可公开访问的bgsc网页(www.bgsc.org/_catalogs/catpart1.pdf)提供的文档中找到。在一些实施方案中，可以通过敲除枯草芽孢杆菌菌株(包括但不限于cu403diviva、cu403,divivb,spo-、cu403,divivb和cu403,divivb1)中编码wpra蛋白酶的基因来对这些菌株进行遗传修饰。wpra蛋白酶被称为最苛刻的蛋白酶之一。为了从枯草芽孢杆菌菌株中敲除、缺失和/或去除编码wpra的基因，如图16所示使用puc18wpra-camr载体。该载体具有与天然存在于枯草芽孢杆菌中的编码wpra细胞壁蛋白酶的基因相对应的同源臂，该基因对于蛋白质表面表达是不希望的。这些同源臂位于氯霉素抗性盒的两侧，以进行选择。通过宿主细胞内的同源臂进行同源重组后，除同源臂以外的编码wpra的核苷酸被氯霉素选择标记基因替换。该质粒在大肠埃希氏菌内由于具有其复制起点而可以复制，因此当转化到枯草芽孢杆菌中时不能复制。转化后，选择菌落以使用氯霉素来分离成功发生wpra敲除的菌落。因为质粒不能在枯草芽孢杆菌中复制，所以如果通过同源重组将具有氯霉素抗性标记基因的重组盒整合到枯草芽孢杆菌细胞的基因组中，则只有细胞可以抵抗氯霉素的存在而存活。枯草芽孢杆菌在营养生长期和稳定期分泌不少于七种蛋白酶。已经证明其中多种蛋白酶基因已被灭活的菌株在产生外源蛋白质方面优于野生型菌株。ko7是原养的，不含分泌的蛋白酶，并且在py79遗传背景中具有无标记的缺失。该ko7可从bgsc获得，登录号为1a1133。ko7基因型：δnpreδapreδeprδmprδnprbδvprδbpr。在一些实施方案中，七种蛋白酶缺失菌株即枯草芽孢杆菌ko7可以用于通过使用本公开中描述的遗传工程化技术敲除div-iva和div-ivb来产生枯草芽孢杆菌小细胞。在一些实施方案中，无核细胞是从p678-54大肠埃希氏菌野生菌株产生的。在其他实施方案中，无核细胞是从蛋白酶缺乏大肠埃希氏菌菌株(包括bl21、bl21(de3)、bl21-ai、lps修饰的bl21(de3)和b8)产生的。在一些实施方案中，无核细胞是从缺乏wpra蛋白酶的亲代细菌细胞产生的。在一些实施方案中，无核细胞是从蛋白酶缺乏枯草芽孢杆菌亲代细菌细胞产生的。在一些实施方案中，无核细胞是从蛋白酶缺乏ko7枯草芽孢杆菌亲代细菌细胞产生的。在其他实施方案中，无核细胞是从选自由以下各项组成的组的蛋白酶缺乏枯草芽孢杆菌亲代细菌细胞产生的：(1)cu403,diviva；(2)cu403,divivb,spo-；(3)cu403,divivb；以及(4)cu403,divivb1，其中至少一个蛋白酶编码基因已被阻遏、缺失或沉默。在其他实施方案中，无核细胞是从真核细胞产生的。在其他实施方案中，如上所述产生的无核细胞被用作用于包封和递送生物活性化合物的基于无核细胞的平台和/或工业制剂。在一些实施方案中，本公开教导的小细胞是蛋白酶缺乏的或是核糖核酸酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是蛋白酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是核糖核酸酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是蛋白酶缺乏的和是核糖核酸酶缺乏的。核糖核酸酶缺乏的细菌菌株本公开提供了使用遗传工程化技术由ht115(de3)产生小细胞。ht115(de3)是一种rnai饲养菌株，是具有iptg诱导型t7聚合酶活性的rna酶iii缺陷大肠埃希氏菌菌株。为了诱导从这些质粒产生dsrna，使ht115细菌在含有iptg和氨苄青霉素类似物羧苄青霉素的特殊rnaingm饲养板上生长。羧苄青霉素优于氨苄青霉素，因为它往往更稳定。因此，可以利用作为核糖核酸酶缺乏的菌株的ht115菌株来产生核糖核酸酶缺乏的小细胞和/或不含无核糖核酸酶的小细胞。de3名称表示相应的菌株包含λde3溶菌原，该溶菌原在lacuv5启动子的控制下携带t7rna聚合酶的基因。需要iptg最大限度地诱导t7rna聚合酶的表达，以表达克隆到t7启动子下游的重组基因。ht115(de3)适合从t7或t7-lac启动子或者被大肠埃希氏菌rna聚合酶识别的启动子(例如lac、tac、trc、parabad、prhabad和t5启动子)表达。ht115(de3)的基因型为：f-,mcra,mcrb,in(rrnd-rrne)1,rnc14::tn10(de3溶源菌:lavuv5启动子-t7聚合酶)(iptg-诱导型t7聚合酶)(rna酶iii-)。该菌株在lb或2xyt板上生长。该菌株具有四环素抗性。使用该菌株的研究人员可以通过使用标准cacl2转化技术转化firevectorkit(1999)中的一种质粒(例如plt76)来测试表达。该菌株对四环素具有抗性，可以在37℃、lb和有氧条件下培养。研究人员还使用该菌株来测试线虫的干扰实验。在一些实施方案中，本文公开的核糖核酸酶缺乏的小细胞是由核糖核酸酶缺乏的亲代菌株(包括但不限于ht115(de3))产生的。在其他实施方案中，通过缺失、突变、敲除或破坏minc、mind和/或minc和mind基因来对ht115(de3)菌株进行遗传工程化，以诱导小细胞产生。在其他实施方案中，通过过表达ftsz和/或mine基因来对ht115(de3)菌株进行遗传工程化，以诱导小细胞产生。在一些实施方案中，本文公开的核糖核酸酶缺乏的小细胞可以由蛋白酶缺乏亲代菌株(包括但不限于通过缺失、突变、敲除或破坏编码核糖核酸酶iii的基因进行遗传修饰的bl21(de3)、bl21-ai和lps修饰的bl21(de3))产生。在其他实施方案中，通过缺失、突变、敲除或破坏minc、mind和/或minc和mind基因来对bl21(de3)、bl21-ai和lps修饰的bl21(de3)菌株(其中核糖核酸酶iii表达被抑制、破坏和/或无效)进一步进行遗传工程化，以诱导小细胞产生。在其他实施方案中，还通过过表达ftsz和/或mine基因来对bl21(de3)、bl21-ai和lps修饰的bl21(de3)菌株(其中核糖核酸酶iii表达被抑制、破坏和/或无效)进行遗传工程化，以诱导小细胞产生。本公开教导了包含以下各项的新产生的核糖核酸酶缺乏的小细胞菌株的基因型：i)minc缺失和核糖核酸酶iii缺失的bl21(de3)；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δmincrnc14::tn10，ii)mind缺失和核糖核酸酶iii缺失的bl21(de3)；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δmindrnc14::tn10，iii)minc/d缺失和核糖核酸酶iii缺失的bl21(de3)；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δmincδmindrnc14::tn10，iv)minc缺失和核糖核酸酶iii缺失的bl21-ai；f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcmarab::t7rnap-tetaδmincrnc14::tn10，v)mind缺失和核糖核酸酶iii缺失的bl21-ai；f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcmarab::t7rnap-tetaδmindrnc14::tn10，vi)minc/d缺失和核糖核酸酶iii缺失的bl21-ai；f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcmarab::t7rnap-tetaδmincδmindrnc14::tn10；vii)minc缺失的lps修饰和核糖核酸酶iii缺失的bl21(de3)；msba148δgutqδkdsdδlpxlδlpxmδpagpδlpxpδeptaδmincrnc14::tn10，viii)mind缺失的lps修饰和核糖核酸酶iii缺失的bl21(de3)；msba148δgutqδkdsdδlpxlδlpxmδpagpδlpxpδeptaδmindrnc14::tn10，ix)minc/d缺失的lps修饰和核糖核酸酶iii缺失的bl21(de3)；msba148δgutqδkdsdδlpxlδlpxmδpagpδlpxpδeptaδminc,δmindrnc14::tn10，x)minc缺失和核糖核酸酶iii缺失的b8，其对t7rna聚合酶活性具有抑制性；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δmincrnc14::tn10；xi)mind缺失和核糖核酸酶iii缺失的b8，其对t7rna聚合酶活性具有抑制性；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δmindrnc14::tn10；xii)minc/d缺失和核糖核酸酶iii缺失的b8，其对t7rna聚合酶活性具有抑制性；fhua2[lon]omptgal(λde3)[dcm]δhsdsλde3＝λsbamhioδecori-bint::(laci::placuv5::t7gene1)i21δnin5δmincδmindrnc14::tn10；xiii)minc缺失的ht115(de3)；f-,mcra,mcrb,in(rrnd-rrne)1,rnc14::tn10(de3lysogen:lavuv5promoter-t7polymerase)δminc，xiv)mind缺失的ht115(de3)；f-,mcra,mcrb,in(rrnd-rrne)1,rnc14::tn10(de3lysogen:lavuv5promoter-t7polymerase)δmind，以及xv)minc/d缺失的ht115(de3)；f-,mcra,mcrb,in(rrnd-rrne)1,rnc14::tn10(de3lysogen:lavuv5promoter-t7polymerase)δmincδmind。与亲本细胞分离的小细胞缺少染色体和/或核组分，但保留了细胞质及其内容物，包括蛋白质表达所需的细胞机器。在一些实施方案中，小细胞是核糖核酸酶缺乏的，因为亲本细胞是是核糖核酸酶缺乏的菌株。尽管染色体不分离成小细胞，但是染色体外和/或游离遗传表达元件可分离，或者可在与亲本细胞分离后被引入小细胞。在一些实施方案中，本公开涉及包含表达元件的是核糖核酸酶缺乏的小细胞，所述表达元件可以是诱导型表达元件。可以将诱导型表达元件(诸如诱导型启动子)引入以下各项中：用于同源重组以敲除和/或缺失与细胞分裂和/或染色体分配有关的基因(诸如minc、mind和minc/d)的重组质粒；用于过表达与细胞分裂和/或染色体分配有关的基因(诸如ftsz和mine)的重组表达载体；以及用于表达酶促活性多肽(包括本文公开的目标蛋白质)的重组表达载体。在其他实施方案中，诱导型表达元件包含可操作地连接到编码本文公开的目标蛋白质的开放阅读框(orf)的表达序列。任选地，在该方法的任何点处，提供诱导剂以诱导编码本文公开的目标蛋白质的orf的表达。在一些实施方案中，本公开教导了制备是核糖核酸酶缺乏的细菌小细胞的方法，所述细菌小细胞包含并非在亲代细胞中天然发现的重组融合蛋白。在一些实施方案中，本公开教导了由宿主细胞制备是核糖核酸酶缺乏的小细胞的方法。在其他实施方案中，无核细胞是从真核细胞产生的。在其他实施方案中，如上所述产生的无核细胞被用作用于包封和递送生物活性化合物的基于无核细胞的平台和/或工业制剂。在一些实施方案中，本公开教导的小细胞是蛋白酶缺乏的或是核糖核酸酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是蛋白酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是核糖核酸酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是蛋白酶缺乏的和是核糖核酸酶缺乏的。在一些实施方案中，所述小细胞是核糖核酸酶缺乏的，并且其中所述生物活性化合物是核酸。在一些实施方案中，所述生物活性化合物是所述核酸，所述核酸选自由以下各项组成的组：反义核酸、双链rna(dsrna)、短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、核酶、适体及其组合。小细胞分离和纯化使用多种方法在亲本细胞和小细胞的混合物中将小细胞与亲本细胞(即，产生小细胞的细胞)分离。一般来讲，这些方法是物理方法、生化方法和遗传方法，并且可以组合使用。小细胞与亲本细胞的物理分离作为非限制性实例，通过以下方法将小细胞与亲本细胞分离：玻璃纤维过滤(christen等人,gene23:195-198,1983)和差速区带离心(barker等人,j.gen.microbiol.111:387-396,1979)、尺寸排阻色谱(例如凝胶过滤)、差分超声(reeve,j.n.和n.h.mendelson.1973.biochem.biophys.res.commun.53:1325-1330)和紫外线照射(tankersley,w.g.和j.m.woodward.1973.procsocexpbiolmed.1974年3月；145(3):802–805)。某些技术涉及不同的离心技术，例如差速区带离心。作为非限制性实例，小细胞可通过以下文献中描述的双蔗糖梯度纯化技术来纯化：frazer和curtiss,curr.topicsmicrobiol.immunol.69:1-84,1975。也可使用其他物理方法从小细胞制备物中去除亲本细胞。作为非限制性实例，将亲本细胞和小细胞的混合物冷冻至-20℃，然后缓慢解冻(frazer和curtiss,curr.topicsmicrobiol.immunol.69:1-84,1975)。小细胞与亲本细胞的生化分离可以通过在存在试剂的情况下或在一组条件下进行孵育来选择性地杀死分裂的细胞，从而从小细胞制备物中消除污染的亲代细胞。由于小细胞既不能生长也不能分裂，因此它们对这种处理具有抗性。阻止或杀死分裂的亲代细胞的生化条件的实例是用抗菌剂诸如青霉素或青霉素的衍生物进行处理。青霉素有两个潜在的影响。首先，青霉素阻止细胞壁形成并导致分裂的细胞裂解。其次，在裂解之前，分裂的细胞形成可有助于上述物理分离步骤的细丝。除青霉素及其衍生物外，其他试剂也可用于防止亲代细胞分裂。这类试剂可包括叠氮化物。叠氮化物是电子传递的可逆抑制剂，因此可以防止细胞分裂。作为另一个实例，d-环丝氨酸或噬菌体ms2裂解蛋白也可用作消除或抑制分裂的亲代细胞的生化方法。(markiewicz等人,femsmicrobiol.lett.70:119-123,1992)。khachatourians(美国专利号4,311,797)表明，可能需要在添加青霉素g并进一步孵育之前，在36℃至38℃下在脑心浸液肉汤中孵育小细胞/亲代细胞混合物。小细胞与亲本细胞的遗传分离替代地或另外，可使用各种技术来选择性地杀死、优选裂解亲本细胞。例如，尽管小细胞可以在m13生命周期的质粒阶段内部保留m13噬菌体，但它们对m13噬菌体造成的感染和裂解具有抵抗力(staudenbauer等人,mol.gen.genet.138:203-212,1975)。相反，亲本细胞被m13感染并裂解，因此从包含亲本细胞和小细胞的混合物中选择性地被去除。以m.o.i.＝5(噬菌体细胞)用m13噬菌体处理包含亲本细胞和小细胞的混合物。允许感染持续到如下程度：裂解≥50％、优选≥75％、更优选≥95％、最优选≥99％的亲本细胞；并且裂解或杀死≤25％、优选≤15％、最优选≤1％的小细胞。作为可以选择性杀死并优选裂解亲本细胞的方法的另一个非限制性实例，亲本细胞的染色体可包括条件致死基因。诱导染色体致死基因将导致亲本细胞破坏，但不会影响小细胞，因为它们缺少带有条件致死基因的染色体。作为一个实例，亲本细胞可含有包含条件致死基因的染色体整合的噬菌体。这种噬菌体的一个实例是具有温度敏感阻遏基因(例如λci857)的整合λ噬菌体。该噬菌体的诱导通过简单地升高生长培养基的温度就可以实现，从而导致亲本细胞破坏而不会导致染色体小细胞破坏。用于该方法的优选噬菌体是杀死和/或裂解亲本细胞但不产生感染性颗粒的噬菌体。这种类型的噬菌体的一个非限制性实例是裂解细胞但已被工程化为不产生在感染性颗粒中包围并保护噬菌体dna的衣壳蛋白的噬菌体。也就是说，衣壳蛋白对于产生感染性颗粒是必需的。作为可以选择性杀死或裂解亲本细胞的方法的另一个非限制性实例，可表达导致亲本细胞裂解的毒性蛋白。作为非限制性实例，这些诱导型构建体可采用控制噬菌体穿孔素(holing)基因表达的系统。穿孔素基因属于至少35个不同家族，没有可检测的直系同源关系(grundling,a.等人2001.proc.natl.acad.sci.98:9348-9352)，其中每个家族且任何家族都可用于裂解亲代细胞，以提高小细胞制备物的纯度。在一些实施方案中，在包含小细胞的组合物中，小细胞与产生小细胞的亲本细胞基本上分离。分离后，包含小细胞的组合物至少约99.9％、约99.8％、约99.7％、约99.6％、约99.5％、约99.4％、约99.3％、约99.2％、约99.1％、约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、约89％、约88％、约87％、约86％、约85％、约84％、约83％、约82％、约81％、约80％、约79％、约78％、约77％、约76％、约75％、约74％、约73％、约72％、约71％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％或约20％不含产生小细胞的亲本细胞。因此，本发明的组合物可以包含基本上不含亲本细胞的小细胞。在一些方面，本发明提供了一种制备小细胞的方法，所述方法包括(a)培养产生小细胞的亲本细胞，其中所述亲本细胞包含重组构建体，其中所述重组构建体包含与靶基因(与调节细胞分裂有关)同源的核苷酸序列，并且(b)将小细胞与亲本细胞分离，从而产生包含小细胞的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括(c)通过离心和/或过滤从组合物中纯化小细胞。在一些实施方案中，可以将包含与细胞分裂有关的基因的一种或多种另外的表达构建体引入产生小细胞的亲本细胞。在这种情况下，可在诱导小细胞形成之前将表达构建体同时或顺序地引入亲本细胞，并且这些表达构建体可以包含一种或多种选择标记(例如抗生素抗性基因)和/或报告基因以允许选择和/或可视化表达目标蛋白质的小细胞。在其他实施方案中，表达构建体可以表达一种或多种另外的蛋白质，这些蛋白质由相同或不同的启动子(包括诱导型启动子)驱动。在其他实施方案中，与细胞分裂有关的基因是minc、mind和/或minc和mind。包封包封是将物质封闭在惰性材料内的过程，这可以保护免受环境的影响并控制活性化合物的释放。已经对两种类型的包封进行了充分研究：1)纳米包封，即以纳米级尺寸将各种物质包覆在另一种材料内，以及2)微囊包封，与纳米包封类似，除了涉及更大的颗粒并且比纳米包封花费更长的时间。包封是一种新技术，已广泛应用于制药、农用化学物质、食品和化妆品行业。在一些实施方案中，本文所述的至少一种生物活性化合物对除靶标的细胞以外的细胞是惰性的。在一些实施方案中，利用包含真细菌、古细菌和真核细胞的基于无核细胞的平台和/或工业制剂来包封生物活性化合物。包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和嗜极细菌在内的细菌细胞可以产生可以包封所需生物活性化合物的平台。无核细胞包括天然和/或通过本文教导的遗传工程化技术由本文公开的亲代细菌细胞产生的小细胞。本公开教导了使用细菌小细胞的益处，所述细菌小细胞简化了基于无核细胞的平台的纯化并降低了其包封成本。通过对生物活性化合物进行包封，可以保护化合物免受导致化合物降解并缩短化合物生命周期的外部因素的影响。当前的包封技术包括油、反相悬浮液、基于聚合物的纳米材料、基于脂质的纳米材料、多孔无机纳米材料和基于粘土的纳米材料。将coc(作物油浓缩液)和mso(甲基化种子油)技术用于油包封。它们作为湿润剂使活性成分小滴移动通过喷嘴，并在外部重新配置小滴，以防止活性成分蒸发。反向悬浮液是一种油子类，其提供包封在油壳内的水的悬浮液或被油包衣包围的水的悬浮液，所述油涂层用于在通过喷嘴尖端喷射之后最小化可漂移细粒(105微米以下)的产生。该技术可降低活性成分的可漂移细粒。基于聚合物的纳米材料由具有分散在聚合物基质内的纳米颗粒或纳米填料的聚合物组成。通常，聚合物具有对比性(一种疏水性，一种亲水性)以维持两亲性质。合成或天然聚合物(瓜尔胶)都可通过产生较大的喷雾颗粒来增加喷雾溶液的粘度并影响流变特性。基于聚合物的佐剂增加了喷雾颗粒破碎的可能性，从而增加了漂移。然而，不建议将基于聚合物的漂移减少技术佐剂用于空中施加活性成分。尽管它们具有有效的负载能力，但所需的聚合物价格昂贵，从而限制了规模性。基于脂质的纳米材料具有包封亲水性、疏水性和亲脂性活性成分的巨大潜力，并且通常用于制药领域。然而，可规模化生产受到成本的极大限制。多孔无机纳米材料(诸如二氧化硅纳米颗粒)可以有效地包封生物活性分子，但是在生物降解性和规模性方面受到限制。这些聚合物包覆的纳米颗粒具有各种限制性，诸如热稳定性和化学稳定性差、会被植物酶系统快速消除以及某些聚合物会降解，从而导致酸性单体形成并且聚合物基质内的ph值降低。粘土纳米颗粒在经济上可行，并为开发多功能纳米载剂材料提供了极大的机会，但是能量密集型的，需要高热用于生产。不能轻易对这些替代方案进行修改以提供到植物的靶向递送。在一些实施方案中，基于无核细胞的小细胞平台和/或工业制剂在成本和生物降解性方面具有优势。通过常规的工业发酵实践可以轻松规模化小细胞平台。一旦规模化，就可以通过一系列离心和/或过滤步骤进行纯化。碳水化合物结合模块与小细胞表面的自组装显著降低了制备靶向生物颗粒的成本。另外，就植物和环境用途的生物相容性而言，基于无核细胞的小细胞平台与其他包封技术相比更具优势；这是因为基于无核细胞的小细胞平台是由安全常见的微生物得到的，这些微生物是应用区域所固有的，并且可以安全地生物降解以供生态系统再利用。这种适合于可规模化无毒递送的平台可以在农业领域中发挥重要作用。为了解决常规农用化学物质在到达其预期靶标之前容易降解或蒸发的问题，本公开提供了一种用于包封和递送生物活性化合物的基于无核细胞的细胞平台和/或工业制剂，旨在保护生物活性免受外部因素的影响，直到化合物被施加于靶标并缓慢释放到预期靶标为止。使用所公开的基于小细胞的包封和递送平台避免了通常将生物活性化合物损失到环境中的各种机制。这是因为小细胞的脂质双层作为抵抗严苛环境条件的有效保护层。具体而言，将活性物质在小细胞内部内在化可保护化合物免受温度、ph的急剧变化或强光暴露的影响。换句话说，小细胞可保护化合物免受挥发、光解降解和水解的影响。因此，可以保护生物活性化合物免受不利外部因素的影响，并允许其通过包封目标生物活性化合物的基于小细胞的平台逐渐和/或控制释放到预期靶标。此外，本公开的另一个益处提供了一种用于包封和递送生物活性化合物的基于无核细胞的平台和/或工业制剂，所述平台提供了改善和增强的到植物及其微环境的靶向能力。基于小细胞的生物颗粒的外膜的固有表面化学性质天然地模拟细菌的固有表面化学性质。这很重要，因为在植物的叶、茎及其根系表面上的微生物组中有许多类型的共生细菌。通过使用基于小细胞的平台，小细胞的生物膜对植物的各个表面具有天然粘附。这一特征允许在小细胞底盘中递送包封的生物活性化合物(包括生物防治剂和生物刺激剂)，目标是粘附到植物表面和植物根系周围的土壤微环境以及其他靶标(诸如害虫、昆虫、臭虫、杂草、蠕虫、细菌、病毒、病原体和寄生虫)。除了依赖基于小细胞的生物颗粒对植物的天然粘附外，本公开还教导了使用遗传工程化来产生与小细胞的膜上的特异性结合结构域融合的表面表达部分。这样，显著增强了其靶向植物或害虫的能力。在一些实施方案中，本公开提供了遗传工程化技术来制备具有使小细胞表面功能化的结合结构域/基序的基于小细胞的平台。包含特异性结合结构域和/或基序的蛋白质在小细胞表面上表达，并特异性靶向存在于植物或害虫表面上的结合位点。在一些实施方案中，基于小细胞的平台可以通过具有碳水化合物结合模块(cbm)的蛋白质来功能化，所述碳水化合物结合模块可以靶向并结合碳水化合物，诸如纤维素、木聚糖、几丁质和木质素，这些碳水化合物是植物细胞壁的重要且普遍存在的结构组分。因为cbm可以识别其存在于受试对象诸如植物或害虫上的结合位点，所以包含功能化结合结构域的基于小细胞的平台可实现高特异性靶向。在一些实施方案中，cbm的使用不限于农业用途。cbm可以用于通过纤维素柱方法纯化活性成分或生物分子。作为对基于小细胞的平台的表面化学性质的补充，生物颗粒的相对质量还可以显著减轻由于雾化和浸出而导致的活性化合物的脱靶暴露。与喷雾自由漂浮的化合物相比，通过在喷雾前将活性物质浓缩并包封在相对大的小细胞底盘中，化合物不易受到风造成的雾化或漂移的影响。此外，较大尺寸的小细胞包封和递送平台可以减轻活性物质通过土壤浸出到地下水供给中。农业上可接受的载剂本文所述的组合物可以包含农业上可接受的载剂。可用于这些实施方案的组合物可包括选自由以下各项组成的组的至少一个成员：增粘剂、微生物稳定剂、杀真菌剂、抗菌剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、抗复合剂、除草剂、杀线虫剂、杀虫剂、植物生长调节剂、肥料、灭鼠剂、除湿剂、杀菌剂、养分或其任何组合。在一些实例中，组合物可以是贮存稳定的。例如，本文所述的任何组合物可以包括农业上可接受的载剂(例如一种或多种肥料(诸如非天然存在的肥料)、粘附剂(诸如非天然存在的粘合剂)和农药(诸如非天然存在的农药))。非天然存在的粘附剂可以是例如聚合物、共聚物或合成蜡。例如，本文所述的任何包覆的种子、幼苗或植物可以在种子包衣中包含这种农业上可接受的载剂。在本文所述的任何组合物或方法中，农业上可接受的载剂可以是或可以包括非天然存在的化合物(例如非天然存在的肥料、非天然存在的粘附剂(诸如聚合物、共聚物或合成蜡)或非天然存在的农药)。在一些实施方案中，本文所述的基于无核细胞的平台可以与农业上可接受的载剂混合。载剂可以是固体载剂或液体载剂，并且可以是各种形式，包括微球、粉末、乳液等。载剂可以是赋予多种性质(诸如增加的稳定性、润湿性或分散性)的多种载剂中的任何一种或多种。组合物中可以包括润湿剂，诸如天然或合成表面活性剂，其可以是非离子或离子表面活性剂或者其组合。油包水乳液也可以用于配制包括分离的细菌的组合物(参见例如美国专利号7,485,451)。可制备的合适制剂包括可湿性粉剂、颗粒剂、凝胶剂、琼脂条或丸剂、增稠剂、液体(诸如水性流动剂、水性悬浮液、油包水乳液等)。制剂可包括谷物或豆科植物产品，例如磨碎的谷物或豆子、来源于谷物或豆子的肉汤或面粉、淀粉、糖或油。在一些实施方案中，农业载剂可以是土壤或植物生长培养基。可使用的其他农业载剂包括水、肥料、植物性油、湿润剂或其组合。替代地，农业载剂可以是固体，诸如硅藻土、壤土、二氧化硅、藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、种壳、其他动物和植物产品或者组合，包括颗粒剂、丸剂或悬浮液。也将任何上述成分的混合物考虑作为载剂，诸如但不限于面团(面粉和高岭土)、琼脂或者壤土、沙土或粘土中基于面粉的丸剂等。制剂可包括细菌的食物来源，诸如大麦、水稻或其他生物材料，诸如种子、植物部分、甘蔗渣、来自谷物加工的外壳或枝茎、来自建筑工地垃圾的磨碎的植物材料或木材、来自纸、织物或木材的回收的锯屑或小纤维。农业上可接受的载剂的其他实例包括分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯pvpivas-630)、表面活性剂、粘结剂和填充剂。本领域技术人员将理解，除非另有说明，否则本公开中对基于无核细胞的平台的所有引用都可以被理解为是指农业制剂。因此，本公开所述的是指基于无核细胞的平台的实施方案也将被理解为是指农业制剂。细胞粘附的结合结构域在一些实施方案中，本文所述的基于无核细胞的平台表达结合结构域。这些结构域允许小细胞更好地保留在植物表面上，这防止了包封在小细胞内的生物活性化合物径流或漂移。它们还可以改善对靶向害虫的粘附，以确保施用有效剂量的生物活性化合物。一旦小细胞在植物上，化学物质就将缓慢释放到环境中。在一些实施方案中，本文所述的无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个植物细胞粘附部分。植物细胞粘附部分包含选自由以下各项组成的组的碳水化合物结合模块：纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域。在一些实施方案中，无核细胞在其表面上表达增加与植物表面的粘附的多肽。多肽是其表面上的植物粘附多肽。在一些实施方案中，多肽是在其表面上展示的碳水化合物结合模块。在其他实施方案中，多肽是在其表面上展示的纤维素结合结构域。在其他实施方案中，多肽是在其表面上展示的几丁质结合结构域。碳水化合物结合模块(cbm)是在碳水化合物活性酶(例如糖苷水解酶)中发现的蛋白质结构域。这些结构域中的大多数具有碳水化合物结合活性。这些结构域中的一些在纤维素支架蛋白上发现。cbm也被称为纤维素结合结构域。基于氨基酸序列相似性，cbm被分为多个家族。微生物糖苷水解酶的cbm通过与特定植物结构多糖结合而在光合固定碳的再循环中起重要作用。cbm可以识别结晶和无定形纤维素形式。cbm是与在植物细胞壁水解中有活性的酶相关的最常见非催化模块。通过氨基酸序列比对已鉴定出许多推定的cbm，但仅有少数代表性cbm已经通过实验证明具有碳水化合物结合功能。通过与多糖结合，cbm使附带的催化结构域与靶底物紧密接触，从而增强催化作用。具有结合纤维素能力的cbm与水解纤维素和其他细胞壁聚合物(诸如木聚糖、甘露聚糖、果胶和非纤维素β-葡聚糖)的酶有关。已经将纤维素结合结构域(cbd)描述为用于将分子种类附接到纤维素的有用试剂(美国专利号5,738,984和6,124,117)。实际上，由于棉由90％的纤维素构成，因此已证明cbd可用于将所谓的“有益剂”递送到棉织物上，如wo9800500中所公开，其中利用cbd与棉织物的结合亲和力，使用cbd与酶之间的直接融合。wo03031477中要求保护类似的多功能融合蛋白用于递送包封的有益剂的用途，其中所述多功能融合蛋白由第一结合结构域和第二结合结构域组成，所述第一结合结构域是纤维素结合结构域，其中所述第一结合结构域或所述第二结合结构域可以与微粒结合。wo03031477使用双功能融合蛋白进行举例说明，所述双功能融合蛋白由cbd和与微粒结合的抗rr6抗体片段组成，该复合物沉积在棉线或割草上。在一些实施方案中，由本发明的小细胞展示的酶促活性多肽包含cbm。使用了在本公开范围内的来自粪碱纤维单胞菌(cellulomonasfimi)的示例性cbm。在一些实施方案中，细胞粘附部分与表面表达部分融合。在其他实施方案中，cbm与表面表达部分融合并展示在小细胞的表面上。表面表达系统在一些实施方案中，本公开教导了与细胞粘附部分融合的表面表达部分。表面表达部分可以是跨膜蛋白和/或跨膜结构域，其用作接头蛋白以在细胞的表面上展示具有细胞粘附部分的酶促活性多肽。在一些实施方案中，表面表达部分可以是膜相关蛋白，包括但不限于跨膜蛋白、膜锚蛋白、接头蛋白和/或其结构域。在一些实施方案中，本发明涉及在小细胞的表面上展示产生的与本文公开的目标蛋白质融合的膜相关蛋白。作为非限制性实例，该结构可以是将插入小细胞膜中或与小细胞膜相关联的内部表达的膜蛋白或嵌合构建体，使得细胞外结构域或目标结构域暴露在小细胞的外表面上(在小细胞的表面上表达和展示，或在亲代细胞中表达以在分体小细胞的表面上展示)。与膜相关接头蛋白融合的展示结构域可以是包括碳水化合物结合模块的细胞粘附结构域。在其他实施方案中，使此类小细胞与酶的合适底物接触可使底物转化为反应物。当底物或反应物可检测时，可量化由膜结合酶催化的反应。在后一种情况下，小细胞可用于鉴定抑制或刺激展示的酶部分代表的酶的活性的一种或多种化合物并从一系列化合物中分离所述一种或多种化合物。在一些实施方案中，膜相关蛋白可以是融合蛋白，即包含具有第一氨基酸序列的第一多肽和具有第二氨基酸序列的第二多肽的蛋白，其中第一氨基酸序列和第二氨基酸序列并非天然存在于同一多肽中。膜融合蛋白中的至少一种多肽是“跨膜蛋白/结构域”、“膜锚蛋白/结构域”或“接头蛋白/结构域”。融合蛋白的跨膜结构域和膜锚结构域可选自天然存在于原核生物(诸如细菌)、真核生物(诸如真菌)、单细胞真核生物、植物和动物(诸如哺乳动物，包括人类)中的膜蛋白。此类结构域可来自在病毒(诸如噬菌体或真核病毒，例如腺病毒或逆转录病毒)中天然发现的病毒膜蛋白。此类结构域可来自在古细菌(诸如嗜热菌)中天然发现的膜蛋白。示例性表面表达部分包括但不限于冰核蛋白(inp)、博德特菌属(bordetella)血清抗性杀伤蛋白(brk)和涉及扩散粘附的粘附素蛋白(aida)和/或输出细菌蛋白。“输出细菌蛋白”通常是指穿过质膜转运并用作膜蛋白锚点的细菌蛋白。本发明涵盖的示例性输出细菌蛋白包括但不限于lamb(genbank登录号amc96895)、oprf(genbank登录号np_792118)、ompa(genbank登录号aiz93785)、lpp(genbank登录号p69776)、male(genbank登录号p0aex9)、phoa(genbank登录号aiz92470.1)、bla(genbank登录号p62593)、fl或m13主要衣壳(j7i0p6–uniprot号)和fl或m13次要衣壳(p69168–uniprot号)。在一些实施方案中，对于革兰氏阴性细菌表达系统，本文公开的目标酶通过输出细菌蛋白的野生型或突变形式(诸如lamb(λ受体)、oprf(铜绿假单胞菌外膜蛋白f)、ompa(外膜蛋白a)、lpp(脂蛋白)、male(麦芽糖结合蛋白)、phoa(碱性磷酸酶)、bla(tem-1b-内酰胺酶)、f1或m13主要衣壳(来源于基因viii)和f1或m13次要衣壳(基因iii))固定到小细胞的表面。在其他实施方案中，冰核蛋白(inp)的野生型和/或截短形式可以用于将酶固定在细菌表面上。表面展示系统细菌表面展示技术使得外源蛋白质或多肽能够在细菌表面上展示，同时保持其相对独立的空间结构和生物活性。该技术使重组细菌具有预期的功能，随后直接用于许多应用。许多蛋白质可以用于实现细菌表面展示，其中自转运蛋白(革兰氏阴性细菌的v型分泌系统的成员)由于其具有模块化结构和明显的简单性而被广泛研究。然而，自转运蛋白由于缺乏便利的遗传载体系统目前尚未被广泛使用。本公开教导了目标蛋白质/多肽的自展示需要自转运蛋白才能表面展示革兰氏阴性细菌中的蛋白质或肽。自转运蛋白分为三个不同的亚组：经典自转运蛋白(va型)、三聚体自转运蛋白粘附素(vb型)和双伴侣分泌系统(vc型)。经典自转运蛋白(va型)被认为都具有共同的通用结构，所述结构由与信使蛋白融合的n末端信号肽组成，所述信使蛋白取代了自转运前体蛋白，后者提供了跨细胞质膜的转运。n末端信号肽通常利用分泌机器来提供转运。一旦蛋白质穿过内膜，该信号肽就会被切割。自转运蛋白的c末端结构域促进了外膜易位。该结构域称为易位蛋白结构域，在外膜内形成β桶。由于封闭桶的β链被朝向周质引导，因此该自转运蛋白需要另外的接头结构域。利用这种机制，已经表达了超过30种不同的蛋白质作为信使蛋白。三聚体自转运蛋白(vb型)与经典自转运蛋白相似，不同之处在于它们不能仅将一种蛋白质转运到表面，而是将3种(三聚体)蛋白质转运到表面。vc型自转运蛋白由信使和易位结构域组成，但是这两个结构域都在单独的基因中表达。这两个结构域都通过分泌机器穿过内膜转运，但通过多肽转运相关结构域(potra)与周质相互作用。由于这种转运机制与叶绿体和线粒体中存在的转运系统之间具有相似性，因此这种系统有望能够运输极其复杂的蛋白质结构，但是很少使用自转运的vb或vc系统。酶通过蛋白质介导的膜定位机制(包括但不限于以下连接蛋白质和机制)固定到小细胞表面。在一些实施方案中，这些系统包括brka蛋白和aida-1蛋白。自转运蛋白和冰核蛋白作为载剂蛋白用于在大肠埃希氏菌的细胞表面上进行蛋白展示的比较在以下文献中报道：yang等人，2013,progressinbiochemistryandbiophysics40(12):1209-1219，该文献通过引用全文并入本文。aida-i自转运蛋白系统研究最广泛的自转运蛋白之一是天然存在于大肠埃希氏菌中的aida-1。它最初是在大肠埃希氏菌的病原菌株中发现的，但随后使用paida-1质粒和pdt1质粒将其转移到实验室大肠埃希氏菌菌株中。在一些实施方案中，本公开提供了其中多核苷酸序列编码目标蛋白质(包括cbm)的paida-1表达载体。例如，具有cbm编码基因的重组paida-1表达载体在图4a和4b中示出。aida-i自转运系统由n末端5kda信号传导肽、5kda接头区域和47kdac末端易位单元组成。信使结构域位于信号传导肽与接头结构域之间。这种自转运蛋白在其信使结构域中没有蛋白质，总共63kda。将目标蛋白质插入信使结构域中以实现表面表达。这在遗传上与位于ndei与saii之间的蛋白质的信号传导肽区域、kpni与saci之间的信使结构域、xbai与noti限制位点之间的肽的接头区域以及对应于c末端易位单元的其余部分蛋白质相对应。paida-1-cbm表达载体包含受lacuv5启动子诱导控制的aida-i基因，并且包括2个蛋白质标签(6xhis标签和myc标签)和2个蛋白酶切割位点(hrv3c和tev)以实现表面表达分析。图4a和4b示出了paida-1cbm表达载体。tev位点是被烟草蚀纹病毒识别的氨基酸序列。它是众所周知的高特异性蛋白酶。hrv3c位点是另一个高度特异性蛋白酶切割位点，位于6xhis标签的c末端。如果需要，这两个蛋白酶切割位点都用于去除蛋白质标签以用于分析目的。6xhis标签位于saii与kpni位点之间。该6xhis标签用于用来自的thetmhis标签抗体[fitc]进行免疫荧光染色，以及用于钴固定金属亲和层析以纯化蛋白质进行存在测定确认。tev位点是myc标签的n末端并且位于paida-i质粒中的aida-i基因内的saci与xbai限制位点之间。存在于质粒上的myc标签可以用于免疫荧光染色，但是未利用此功能。质粒的其他组件包括lac操纵子和置于laci启动子控制下的laci阻遏基因。这三个组件与lacuv启动子一起工作，以调节aida-i基因的表达。paida-1质粒通过p15a复制起点在体内维持，所述复制起点是中等拷贝复制起点。这与低拷贝或高拷贝复制起点的不同之处仅在于细胞内维持的质粒的相对拷贝数量。该质粒的抗生素抗性基因是在其自身启动子控制下的氯霉素(cmr)。brk自展示最近发现brk是一种自转运(自展示)蛋白。自转运蛋白结构域是在某些细菌外膜蛋白中发现的结构域。该结构域位于蛋白质的c末端，并形成β桶结构。桶在膜中取向成使得蛋白质的n末端部分(称为信使结构域)呈现在细胞表面上。借助最近从百日咳博德特菌(bordetellapertussis)中表征的自转运蛋白brka(博德特菌属血清抗性杀伤蛋白a)，与诸如使用冰核蛋白(inp)的其他系统相比，brkautodisplay系统对表面展示的效果更好。使用brka自转运蛋白在大肠埃希氏菌表面上功能展示多种外源蛋白的brkautodisplay系统在sun等人,2015,microb.cellfact.14:129中举例说明，该文献通过引用全文并入本文。发现brka蛋白(genbankwp_010931506.1)的天然形式是链长为1010个氨基酸的蛋白质。前59个氨基酸代表信号肽，并且β桶在氨基酸693-1010之间形成。易位结构域对应于氨基酸545-1010。信使结构域对应于氨基酸60-544，被目标蛋白质诸如cbm替换。前59个氨基酸和β桶区域即693-1010代表最小易位结构域。本公开内容教导了用于表达融合蛋白的重组表达载体/构建体具有编码brka蛋白的以下两部分的两个多核苷酸序列：i)前228个氨基酸(信号肽和5'部分信使结构域)，以及ii)694-1010氨基酸(β桶结构域)序列。在该重组表达载体中，将编码目标蛋白质(诸如cbm)的多核苷酸序列插入brka蛋白的以下两个片段之间：(i)用于信号肽和5'部分信使结构域的一个片段，以及ii)用于β桶结构域的另一个片段。一旦融合蛋白被转运到膜上，它就在对应于野生型brka蛋白位置的asn731与ala732残基之间被切割，此时位于信号肽与b桶易位结构域之间的目标蛋白质(包括cbm)采取其成熟构象并在细胞表面上展示在外部。本文所用的重组表达载体在图6a和图6b中示出。pgex-6p-1brk-cbm表达载体包含受tac启动子控制的aida-i基因，并且包括蛋白质标签(6xhis标签和myc标签)和两个蛋白酶切割位点(hrv3c和tev)以实现表面表达分析。6xhis标签和myc标签的用途如上文充分描述。类似于图6a和图6b，本公开教导了用于表达位于信号肽与β桶易位结构域之间的融合蛋白acc脱氨酶的重组表达载体/构建体，所述融合蛋白acc脱氨酶采取其成熟构象并在细胞表面上展示在外部。本文所用的重组表达载体在图10a和图10b中示出。brk基因的前177个核苷酸(编码59个氨基酸)对应于brk自转运蛋白的信号传导肽部分。这是融合蛋白的最n末端区域。这部分在易位过程中被裂解。紧接在信号传导肽的c末端的是如上所述用于纯化和染色的6xhis标签。这是蛋白质的表面表达端(n末端)。his标签的c末端是目标蛋白质(acc脱氨酶)。his标签的c末端是myc标签，其后是tev位点。紧接在tev位点的c末端的是易位结构域。蛋白质的该区域是蛋白质的最c末端区域，并且是嵌入膜中的蛋白质部分。载体在一些实施方案中，puc-57载体用于敲除靶标基因(包括minc、mind和minc/d)，以包括从蛋白酶缺乏的菌株产生小细胞。从靶标基因的5'和3'端开始，与基因组内靶标基因相对应的约50个碱基对的核苷酸序列(同源臂)用于同源重组，以敲除靶标基因。这将目标基因引导到基因组中的位置，以替换旨在被敲除的靶标基因。在同源臂的内部，插入了发夹环。这些发夹环在被转录为mrna时不允许其中翻译在发夹环外开始的环之间包含的部分的任何翻译。这些发夹环是在dna翻译为rna时形成的，也称为茎环。这使得插入物不会干扰小系统中其他基因的天然启动。由于存在发夹环，将插入物内包含的氯霉素盒(cmr)置于其自身启动子(cat启动子)的控制下。由于包括发夹环，该启动子也不会影响任何基因的调控。在一些实施方案中，当其中可以表达目标蛋白质的蛋白酶缺乏和/或核糖核酸酶缺乏的菌株具有其自身t7rna聚合酶活性时，pet-9a质粒可以用于表达目标蛋白质。pef-9a表达载体在图18a中示出。该质粒在t7启动系统下操作，该系统包括目标基因上游的启动子区域。该启动子序列本质上是t7rna聚合酶的识别位点，所述聚合酶位于载体所转化的细胞系的基因组内的诱导控制下。因此，目标蛋白质的产生受控制t7的启动子而不是存在于质粒上的启动子控制。因为该质粒受t7启动子控制，所以紧接该基因后是t7终止子区域。这是为了确保仅过表达目标基因。目标蛋白质的c末端是可以用于免疫荧光染色的t7表位标签。该质粒通过pbr322复制起点体内维持，所述复制起点通常是高拷贝复制起点。然而，具有高拷贝复制起点的t7启动子是不希望的(蛋白质的毒性水平)，因此还包括rop基因以保持拷贝数量较低。该质粒包含受其自身启动子控制的卡那霉素抗性盒(kanr)，因此用卡那霉素进行选择。在一些实施方案中，当其中可以表达目标蛋白质的蛋白酶缺乏和/或核糖核酸酶缺乏的菌株不具有t7rna聚合酶活性时，pgex-6p-1质粒可以用于表达目标蛋白质。pgex-6p-1表达载体在图18b中示出。pgex-6p-1在tac启动系统下操作。tac启动系统是trp启动子与lac启动子之间的混合启动系统。通过混合启动系统，结合/释放laci蛋白(抑制剂)是启动系统的调节机制，但通过改变诱导剂(通常为iptg)的浓度可调节表达水平。laci基因及其启动子包含在质粒中，以减轻基因表达的任何基础水平，从而增强tac启动子引起的表达控制程度。pgex-6p-1、pgex-6p-2和pgex-6p-3各自编码由prescission蛋白酶在gst结构域与多个克隆位点之间进行位点特异性切割的识别序列。根据本公开的实验需要，每种载体可以互换用于重组载体构建。该pgex质粒通常包含谷胱甘肽s-转移酶标签(gst)，该标签可用于蛋白质纯化或免疫化学应用。然而，鉴于本公开的目的，从pgex-6p-1质粒中去除了gst标签的起始密码子(atg)，以减小目标总蛋白的大小以确保充分的过表达。该质粒还包含gst标签的hrv3c切割位点c末端，以在纯化后去除标签。该质粒通过pbr322复制起点体内维持，所述复制起点是高拷贝复制起点。与t7启动系统不同，由于使用天然rna聚合酶产生mrna，使用具有高拷贝质粒的tac启动系统积累的蛋白质水平没有毒性。该pgex质粒包含受其自身启动子控制的氨苄青霉素抗性盒(ampr)。在一些实施方案中，l4440质粒用于涉及双链rna(dsrna)的rnai，所述dsrna干扰具有与dsrna互补的序列的基因的表达。在一些实施方案中，在来源于核糖核酸酶缺乏的菌株的小细胞内由重组l4440质粒内部表达特异性dsrna。在其他实施方案中，由重组l4440质粒产生特异性dsrna，并将其包封到来源于核糖核酸酶缺乏的菌株的小细胞中。在其他实施方案中，来源于核糖核酸酶缺乏的菌株的小细胞包封内部表达的dsrna和/或外源产生的dsrna。rnai质粒(诸如l4440质粒)通常由在两个t7lac启动子之间克隆的来自预期靶基因的dna编码序列组成。l4440质粒还具有赋予抗生素(在这种情况下为氨苄青霉素)抗性的选择标记。在一些实施方案中，使用携带各种l4440质粒的大肠埃希氏菌菌株ht115，每个质粒包含不同的克隆基因序列。ht115是具有iptg诱导型t7聚合酶活性的rna酶iii缺陷大肠埃希氏菌菌株。为了诱导从这些质粒产生dsrna，使ht115细菌在含有iptg和氨苄青霉素或氨苄青霉素类似物羧苄青霉素的特殊rnaingm饲养板上生长。在某些情况下，羧苄青霉素优于氨苄青霉素，因为它往往更稳定。具有来自秀丽隐杆线虫ubc9基因的插入物的重组l4440载体的实例在图21a中示出。该质粒在t7启动系统下操作，该系统包括位于相反方向上的两个t7启动子。因此，目标基因(诸如秀丽隐杆线虫ubc9基因(图21b))的双向转录物产生用于沉默靶基因的dsrna。插入有秀丽隐杆线虫ubc9靶基因的重组l4440质粒的序列信息在seqidno.42中提供。秀丽隐杆线虫ubc9靶基因的序列信息在seqidno.40中提供。该启动子序列本质上是t7rna聚合酶的识别位点，所述聚合酶位于载体所转化的细胞系的基因组内的诱导控制下。ht115(de3)具有经修饰的lac启动子，可控制t7rna聚合酶的转录。这允许由启动子之间的插入物转录出两条rna链，并形成由小细胞携带到靶细胞中的dsrna。图22a示出了具有插入物即来自科罗拉多马铃薯甲虫的b-肌动蛋白基因的重组l4440载体的另一个实例，该插入物在图22b中示出。插入有科罗拉多马铃薯甲虫b-肌动蛋白靶基因的重组l4440质粒的序列信息在seqidno.43中提供。科罗拉多马铃薯甲虫b-肌动蛋白靶基因的序列信息在seqidno.41中提供。革兰氏阳性细菌衍生物表面上的酶表达酶通过蛋白质介导的膜定位机制(包括但不限于以下连接蛋白质和机制：分选酶连接机制)固定到小细胞表面。分选酶是用于酶固定的自转运蛋白之一，在革兰氏阳性细菌细胞(如枯草芽孢杆菌)中特别有用。该分选酶由d(+)木糖诱导。分选酶是一种将表面蛋白附接到细胞壁上的转肽酶；它在lpxtg基序的gly与thr之间裂解，并催化在苏氨酸的羧基与细胞壁肽聚糖的氨基基团之间形成酰胺键。在一些实施方案中，可以将lpxtg基序插入目标酶促活性多肽的c末端，以在革兰氏阳性细菌细胞的表面上表达。分选酶可以识别该基序，并使酶促活性多肽与革兰氏阳性细菌细胞的表面共价结合。同样，小细胞可以由嗜极菌工程化而来，使得它们保留亲本物种的弹性物理和化学特性。例如，来自嗜热菌的小细胞将保持对高温的抵抗力。荧光蛋白融合、atp合酶介导的蛋白定位、琥珀酸脱氢酶介导的蛋白定位。mitrasd等人,2016,trendsinmicrobiology,24(8):611-621中报道了革兰氏阳性细菌中膜蛋白的聚焦以及连接机制，该文献通过引用全文并入本文。酵母衍生物表面上的酶表达酶可以通过表面展示蛋白固定到酵母小细胞的表面。小细胞可以由酵母菌株(包括但不限于酿酒酵母、毕赤酵母和/或粟酒裂殖酵母)产生。从在酵母细胞中表达的蛋白质中溶解出来源于重组来源的哺乳动物膜蛋白的晶体结构：来自兔的ca2+-atpase(serca1a)。该蛋白质在酿酒酵母中过表达。另外，大鼠电压依赖性钾离子通道kv1.2在毕赤酵母中产生，以了解其结构。从此，已经将几种其他宿主细胞用于真核膜蛋白产生，包括大肠埃希氏菌、杆状病毒感染的昆虫细胞和哺乳动物细胞系。尽管所有宿主系统都有优点和缺点，但酵母在真核膜蛋白领域仍然是一贯流行的选择。作为微生物，它们培养起来快速、简单且便宜；作为真核生物，它们能够在翻译后加工真核膜蛋白。酵母中产生的重组跨膜蛋白的最新晶体结构包括使用毕赤酵母来源的样品产生的人水通道蛋白2、鸡蛙皮素-1、人traak通道、人白三烯c4合酶、藻类p-糖蛋白同源物和小鼠p-糖蛋白的晶体结构；使用在酿酒酵母中产生的重组蛋白来溶解拟南芥(arabidopsisthaliana)nrt1.1硝酸盐转运蛋白、真菌植物病原体tmem16脂质爬行酶和酵母线粒体adp/atp载剂的结构。由于具有作为真核细胞的特征，酵母细胞可以用于产生酶固定的小细胞。酵母膜的组成与哺乳动物膜的组成不同。这与酵母中产生的重组膜蛋白的后续结构和功能研究有关，因为脂质通过促进膜流动性而在膜蛋白的正常功能中具有特别重要的作用，并且可直接与膜蛋白相互作用。为了“人源化”酵母膜，已经开发出可以合成胆固醇而不是天然酵母固醇麦角固醇的酵母菌株。这是通过分别用哺乳动物基因dhrc24和dhrc7替换麦角固醇生物合成途径的erg5和erg6基因来实现的。dhrc7和dhrc24的基因产物被鉴定为在胆固醇(而不是麦角固醇)合成中的位置c7和c24处使固醇中间体饱和的关键酶。在麦角固醇生物合成途径中，erg5p在位置c22处引入双键，而erg6p在位置c24处添加甲基基团，因此与dhrc24的基因产物竞争其底物。除了目标基因的开放阅读框(orf)外，典型的表达质粒通常还在其表达盒中掺入许多其他序列。酿酒酵母α-交配因子信号序列是商业表达质粒的常见添加序列，因为据信它可以将重组膜蛋白正确地靶向酵母膜。例如，它的存在对小鼠5-ht5a羟色胺受体的产率具有积极影响，但显著降低了组胺h1受体的表达。已经使用了替代信号序列(虽然频率要低得多)，诸如真菌gpcr的ste2前导序列ste2p。酵母中的已知信号序列可以是转运与膜相关蛋白/结构域融合的目标蛋白质并将目标蛋白质固定在酵母细胞表面上的另一个优点。由小细胞包封的生物活性化合物的释放本公开教导了生物活性化合物保留在小细胞内并随时间释放。本公开教导了一种包封至少一种生物活性化合物和/或表达融合蛋白的高价值、小体积无核小细胞产品。在一些实施方案中，融合蛋白具有至少一个表面表达部分和至少一个细胞粘附部分。在一些实施方案中，融合蛋白具有至少一个表面表达部分和至少一个细胞刺激部分。在一些实施方案中，融合蛋白具有至少一个表面表达部分和至少一个细胞降解部分。在一些实施方案中，基于无核细胞的产品可以比其他可商购获得的农用化学物质产品喷得更少，并且还在较长的时间段内保持活性化合物的期望效果。如本文所用，术语“控制释放”是指随时间以受控方式释放由本公开所述的无核细胞包封的一种或多种农用化学物质。出于本公开的目的，控制释放是指生物活性化合物一旦从制剂中释放出来，就以受控速率释放，使得从化合物开始释放起，化合物的水平和/或浓度在延长的时间段内持续和/或延迟，从而例如在间隔延长的时间段内提供释放。农用化学物质的当前控制释放机制主要基于肥料(例如agrium，icl，kingenta和ekompany)或农药(例如adama，syngenta，bayer)的完全包封。肥料的完全包封通常基于树脂(例如聚氨酯)或硫类混合物。将农药装载到微聚合物胶囊中。由于需要厚壁来抵抗高内压，因此胶囊化肥料的产品仅限于毫克规模的干肥料。这种压力是由于溶解肥料的负渗透势驱动水进入胶囊而形成的。随着更多的肥料被包封，将形成更大的压力，并且需要更厚的壁。肥料量与壁厚之间的可行比例为几十毫克规模。然而，包封的肥料仍然非常昂贵，其成本高达肥料价格的四倍。此外，释放机制基于穿过分布在壳体中的断层和裂缝进行的转运。这意味着，包覆在整个表面积上必须均匀，这又是一个制造挑战。除此以外，用于包覆的材料对温度敏感，并且在很小的温度范围内(17℃-25℃)会极大地改变其结构性能，从而导致释放速率发生巨大变化(速率高达两倍)。因此，农用化学物质的常规包封的挑战是均匀包覆和温度依赖性。如果希望在制剂在叶或类似表面上干燥期间允许快速释放包封的组合物，则必须具有薄壁微胶囊。通常，平均直径为约2微米的微胶囊在制剂中需要约3重量％的聚合物壁浓度。较大量的聚合物会降低释放速度。胶囊的直径和成壁聚合物的量可以用于调节胶囊的性能，这取决于所需的农药和使用条件。农用化学物质(诸如农药、除草剂、杀真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、肥料等)的使用日益增加带来了严重的健康和环境问题，必须控制这些问题才能使那些产品的有害影响最小化。除草剂(诸如甲草胺、异丙甲草胺、达草灭和甲嘧磺隆)经常遇到的一个问题是浸出和迁移，这会导致除草效率丧失，并且可能损害其他作物并污染水源。本公开教导了可以以受控方式释放由本文公开的小细胞包封的生物活性化合物。在一些实施方案中，化合物的控制释放通过试剂(诸如戊二醛、甲醛)以及天然化合物(诸如京尼平和表没食子儿茶素没食子酸酯、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯的衍生物、亚甲基双丙烯酰胺的衍生物和无甲醛的交联剂dvb(二乙烯基苯))的处理来确定。在一些实施方案中，不同浓度的试剂(例如戊二醛)可以以不同程度防止包封生物活性化合物的小细胞降解。在其他实施方案中，所述试剂包括但不限于戊二醛、甲醛以及天然化合物，诸如京尼平和表没食子儿茶素没食子酸酯、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯的衍生物、亚甲基双丙烯酰胺的衍生物和无甲醛的交联剂dvb(二乙烯基苯)。在一些实施方案中，由本文公开的小细胞包封的生物活性化合物可以以每天1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的所需小细胞单元/输入的速率释放。在其他实施方案中，所需小细胞单元/输入的量就是包封的生物活性化合物。生物活性化合物的包封量可以计算包封分数和质量分数，从而确定每天的所需小细胞单元和/或输入。在一些实施方案中，未经试剂(例如戊二醛)处理的小细胞可初始每天快速释放10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的所需单元和/或输入，然后控制释放用不同浓度的试剂(例如戊二醛)处理的小细胞，从而使得每天控制释放1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的所需单元。在一些实施方案中，不同浓度的试剂(例如戊二醛)可以以不同程度防止包封生物活性化合物的小细胞降解。在一些实施方案中，所述试剂包括但不限于戊二醛、甲醛以及天然化合物，诸如京尼平和表没食子儿茶素没食子酸酯、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯的衍生物、亚甲基双丙烯酰胺的衍生物和无甲醛的交联剂dvb(二乙烯基苯)。改善的包封和保留为了改善包封和保留，本公开教导了可以在包封溶液中使用溶剂以增加生物活性化合物在小细胞中的溶解度。这些溶剂包括但不限于cacl2溶液、乙醇、dmso、聚乙二醇和甘油。这些溶剂不仅可以用来增加某些活性化合物的溶解度，而且可用来增加活性化合物通过某些蛋白质通道或通过外膜的脂质双层扩散到细胞中。除了使用溶剂来增强基于无核细胞的平台的包封过程外，还可以使用某些固定剂、防腐剂和交联剂来将活性成分捕获在小细胞的膜内，使某些活性化合物与小细胞本身交联，并改善小细胞的稳定性。可以调节这些稳定剂/交联剂的相对浓度，以实现活性成分所需的负载能力以及活性成分从细胞中释放的动力学。这些试剂包括但不限于合成化合物(诸如戊二醛、甲醛)以及天然化合物(诸如京尼平和表没食子儿茶素没食子酸酯)。在一些实施方案中，本文所述的小细胞用溶剂、试剂、固定剂、防腐剂或交联剂处理以具有更好的溶解性、增加的稳定性或增强的完整性。在一些实施方案中，所述小细胞表现出所述生物活性化合物的控制释放速率，其中所述释放可以是稳定释放或初始突释然后稳定释放。在其他实施方案中，小细胞可以显示其固有的和修饰的稳定性，并且可以承受各种环境条件以及温度、ph和/或剪切应力变化。在其他实施方案中，本公开教导了无核小细胞可以来源于核糖核酸酶缺乏的细胞菌株和/或蛋白酶缺乏的细胞菌株。另外，小细胞可以由经遗传工程化以破坏核糖核酸酶和/或蛋白酶的结构/功能的细胞菌株产生。核糖核酸酶缺乏的小细胞可以捕获dsrna并将其递送到本文公开的靶标。为了增强dsrna的包封和保留，本公开教导了dsrna结合蛋白在内部和/或外部的表达。一旦dsrna结合蛋白识别并结合小细胞内的dsrna，dsrna就不能流回穿过膜。另外，dsrna结合蛋白可以帮助dsrna包封和保留，以及保护dsrna以免被rna酶降解。另一方面，当表达dsrna结合蛋白以保护dsrna免受rna酶活性的影响时，蛋白酶缺乏的小细胞可以更好地将dsrna包封并保留在小细胞内。rna酶不能轻易接近与dsrna结合蛋白结合的dsrna进行降解。dsrna结合蛋白也可以结合内部dsrna产生表达，以确保更好的保留。在一些实施方案中，小细胞在细胞内表达多肽，并且其中所述多肽与细胞内的所述至少一种生物活性化合物(诸如dsrna)结合。在其他实施方案中，所述至少一种生物活性化合物是dsrna，并且其中所述多肽是dsrna结合蛋白。dsrna结合蛋白增加了所述dsrna的稳定性并保护了所述dsrna免于降解。在其他实施方案中，dsrna结合蛋白是drb4蛋白。在一些实施方案中，农业制剂在小细胞内包含多肽，其中所述多肽在所述小细胞内表达，其中所述多肽与所述核酸结合。在一些实施方案中，所述多肽是dsrna结合蛋白，并且其中所述dsrna结合蛋白增加负载并增强dsrna的稳定性。侵入性递送本公开教导了一种通过施加可以帮助改善小细胞穿透到靶标(诸如植物、害虫、昆虫、臭虫、蠕虫、病原体和寄生虫)中的试剂来将生物活性化合物侵入性递送到靶细胞中的方法，所述靶细胞不是哺乳动物细胞。将本文所述的包封生物活性化合物的无核小细胞与试剂一起施加于靶细胞。在一些实施方案中，所述试剂是用于改善无核小细胞穿透到靶细胞中并在靶细胞内侵入性递送生物活性化合物的佐剂。所述试剂是表面活性剂、乳化剂、作物油浓缩液、穿透剂、盐或其组合。所述试剂的非限制性实例是甲基化种子油、n,n-二甲基癸酰胺和n-癸基-n-甲基甲酰胺。在一些实施方案中，提供了一种递送至少一种生物活性化合物的方法，所述方法包括：将所述小细胞与试剂一起施加于所述靶细胞，其中所述试剂是用于改善小细胞穿透到靶细胞中的佐剂。在其他实施方案中，提供了一种递送至少一种生物活性化合物的方法，所述试剂是表面活性剂、乳化剂、作物油浓缩液、穿透剂、盐或其组合。可以使用各种表面活性剂和其他制剂添加剂来增强纳米颗粒或化合物通过根和叶进入植物的吸收/侵入。有机硅表面活性剂可以增强化合物和纳米颗粒通过气孔、角质层和根系的吸收。可以将基于脂质的结晶纳米颗粒用作表面活性剂，以改善生物活性化合物通过角质层的递送。在其他实施方案中，本公开教导了一种通过表达改善植物表面的穿透或增加通过根或气孔的吸收的蛋白质来将生物活性化合物侵入性递送到靶细胞中的方法。在一些实施方案中，小细胞表达至少一种融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞降解部分。靶细胞降解部分包含角质酶和纤维素，它们可以促进小细胞穿过植物表面并将生物活性化合物递送到靶细胞、组织或器官中。在一些实施方案中，完整无核细胞在其表面上表达促进所述无核细胞穿透植物角质层进入靶细胞的角质酶。完整无核细胞表达在其表面上展示的异源角质酶。完整无核细胞在其表面上表达分解靶细胞壁并促进所述无核细胞穿透到靶细胞中的纤维素酶。完整无核细胞表达在其表面上展示的异源纤维素酶。在其他实施方案中，本公开教导了一种通过由植物侵染物种(诸如土壤杆菌和内生菌)产生小细胞来将生物活性化合物侵入性递送到靶细胞中的方法，所述靶细胞不是哺乳动物细胞。本公开提供了由植物病原细菌和真菌(诸如内生菌)产生小细胞的组合物和方法。细菌和/或酵母物种具有将其自身从环境转运到靶植物的细胞、内部组织或器官的机制。在一些实施方案中，小细胞是从这些细菌和酵母内生菌产生的。用于产生小细胞的内生菌包括但不限于敏捷食酸菌、慢生根瘤菌属、根瘤菌属、紫红红球菌、炭疽菌属、弯孢属、香柱菌属、镰刀菌属、球腔菌属、内生真菌、梨形孢属和梨型孢菌属。来源于内生菌的小细胞可以包封本文所述的生物活性化合物，并通过侵入/穿透机制将其递送到靶植物的内部部分中。通过叶片吸收生物活性化合物或颗粒的途径有几种。这些途径包括通过毛状体、气孔、植物伤口、根结、柱头和角质层(alshaal等人,env.biodiv.soilsecurity1:71-83,2017)。由于在植物叶片的最外层广泛存在角质层，因此发生叶面吸收的主要方式是通过角质层。各种亲脂性和亲水性化合物能够通过水性孔(对于极性化合物)或角质基质(对于非极性化合物)穿过角质层转运(wang等人,pestcidebiochemistryandphysiology,87(1):1-8,2007)。据报道，已经表明从带负电的二氧化硅纳米颗粒(20nm)到基于脂质的结晶np(150-300nm)的各种纳米颗粒都可以在肌动细胞壁上和角质层中积累(schwab等人,jofnanotoxicology10(3):257-278,2016)。在植物组织中存在角质层的可穿透区，诸如毛状体、排水器或细胞连接，它们也具有吸收功能。另一方面，植物能够通过气孔吸收化合物和纳米颗粒。对于每种植物物种，通过气孔吸收的能力是不同的，但是已经表明气孔通常具有进入叶片的高转运速度，尤其是对于小于10nm的颗粒或化合物。然而，较大的纳米颗粒也能够通过气孔开口进入植物。已经表明叶面施加纳米颗粒会使得纳米颗粒从气孔腔转移到植物组织、脉管系统和根角质层(schwab等人,jofnanotoxicology10(3):257-278,2016)。细菌(比小细胞大)也能够通过气孔开口侵入植物，经常使用毒力因子调节其开口(zeng等人,curr.opin.biotechnol.21(5):599-603,2010)。在一些实施方案中，当将包封生物活性化合物的小细胞施加于靶植物的叶片时，本文公开的小细胞被吸收到靶植物并转移到靶细胞。农用化学物质或纳米颗粒在土壤中的农业应用可以非常有效，因为纳米颗粒通常会在土壤的前几米或几厘米内积累，因此与根际紧密相互作用。许多研究表明，纳米颗粒能够在植物的根、根尖、根冠和粘液附近积累和聚集。研究还表明，植物根系周围的粘液、渗出液和exdna用作固定某些纳米颗粒和细菌的“陷阱”。此外，已经表明植物根能够将多种化合物和纳米颗粒吸收和吸取到植物脉管系统和组织中(schwab等人,jofnanotoxicology10(3):257-278,2016)。在一些实施方案中，当将包封生物活性化合物的小细胞施加于土壤和/或靶植物的根时，本文公开的小细胞被吸收到靶植物并转移到靶细胞。一旦这些化合物和/或纳米材料成功侵入植物并接近植物细胞膜，它们就会经历内吞作用过程。植物细胞膜通过内吞作用吸收细胞外物质，包括纳米颗粒。纳米颗粒(至多500nm，无论电荷如何)可以通过内吞作用进入植物细胞。纳米颗粒和其他化合物进入植物细胞的替代途径是通过细胞膜本身的穿透途径。这些途径中的一种即水通道蛋白允许非离子溶质非选择性地被吸收到植物细胞中。在一些实施方案中，当通过内吞作用施加本文所述的无核小细胞时，将至少一种生物活性化合物递送到靶细胞中，所述靶细胞不是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，将本文所述的小细胞施加于靶标并通过内吞作用递送到靶标的细胞中。靶标如本文所用，术语“靶标”旨在包括可将本公开的化合物、小细胞、工业制剂或基于无核细胞的平台施加于植物或害虫的任何靶标表面。例如，对于植物，植物材料包括根、鳞茎、块茎、球茎、叶、花、种子、茎、愈伤组织、坚果、谷物、果实、插条、砧木、接穗、收获的作物(包括根、鳞茎、块茎、球茎、叶、花、种子、茎、愈伤组织、坚果、谷物、果实、插条、砧木、接穗)或可接触收获的作物的任何表面(包括收获设备、包装设备和包装材料)。术语“靶细胞”是指作为每个靶标的组分的细胞。在一些实施方案中，根据本公开的某些实施方案，示例性作物包括但不限于行栽作物、特色作物、商品作物和观赏作物。行栽作物的实例包括向日葵、马铃薯、油菜、干豆、紫花豌豆、亚麻、红花、荞麦、棉花、玉米、大豆和甜菜。商品作物的实例包括玉米、大豆和棉花。观赏作物的实例包括黄杨木、圣诞树、温室种植的装饰植物根据本公开的某些实施方案，本公开还教导了示例性作物作为靶标，包括蔬菜，诸如西兰花、菜花、朝鲜蓟、豌豆、黄豆、羽衣甘蓝、芥蓝菜、菠菜、芝麻菜、甜菜叶、白菜、甜菜、菜心、萝青卜、菊苣、生菜、芥末、青菜、西洋菜、大蒜叶、青花菜、韭菜、球芽甘蓝、刺山柑、大头菜、芹菜、大黄、刺菜蓟、中国芹菜、柠檬草、芦笋、竹笋、高良姜、姜、大豆、绿豆、乌拉德豆、胡萝卜防风草、甜菜根、萝卜、芜菁甘蓝、红萝卜、牛蒡、洋葱、小葱、大葱、大蒜、青豆、扁豆和荷兰豆；水果，诸如西红柿、黄瓜、倭瓜、夏南瓜、南瓜、甜瓜、辣椒、茄子、绿番茄、佛手瓜、秋葵、面包果、鳄梨、黑加仑、红加仑、醋栗、番石榴、蛋黄果、红辣椒、石榴、猕猴桃、葡萄、蔓越莓、蓝莓、橙子、柠檬、酸橙、葡萄柚、黑莓、覆盆子、波森莓、菠萝、无花果、桑椹、桑橙、苹果、玫瑰果和草莓；坚果，诸如杏仁、胡桃、核桃、巴西坚果、石栗、腰果、gevuinanut、马栗、夏威夷果、马拉巴栗、mongongo、花生、松子和开心果；块茎，诸如马铃薯、蕃薯、木薯、山药和大丽花；谷类或谷物，诸如玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦、福尼奥米、荞麦和藜麦；纤维，包括例如棉花、亚麻、大麻、木棉、黄麻、苎麻、剑麻和其他植物纤维；刺激料作物，包括例如咖啡、可可豆、茶、马黛(mate)、其他植物；以及豆类，包括例如豆子(包括例如腰豆、藊豆、利马豆、奶油豆、红豆、绿豆、金豆、绿革兰豆、黑革兰豆、黑绿豆、荷包豆、米豆、蛾豆、花菜豆、扁豆、风信子豆、刀豆、四棱豆、瓜尔豆、黎豆、山药豆和其他豆子)、马蚕豆、蚕豆、芸豆、青豆、鹰嘴豆、孟加拉革兰克、加班佐豆、豇豆、黑眼豆、树豆、木豆、刚果豆、小扁豆、班巴拉花生、花生、野豌豆、羽扇豆和其他豆类。在一些实施方案中，本公开内容还教导了示例性水产养殖靶标，包括鱼、虾、贝类和甲壳动物。靶标可以是引起疾病的病毒。本公开教导了靶细胞包括植物细胞、昆虫细胞、蠕虫细胞、细菌细胞、真菌细胞、病毒和水生动物的细胞，其中所述水生动物包括鱼、贝类和甲壳动物。应当理解，本文所述的基于无核细胞的平台和/或农业制剂在渔业和水产养殖业中特别有用，主要是通过使微生物对贝类、软骨鱼、鳍鱼或水生哺乳动物的有害影响降低。贝类可包括一组滤食性双壳类，诸如蛤蚌、牡蛎、扇贝和贻贝，并且可另外包括龙虾、螃蟹和基围虾。鳍鱼包括但不限于鲑鱼物种，包括大西洋鲑鱼(salmosalar)、虹鳟鱼(oncorhynchusmykiss)。其他水生动物是鱼，包括鳕鱼物种，包括大西洋鳕鱼(gaduscallarias)、海鳟鱼(salmotrutta)和海鲈鱼(dicentrarchuslabrax)、鳕鱼、鳗鱼以及淡水鳍鱼和鲤鱼。此外，水生动物可以是海豚或鲸鱼。水生动物还包括在整个鱼缸维护爱好中广泛使用的任何广泛已知的观赏鱼。观赏爱好鱼包括淡水鱼和咸水鱼。观赏鱼的代表性物种是爱好狂热者众所周知的。优选地，水生动物是在水产养殖中养殖的动物。水生动物可处于早期发育阶段，诸如幼年和青少年动物，或者处于青少年阶段之后的晚期发育阶段。本公开提供了将如本文所述的基于无核细胞的平台和/或农业制剂靶向植物、昆虫、蠕虫、细菌、真菌、病毒和水生动物，其中所述水生动物包括鱼、贝类和甲壳动物。在一些实施方案中，靶标是农业害虫，诸如螨虫、蚜虫、粉虱和蓟马等农业害虫。除螨虫、蚜虫、粉虱和蓟马以外的其他农业昆虫害虫的实例包括小菜蛾(plutellaxylostella)、甘蓝夜蛾(mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(spodopteralitura)、苹果小卷蛾(cydiapomonella)、棉铃虫(heliothiszea)、烟芽夜蛾(heliothisvirescens)、舞毒蛾(lymantriadispar)、稻纵卷叶螟(cnaphalocrocismedinalis)、小卷叶蛾属某种(adoxophyessp.)、科罗拉多马铃薯甲虫(leptinotarsadecemlineata)、葫芦叶甲虫(aulacophorafemoralis)、棉铃象鼻虫(anthonomusgrandis)、飞虱、叶蝉、介壳虫、臭虫、草蜢、花蝇、圣甲虫、球菜夜蛾(agrotisipsilon)、黄地老虎(agrotissegetum)和蚂蚁。此外，其他农业害虫的实例包括土壤害虫，诸如植物寄生线虫，诸如根结线虫(meloidogynidae)、胞囊线虫(heteroderidae)、根腐线虫(pratylenchidae)、白尖线虫(aphelenchoidesbesseyi)、草莓芽线虫(nothotylenchusacris)和松木线虫(bursaphelenchusxylophilus)；腹足动物，诸如蛞蝓和蜗牛；以及等足动物，诸如鼠妇(armadillidiumvulgare)和球鼠妇(porcellioscaber)。其他昆虫害虫的实例包括卫生昆虫害虫，诸如热带鼠螨(ornithonyssusbacoti)、蟑螂、家蝇(muscadomestica)和家蚊(culexpipienspallens)；储存谷类昆虫，诸如麦蛾(sitotrogacerealella)、红豆象鼻虫(callosobruchuschinensis)、赤拟谷盗(triboliumcastaneum)和粉虫；衣物昆虫害虫，诸如衣蛾(tineatranslucens)和黑毛皮蠹(attagenusunicolorjaponicus)；家庭和室内昆虫害虫，诸如地下白蚁；住家螨虫，诸如霉螨(tyrophaqusputrescentiae)、尘螨(dermatophagoidesfarinae)和瓜螨(chelacaropsismoorei)；以及卫生昆虫害虫，诸如热带鼠螨(ornithonyssusbacoti)。昆虫害虫包括选自以下各项的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱亚目、隐翅目、毛翅目等。在一些实施方案中，昆虫选自棉铃虫、土食虫、绿盲蝽、蚜虫、绿菜蝽、苹果棉铃蝽、蓟马(斑蓟马、烟草蓟马、洋葱蓟马、西花蓟马)、粉虱和二斑螨虫。在一个实施方案中，动物中的昆虫害虫包括跳蚤、虱子、蚊子、苍蝇、采采蝇、蚂蚁、扁虱、螨虫、蠹虫和恙螨。上述农业害虫和昆虫害虫例如在美国专利申请号2012/0016022和2016/0174571中描述，上述申请通过引用全文并入本文。生物活性化合物递送量在一些实施方案中，将生物活性化合物包封在本文所述的无核细胞内并递送到所需靶标。本文以用于制备无核细胞以包封和递送生物活性化合物的各种组分的重量百分比提供了目标生物活性化合物的量。用于制备无核细胞以包封和递送生物活性化合物的各种组分的重量百分比可以根据需要变化以实现最佳结果。在一些实施方案中，基于其内包封有目标活性化合物的无核细胞的总重量，生物活性化合物(包括但不限于核酸、多肽、代谢物、化学信息素和微量营养素、多肽)以约0.1至约90重量％的量存在，以约0.5至约80重量％、1至约70重量％、2至约60重量％、3至约55重量％、5至约50重量％、10至约45重量％和15至约40重量％的量存在。当聚合物用于制备本文公开的无核细胞时，根据一个实施方案，基于本文公开的无核细胞的总重量，其以约0.01至约10重量％的量存在。当共溶剂用于制备本文公开的无核细胞时，根据一个实施方案，基于本文公开的无核细胞的总重量，其以约0.1至约30重量％的量存在。还可以设想替代的重量百分比。例如，基于本文公开的无核细胞的总重量，目标生物活性化合物可以以至多约50重量％的量存在；溶剂可以以至多约70重量％的量存在；表面活性剂可以以至多约40重量％的量存在，并且水可以以约1至约90重量％的量存在。在本公开的各个方面中，按无核细胞内生物活性化合物的重量计，无核细胞的包封形式为至少约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的目标生物活性化合物。在其他实施方案中，无核细胞内生物活性化合物以至少约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100g/l的量存在。在另一个实施方案中，目标生物活性化合物和无核细胞以至少1:200、1:195、1:190、1:185、1:180、1:175、1:170、1:165、1:160、1:155、1:150、1:145、1:140、1:135、1:130、1:125、1:120、1:115、1:110、1:105、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:65、1:60、1:55、1:50、1:45、1:40、1:35、1:30、1:25、1:20、1:15、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、110:1、120:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1或200:1的重量比存在于本公开的组合物中。在另一个实施方案中，目标生物活性化合物和无核细胞以约1:50至约50:1、约1:40至约40:1、约1:30至约30:1、约1:20至约20:1、约1:10至约10:1或约1:5至约5:1的重量比存在。在其他实施方案中，包封生物活性化合物的无核细胞的制剂的密度为至少0.01、至少0.02、至少0.03、至少0.04、至少0.05、至少0.06、至少0.07、至少0.08、至少0.09、至少0.1、至少约0.2、至少约0.3、至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7、至少约1.8、至少约1.9、至少约2.0、至少2.1、至少约2.2、至少约2.3、至少约2.4、至少约2.5、至少约2.6、至少约2.7、至少约2.8、至少约2.9、至少约3.0、至少3.1、至少约3.2、至少约3.3、至少约3.4、至少约3.5、至少约3.6、至少约3.7、至少约3.8、至少约3.9、至少约4.0、至少4.1、至少约4.2、至少约4.3、至少约4.4、至少约4.5、至少约4.6、至少约4.7、至少约4.8、至少约4.9、至少约5.0、至少约5.5、至少约6.0、至少约6.5、至少约7.0、至少约7.5、至少约8.0、至少约8.5、至少约9.0、至少约9.5或至少约10.0克/升。在一些实施方案中，目标生物活性化合物例如以配制产品的总质量的至少约20％存在。在其他实施方案中，为本文公开的生物活性化合物提供了配制产品的总质量的约20％至40％，并且其余约60％至80％的质量来自无核细胞。在一些实施方案中，可以将多于一种非表达的生物活性化合物包封在无核细胞内。在另一个实施方案中，配制产品包含两种生物活性化合物，它们以至少1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1的重量比存在于本公开的组合物中。就生物活性化合物的量而言，为配制产品提供约0.01-20、约0.1-15、约0.2-10、约0.3-9、约0.3-8、约0.5-5、约1-3g/l的浓度。在一些实施方案中，本文公开的靶向递送和控制释放可以改善生物活性化合物的功效，因此可以更少地使用生物活性化合物的量。基于无核细胞的平台的制剂可以是液体或固体形式。在一些实施方案中，配制产品是液体形式，诸如溶液。在一些实施方案中，配制产品是固体形式，诸如粉末。在一些实施方案中，农业制剂还包含可用于促进植物生长、减少杂草或减少害虫的农业化学物质。在一些实施方案中，农业制剂还包含杀真菌剂、除草剂、农药、杀线虫剂、杀虫剂、植物激活剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂、杀螨剂、杀软体动物剂或肥料中的至少一种。在一些实施方案中，农业制剂还包含表面活性剂。在一些实施方案中，农业制剂还包含载剂。本公开提供了被配制用于接触植物的农业制剂。根据本公开，所述制剂可以适用于例如在载剂中处理植物或植物繁殖材料，诸如种子。合适的添加剂包括缓冲剂、润湿剂、涂层剂、多糖和研磨剂。示例性载剂包括水、水溶液、浆液、固体和干粉(例如，泥炭、小麦、麸皮、蛭石、粘土、巴氏杀菌的土壤、多种形式的碳酸钙、白云石、各种等级的石膏、膨润土和其他粘土矿物、岩石磷酸盐和其他磷化合物、二氧化钛、腐殖质、滑石、藻酸盐和活性炭)。本领域技术人员已知的任何农业上适合的载剂都将是可接受的并且被考虑用于本发明中。任选地，所述制剂还可以包含至少一种表面活性剂、除草剂、杀真菌剂、农药或肥料。在一些实施方案中，农业制剂还包含表面活性剂、除草剂、农药(诸如但不限于杀真菌剂、杀菌剂、杀虫剂、杀螨剂和杀线虫剂)、植物激活剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂或肥料中的至少一种。在一些实施方案中，示例性除草剂包括但不限于百草枯、硝磺草酮、磺草酮、广灭灵、四唑酰草胺、苯噻酰草胺、恶嗪草酮、茚草酮、草甘膦、苄草丹、草达灭、醚苯磺隆、氯吡嘧磺隆、丙草胺、苯吡唑草酮、环磺酮、异恶唑草酮、氟磺胺草醚、炔草酯、精稳杀得、麦草畏、2,4-d、唑啉草酯、氟吡草酮、异丙甲草胺和罗克杀草砜。上述除草活性成分描述于例如“thepesticidemanual”，编辑c.d.s.tomlin，第12版，britishcropprotectioncouncil，2000，在括号中添加了条目号；例如，其中描述了硝磺草酮(500)。上述化合物描述于例如美国专利号7,338,920，该专利通过引用全文并入本文。在一些实施方案中，示例性杀真菌剂包括但不限于氟唑环菌胺、咯菌腈、吡噻菌胺、丙硫菌唑、粉唑醇、苯醚甲环唑、嘧菌酯、克菌丹、环丙唑醇、嘧菌环胺、啶酰菌胺、烯唑醇、氟环唑、氟嘧菌酯、肟菌酯、甲霜灵、精甲霜灵、喹唑菌酮、氯苯嘧啶醇、氟苯嘧啶醇、啶斑肟、唑菌胺酯、噻菌灵、戊唑醇、三唑醇、苯霜灵、精苯霜灵、苯菌灵、多菌灵、萎锈灵、氟酰胺、麦穗宁、双胍盐、腈菌唑、四氟醚唑、抑霉唑、叶菌唑、联苯三唑醇、霜脲氰、种菌唑、异菌脲、咪鲜胺、戊菌隆、霜霉威、硫硅菌胺、福美双、咪唑嗪、灭菌唑、对甲抑菌灵、吡唑萘菌胺、双炔酰菌胺、噻菌灵、氟唑菌酰胺和锰化合物(诸如代森锰锌、代森锰)。在一些实施方案中，农业化学制剂包含有效量的杀虫剂、杀螨剂和/或杀线虫剂中的一种或多种，它们选自由以下各项组成的组：噻虫嗪、吡虫啉、噻虫胺、高效氯氟氰菊酯、七氟菊酯、β-氟氯氰菊酯、苄氯菊酯、阿维菌素、氟虫腈、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和多杀菌素。具有共同名称的上述每种农药的详细信息(例如，结构、化学名称、商业名称等)可以在“e-pesticidemanual，版本3.1，第13版，cdctomlin编辑，britishcropprotectioncouncil，2004-05”中找到。上述化合物描述于例如美国专利号8,124,565，该专利通过引用全文并入本文。在一些实施方案中，其他示例性杀真菌剂包括但不限于嘧菌环胺((4-环丙基-6-甲基-嘧啶-2-基)-苯胺)、多果定、百菌清、灭菌丹、丙硫菌唑、啶酰菌胺、丙氧喹啉、二噻农、氟啶胺、种菌唑和苯菌酮。上述一些化合物描述于例如“thepesticidemanual”[thepesticidemanual—aworldcompendium；第十三版；编辑：c.d.s.tomlin；thebritishcropprotectioncouncil，2003]。上述化合物描述于例如美国专利号8,349,345，该专利通过引用全文并入本文。在一些实施方案中，其他示例性杀真菌剂包括但不限于咯菌腈、甲霜灵和嗜球果伞素杀真菌剂或其混合物。在一些实施方案中，嗜球果伞素杀真菌剂是嘧菌酯、啶氧菌酯、醚菌酯或三氟敏。在一些实施方案中，农业化学制剂包含有效量的选自苯基吡唑和新烟碱的杀虫剂中的一种或多种。在一些实施方案中，苯基吡唑是氟虫腈，并且新烟碱选自噻虫嗪、吡虫啉、噻虫啉、噻虫胺、烯啶虫胺和啶虫脒。上述化合物描述于例如美国专利号7,071,188，该专利通过引用全文并入本文。在一些实施方案中，一种或多种生物农药包括但不限于巴斯德氏芽菌属某些种(pasteuriaspp.)、拟青霉属(paeciliomyces)、厚垣普奇尼亚菌(pochoniachlamydosporia)、漆斑菌属(myrothecium)代谢物、产气霉属(muscodor)挥发物、万寿菊属某些种(tagetesspp.)、坚强芽孢杆菌(bacillusfirmus)(包括坚强芽孢杆菌cncm1-1582)。实施例给出以下实施例是为了说明本公开的各种实施方案，并不意味着以任何方式限制本公开。本领域技术人员将想到如权利要求的范围所限定的本公开的精神内所涵盖的其中变化和其他用途。实施例1.产生核糖核酸酶缺乏和/或蛋白酶缺乏的小细胞通过pcr扩增(eppendorfmastercycler5333)并使用laxcolmc4000显微镜(40x物镜、明场和荧光led光源)结合zeisssigmavphd场sem(uvaadvancedmicroscopycore)进行形态表征，确定这些敲除是否成功。根据图17a和图17b中示出的结果，确定minc、mind和/或minc/d敲除产生了形态特征最接近原始野生型p678-54菌株产生的小细胞的核糖核酸酶缺乏的小细胞(adler等人,1967,proc.natl.acad.sci.usa57:321-326；inselburgj,1970j.bacteriol.102(3):642-647；frazer1975,curr.topicsmicrobiol.immunol.69:1-10)。例如，图17b示出了核糖核酸酶缺乏的小细胞。为了进一步研究哪个基因敲除负责产生最接近产生小细胞的野生型p678-54菌株的小细胞，使用了lambdared同源重组系统。该lambdared重组工程化系统依赖于促进由与已经存在的基因组的同源性来引导的双链线性dna插入基因组中所需的三种不同蛋白质(beta、gam和exo)，如murphykc,2011methodsmol.biol.765:27-42中举例说明。所有这些蛋白质都是通过具有psc101复制起点且含有repa蛋白的质粒表达的，该repa蛋白仅允许在30℃下进行质粒复制。因此，一旦遗传操作完成，就通过在37℃下生长从细胞系中去除质粒。将插入基因组中的基因设计成与被敲除的靶向基因的5'和3'两端具有50个碱基对的同源性。该同源性分别对应于：minc的5'端(seqidno:1)和3'端(seqidno:2)的50个碱基对以便敲除minc，mind的5'端(seqidno:3)和3'端(seqidno:4)的50个碱基对以便敲除mind，或者mind的5'端(seqidno:3)和minc的3'端(seqidno:2)的50个碱基对以便敲除mincd。将含侧接了两个发夹环的启动子的氯霉素盒插入，以代替minc、mind或minc/d。发夹环包含在插入物中，以便不干扰基因组同一区域中其他基因的调控，因为它们具有终止转录的能力。将这些基因插入puc57骨架中，如图1-3所示。将该质粒用作模板，然后扩增出目标基因，以在将序列信息整合到宿主基因组中之前验证序列信息的准确性。所有扩增均在6个不同的退火温度下进行，以下组分和条件如表3和表4所示。表2展示了每个基因敲除扩增设计了两组不同的引物。所有引物均由服务提供商integrateddnatechnologies(idt)合成。表2.用于测试小基因敲除的引物组信息表3.pcr反应组分内容物组分体积(ul)最终浓度无核酸酶水17.5n/a模板dna(5ng/ul)15ng10um正向引物2.5500nm10um反向引物2.5500nmdmso1.53％phusionhf主混合物251x表4.pcr反应条件从a到f运行了六个系列扩增(表2)，以下每个退火温度在表5中示出。字母后的数字对应于pcr板上的位置，其中由于孔与孔之间的温度略微升高，因此每个孔之间具有间隙。(实例：孔号a2是以tm1运行的a系列扩增；a4—以tm2运行的a系列扩增；a6—以tm3运行的a系列扩增；a8—以tm4运行的a系列扩增；a10—以tm5运行的a系列扩增；a12—以tm6运行的a系列扩增；并且a1、a3、a5、a7、a9和a11是空孔)表5.pcr反应退火温度信息退火温度tm编号tm℃159.8260.8362.8465.1566.9667.6使用pcr和dna纯化试剂盒根据其标准方案对所有扩增物进行纯化。用足够的洗脱缓冲液洗脱所有dna，以提供足够的dna定量和质量测定。纯化后，相对于来自的1kbplus梯状物，在凝胶上运行所有扩增物，以确定pcr反应是否成功。通过可视化约1080个碱基对处的单个条带，在所有退火温度下运行的所有扩增是成功的。使用用1xtae和sybrsafe染色剂制备的1％琼脂糖(w/v)凝胶并结合invitrogensafeimager2.0实现所有dna可视化。使用一次性手术刀和dna凝胶提取试剂盒根据其标准方案从凝胶中提取这些条带。提取dna后，对dna进行定量，在送去etonbiosciences进行测序前测定其质量。用于扩增的引物(表2)用于测序测定。所有序列都以约99％的同一性返回，因此被认为适合插入基因组中。通过热激法将lambdared质粒转化到化学感受态核糖核酸酶缺乏的大肠埃希氏菌菌株中(参见实例；rahimzadeh等人2016,mol.boil.res.commun.5(4):257-261)。将其涂铺在选择性lb琼脂板上，并在第二天重新划线，以确保分离出单个菌落用于lambdared重组。为了将pcr产生的dna引入基因组中，使用了来自thermonscientifictm的transformaid细菌转化试剂盒，方案有所改进。使单个菌落在c培养基中在30℃下生长过夜。第二天，将1:100稀释的培养细胞接种到新鲜的c培养基中。使其在30℃下生长，直到达到约0.2的光密度(在600nm处测量)。用1mmiptg诱导该培养20分钟，以允许充分产生并积累对该程序至关重要的三种蛋白质(beta、gam和exo)。诱导后，对于每1.5ml接种的培养体积，将细胞在10,000rcf下沉淀1分钟，并且重悬于300ul冷t溶液中并孵育5分钟。然后将细胞再次沉淀，并重悬于120ul冷t溶液中5分钟。在最终的孵育步骤后，每次转化合并50ul细胞和50ngpcr扩增物，并在冰上孵育5分钟。从这里开始，将250ulsoc培养基添加到每次转化，并使其在37℃下生长90分钟。在过度生长90分钟后，将所有300ul转化物涂铺在氯霉素lb琼脂板(10ug/ml)上，并使转化细胞生长过夜。该方案使得几乎所有尝试的基因(每个系列3个)都成功转化。在laxcolmc4000(40x物镜，明场)上从每个成功的转化子中检查转化细胞的形态，并确定minc敲除(a和b)产生了与从中发现小细胞的对照p678-54菌株的形态最相似的小细胞。ht115菌株是用于核糖核酸酶缺乏的小细胞的菌株，并对其进行了遗传分析。另外，bl21和bl21-ai菌株用于蛋白酶缺乏小细胞，并对其进行了遗传分析。为了确认基因组中存在敲除，设计了引物来扩增出minc和/或mind的敲除的特定部分。通过使引物跨越插入物内部和外部的区域来确认插入物的5′和3′端。根据表7-9中的以下条件使用表6中的引物。表6.用于测试小基因敲除的引物组信息名称退火序列指定3′mincko_1ggccggataaaacttgtgct13′mincko_2agtcttcggaacatcatcgc25′mincko_1ccctttgcccgaagtaacaa35′mincko_2acggtgaaaacctggcctat4minc_check_4_1tcaatttaacggttgaacggtca5minc_check_4_2atgtcaaacacgccaatcga6mind_check_2_1ttatcctccgaacaagcgtttga7mind_check_2_2atggcacgcattattgttgttac8表7.pcr反应组分表8.pcr反应条件条件55个循环步骤温度(℃)时间(秒)预变性9830循环变性9810循环退火65.5°梯度30循环延伸7230最终延伸72600保持4n/a表9.pcr反应退火温度信息退火温度tm编号tm℃159.9261.3363.8466.6569.7667.6pcr扩增后，使用pcr和dna纯化试剂盒或带有zymo-spinic柱的dnaclean&concentratorkittm-5对所有产物进行纯化。然后在上述条件下在dna琼脂糖凝胶中运行纯化的pcr扩增物，并以相同的方式进行可视化。对于a和b系列，使用一对引物1-2和另一对引物3-4的反应分别主要产生了大小合适的单个条带。利用一组引物7-8的反应仅产生了对应于mind基因的单个条带。运行使用一组引物5-6的反应以检查minc的存在，并且该反应产生了条带分层，表明有非特异性pcr产物，预期所述非特异性pcr产物是在敲除minc后产生的。所有这些反应也都在野生型基因组上运行以进行比较。使用引物组1-2和3-4的反应产生了条带分层，预期所述条带分层来自具有minc和/或d敲除系统插入物的ht115菌株，而不是野生型，因为野生型基因组中不存在重组插入物。使用引物组5-6和7-8的反应分别产生了单个条带，表明有特异性pcr产物。使用凝胶提取试剂盒从凝胶中提取表明是特异性pcr产物的所有条带，并通过etonbiosciences分析dna序列。所有dna测序结果均显示出与敲除了minc和/或d的预期序列几乎同一(99％)的序列同源性。为了从亲代细胞中分离小细胞，将包含亲本细胞和小细胞的整个培养物在2,000rcf下离心10分钟以沉淀亲代细胞。然后收集上清液，并在10,000rcf下再次离心10分钟以沉淀小细胞。丢弃上清液，并将沉淀的小细胞根据其预期用途重悬于pbs或任何其他缓冲液中。实施例2.将融合蛋白表达盒转化到小细胞中用连接蛋白融合的cbm表达质粒转化遗传修饰的产生小细胞的细菌菌株。使用kpni和saci限制位点将cbm编码基因插入paida-1载体的aida-1表面表达盒中，从而允许cbm蛋白通过与跨膜自转运蛋白aida-1(参与扩散粘附的粘附素)融合来表达和展示，如图4b所示。利用最初设计的paida-1质粒(来自addgene,cambirdge,ma)进行这种构建，其中使用kpni和saci位点将cbm编码基因连接到aida-i自转运蛋白的信使结构域内，如图4a所示。将先前存在于paida-1质粒上的标签用于进一步分析cbm表达。连接完成后，6xhis标签和hrv3c位点位于cbm编码基因的n末端，而myc标签和tev位点位于cbm编码基因的c末端。6xhis标签是表面表达的融合cbm蛋白的5'端，用于进行钴固定金属亲和层析(imac)以及用来自genscript的thehis标签抗体[fitc]进行免疫荧光染色。paida-1载体具有氯霉素抗性基因，因此可以将重组paida-cbm表达载体转化到p567-48野生型菌株和ht115菌株中。为了诱导从ht115菌株产生小细胞，本公开通过用氯霉素抗性基因替换min基因座来使用minc、mind和/或minc/d敲除系统。在这种情况下，由于载体和产生小细胞的菌株中都存在相同的氯霉素抗性基因，因此不能用重组paida-1cbm表达载体来转化新的产生核糖核酸酶缺乏的小细胞的菌株(例如，minc、d或c/d-耗竭的ht115菌株)。为了表达aida-1cbm融合蛋白，在pgex-6p-1载体的骨架中构建了另一种重组aida-cbm表达质粒。从paida-1cbm表达载体中切出aida-1cbm表面表达盒，并将其克隆到pgex-6p-1载体中，如图5a所示。这样，由于pgex-6p-1aida-1-cbm载体具有氯霉素抗性基因，因此可以用氯霉素选择具有氯霉素抗性基因的新的核糖核酸酶缺乏的小细胞。对于名为brkautodisplay的细菌表面展示系统，基于自转运蛋白结构，将brka(博德特菌属血清抗性杀伤蛋白a)用于群集编码cbm的外源基因。为了构建重组brk-cbm表达载体，首先将brk自转运蛋白基因克隆到pgex-6p-1质粒中。使用bamhi和ecori限制位点，将cbm编码基因与brk自转运蛋白基因连接，如图6a所示。如图6b所示，将cbm编码基因插入brka自转运蛋白基因的信使结构域中。表达盒的前177个核苷酸对应于brk自转运蛋白的信号传导肽部分。这是融合蛋白的最n末端区域。这部分在易位过程中被裂解。紧接在信号传导肽的c末端的是用于纯化和染色的6xhis标签。该6xhis标签是信号肽被切掉后融合蛋白的表面表达的n末端。his标签的c末端与cbm编码基因融合，其后依次是myc标签和tev位点。然后，brka自转运蛋白的易位结构域正好位于tev位点之后。融合蛋白的该易位结构域是蛋白质的嵌入膜中的最c末端区域。另一种细菌表面展示蛋白即冰核蛋白k(inak)用于表达与锚定接头蛋白(基序)融合的重组cbm蛋白，所述cbm蛋白将并入的融合蛋白引导到小细胞表面上。像brkautodisplay一样，将编码inak跨膜蛋白的多核苷酸和cbm编码基因插入pgex-6p-1载体中，以产生细菌表面展示cbm蛋白，如图7a所示。对于所有inak-cbm融合体，cbm编码基因在c末端具有6xhis标签和myc标签，而tev位点与cbm编码基因的n末端融合。在该构建体中，编码inak的多核苷酸序列位于tev位点的n末端之前。由于inak蛋白的c末端在表面表达并且n末端端嵌入膜中，因此将cbm编码基因插入在inak编码多核苷酸序列之后，使得cbm可以在表面上展示，同时inak可以用作膜锚点。6xhis标签用于进行钴固定金属亲和层析(imac)以及用来自的thehis标签抗体[fitc]进行免疫荧光染色。myc标签可以用于免疫荧光染色。tev位点可以用于消化掉目标蛋白质(诸如cbm)以进行表面表达确认。在使用aida-1、brka和inak系统完成用于细菌表面展示融合蛋白的细菌表达载体的构建后，使用transformaid细菌转化试剂盒(thermoscientifictm)根据其标准方案将每个表达载体转化到核糖核酸酶缺乏的细胞系ht115菌株中。将cbm与aida-1、brka和inak的每个接头蛋白融合，以确保cbm的表面表达。可以将这些表达质粒转化到野生型p678-54菌株和通过本公开教导的方法产生的产生核糖核酸酶缺乏的小细胞的细菌菌株(例如，minc、d或c/d耗竭的ht115(de3)菌株)中。另外，通过本实施例中教导的方法(例如minc、d或c/d耗竭)将bl21和bl21-ai菌株用于蛋白酶缺乏小细胞。为了确认转化细菌菌株中存在质粒，使用genejetplasmidminiprep试剂盒对来自菌株的培养物进行小量制备，并将纯化的质粒用于dna测序分析。所有测序都确认了转化细菌菌株中存在表面表达cbm质粒。实施例3.cbm产生使转化菌株在5ml含有适当抗生素的培养物中生长过夜。第二天，在2xyt培养基加适当抗生素中进行1:100接种(将4.5ml过夜培养物接种在550ml2xyt培养基中)。2xyt培养基提供了有效产生蛋白质所需的过剩营养。一旦培养物达到指数生长期(od为约0.4)，就将其用1mmiptg诱导并在30℃下孵育过夜。第二天对培养物的cbm产生进行分析。在iptg诱导过夜后，将样品从孵育箱振荡器中取出并倒入三个250ml离心瓶中，每个瓶子中150ml样品。将瓶子在2,000rcf下离心以沉淀细菌细胞。将上清液转移到三个干净的250ml离心瓶。将上清液在10,000rcf下离心以沉淀小细胞。将小细胞重悬于pbs中。体积取决于包封变量的数量，每个变量3ml小细胞，并且另外3ml小细胞用于对照。对于每个微量离心管，测量的小细胞的od为约1.0。对于一个变量，在3个微量离心管中使用3ml小细胞(每个管1ml，od为1.0)。实施例4.cbm染色对培养的细胞进行染色以确定存在表面表达的cbm。针对产表达cbm小细胞的细菌bl21和/或bl21-ai菌株以及未用重组接头蛋白融合的cbm表达质粒转化的产小细胞的细菌p678-54菌株，对载玻片显色。将250ul聚-l-赖氨酸吸移到载玻片上保持15分钟。用500ulpbs洗涤三次后，将500ul正确的细胞类型吸移到载玻片上保持15分钟。用500ulpbs洗涤三次后，将750ul4％多聚甲醛吸移到载玻片上保持15分钟，以将细胞样品固定在载玻片上。用pbs洗涤三次后，将500ul.1％tritonx-100pbs添加到被分配为透化样品的载玻片上保持10分钟。对于未透化的样品，在此步骤中将500ulpbs添加到载玻片。用pbs洗涤三次后，将100ul2％牛血清白蛋白吸移到所有载玻片上作为封闭剂。用pbs洗涤三次后，将100ul1mg/mlthetmhis标签抗体[fitc](mab，小鼠抗体，与cbm融合蛋白的6x-his标签组分结合)吸移到载玻片上。然后，将载玻片与抗体在室温下在避光时孵育1小时。用pbs洗涤5-10次后，添加3-4滴含dapi的fluoroshield封固介质，然后将盖玻片封固到载玻片。然后可以用荧光显微术分析明场细胞与荧光探针之间的定位，该定位指示细胞的存在和表面表达的蛋白质的存在。在透化的和未透化的小细胞中，用his标签抗体染色在表达aida-1-cbm融合蛋白的大多数细胞群体中都显示出强信号(图8a和8b)。然而，his标签抗体在对照样品中几乎没有检测到信号(图8c和8d)。对照样品是不包含重组cbm表达质粒的野生型p678-54小细胞，因此不能检测到融合蛋白。因此，his标签染色结果表明用重组cbm表达质粒转化的小细胞表达了融合cbm，而对照细胞没有表达。未透化的小细胞(图8a)显示出表面表达的cbm蛋白，表明cbm通过aida-1接头蛋白固定在小细胞表面上。然而，根据将未透化的细胞与透化的细胞进行比较，重组cbm并非全部在表面表达(图8b)，表明内源cbm和/或重组融合cbm小细胞也可以在小细胞内表达。另一方面，可以检测到通过对转化小细胞内任何内源产生的cbm进行染色而产生的假阳性，如对照小细胞中所示(图8c和8d)。可以与蛋白酶缺乏的小细胞中的cbm表面表达类似地在核糖核酸酶缺乏的小细胞中检测到cbm表面表达，如图8所示。实施例5.细胞保留测试为了利用两个变量测试两周内的细胞保留；1)温度依赖性以及2)戊二醛处理。在一种条件下，将野生型小细胞在室温下用1％(v/v)戊二醛处理15天以及保持未处理。在另一种条件下，与未处理对照相比，将野生型小细胞在37℃下用三种不同浓度的戊二醛(5％、1％和0.25％(v/v))处理15天。如图9a所示，未处理小细胞的光密度比经处理小细胞的光密度下降更显著。然而，用1％(v/v)戊二醛处理的小细胞未降解和/或死亡。这表明戊二醛有助于防止小细胞15天内在室温下提前降解，从而确保活性成分长时间保留在小细胞内。另外，如图9b所示的未处理小细胞的光密度表明，在高温下，用戊二醛处理的小细胞保持其活力而不降解。用戊二醛处理的小细胞的稳定性在野生型小细胞、蛋白酶缺乏小细胞和核糖核酸酶缺乏的小细胞之间没有变化。因此，戊二醛的施加可以对各种类型的小细胞具有非常相似的保留效果，包括但不限于野生型小细胞、核糖核酸酶缺乏的小细胞和蛋白酶缺乏的小细胞。结果表明，可以通过形成如下制剂来控制生物活性化合物从小细胞释放：在该制剂中，一部分小细胞用戊二醛处理，而另一部分小细胞不用戊二醛处理。这将允许未处理小细胞快得多地分解并最初释放更多的活性物质，而经处理细胞将分解得更慢并随时间释放活性物质。实施例6.内部产生dsrna的小细胞用设计用于产生双链rna的l4440质粒转化如实施例1中所述的来源于ht115细胞系的小细胞。具有目标基因的l4440质粒在图21和图22中示出。使用transformaid细菌转化试剂盒(thermofisherscientific)进行转化。双链rna(dsrna)产生的合成通过t7细胞系内固有的t7启动系统来完成。ht115细胞系中存在的t7rna聚合酶识别l4440质粒上的双重t7启动位点。一个位点位于编码链上，另一个位点位于非编码链上编码位点下游约500个碱基对处。通过t7rna聚合酶从dna转录rna，并且由于dna的互补性质，这产生了单链rna的两条互补链，其中一部分由于链的互补性而形成双链rna。以与蛋白质产生相似的方式产生目标dsrna。将含有该质粒的ht115小细胞菌株的过夜培养物以1:100接种到一定体积的lb中，并使其在37℃下生长直至od600为约0.4。在达到该生长水平后，使用1mmiptg诱导t7的表达，从而诱导dsrna的表达约4小时。诱导4小时后，使用差速离心(在2000rcf下离心10分钟，然后在10000rcf下离心10分钟)将小细胞与亲本细胞分离。然后对小细胞进行分析。通过小细胞裂解、总rna提取(包括dna酶digest)和ribonucleaset1digest(rna酶t1)处理来分析dsrna含量。使用带有zymo-spiniiicg的direct-zolrnaminiprepplus(zymoresearch)和trizol试剂(thermofisherscientific)，通过一步纯化进行小细胞裂解和总rna提取。该试剂盒根据其标准方案运行，包括柱上dna酶处理，该处理被设计成去除与rna一起提取的任何dna。总rna提取后，通过nanodrop定量rna。用rna酶t1以1000u/ug的浓度消化100ug总rna15分钟，以便去除总rna中的所有单链rna。去除所有单链rna(ssrna)后，使用ez-10spincolumnrnacleanupandconcentration(biobasic)对消化液进行纯化。消化/纯化程序后，使用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳测试dsrna的存在。可以通过约500个碱基对处的条带来确认dsrna。图11显示了在小细胞内内部表达的dsrna的存在。泳道1中的箭头指出约500bp大小的条带。在泳道2中观察到表明存在dsrna的约500bp的条带，该泳道上样有100ug从含有dsrna质粒(l4440)的小细胞中捕获的rna。如上所述，用dna酶和rna酶t1消化提取的总rna以去除dsrna以外的任何核酸。泳道3和5是未消化的捕获总数。泳道4是阴性对照，其上样有100ug从不含质粒的小细胞捕获的rna，没有dsrna产生。实施例7.包封外源产生的dsrna的小细胞使用与实施例6相同的l4440质粒，以通过体外转录方法生成用于产生dsrna的pcr模板。表10.用于生成用于产生dsrna的pcr模板的引物组信息表11.pcr反应组分组分50ul反应最终浓度10um正向引物2.5ul0.5um10um反向引物2.5ul0.5umdmso1.5ul3％2xphusion主混合物25ul1x5ng/ul模板dna1ul2ng/ul无核酸酶水17.5uln/a表12.pcr反应条件步骤温度时间预变性98℃30秒55个循环98℃10秒45-72℃30秒72℃30秒最终延伸72℃10分钟保持4℃使用ez-10spincolumndnacleanupminiprepkit对pcr产物进行纯化，然后通过1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行分析。使用monarchdnagelextractionkit对约810个碱基对处存在的目标条带进行纯化。将该纯化的pcr产物用作模板，使用hiscribet7highyieldrnasynthesiskit根据其标准方案从该模板合成dsrna。包含双重t7启动系统的模板的性质允许产生dsrna，而不仅仅是ssrna。使反应在干燥空气孵育箱中在37℃下进行2小时，然后用ez-10spincolumnrnacleanupandconcentration(biobasic)进行纯化。纯化后，通过nanodrop定量体外转录产物(ivt产物)。简而言之，包封过程利用cacl2洗涤过程，以便将ivt产物跨膜转运到小细胞的细胞质中。在过夜产生小细胞并将它们与亲本细胞分离后，将它们以约1.5或更低的od600在冰上重悬于1.6mlcacl2溶液中20分钟。孵育20分钟后，将40ugivt产物添加到小细胞重悬溶液中，并使其在冰上孵育1小时。孵育后，将小细胞用1.6ml冷pbs洗涤三次，以便从细胞中去除任何未包封的ivt产物。洗涤后，对装载的小细胞进行分析。如实施例6所述裂解1.6ml洗涤的小细胞并提取总rna。使用zymocleangelrnarecoverykit结合nanodrop提取并定量该条带。此处提供了更详细的方案。使500mlb10:2细胞在2l烧瓶中生长过夜。生长后，将一半培养物沉淀并重悬于10ml1xpbs缓冲液中，以便确定用于cacl2重悬的预期细胞计数。在600nm处测得的平均光密度(od600)为0.356，对应于2.85x109个细胞。由于样品的体积小和所需的等分试样数，将其他沉淀物重悬于5mlcacl2溶液中。在冰上孵育20分钟后，在室温下将细胞在10,000rcf下沉淀1分钟。将实验细胞重悬于2ml0.1mcacl2中，而将对照细胞重悬于2ml1xpbs中。经过感受处理后，细胞的od600为1.075。这样就形成了10,200ul的实验细胞和对照细胞重复。将所有细胞悬浮液在冰上装载1582.203ng500bpdsrna(在ivt生成后未消化)持续一小时。装载后，将所有细胞在10,000rcf下离心1分钟，并用200ul1xpbs洗涤。洗涤后，将细胞在10,000rcf下离心1分钟，然后裂解并提取总rna。吸出上清液并丢弃。将细胞用trizol重悬，并使用注射器均质化。均质化后，将溶液在12,000rcf下离心1分钟，并提取上清液。对所有20个样品进行此操作，其中10个来自实验(e1-e10)，并且10个来自对照(c1-c10)。将上清液用600ul100％(v/v)etoh稀释，并添加到20个单独的direct-zolrnaminiprep离心柱中。根据制造商方案的其余部分结合并洗涤rna。没有进行柱上消化。将总rna捕获物用50ul洗脱并用4ul定量，剩下46ul。表13.实验样品和对照样品中的总rna浓度和量在图12中，分别将e9和e10(泳道2和3)与c9和c10(泳道5和6)设置在一起，以证明在上样到凝胶上用于成像目的之后未消化的总rna提取物。细胞中存在的绝大部分rna是ssrna。将rna酶t1处理至总rna提取物，以去除该绝大部分提取的ssrna，因此仅保留包封的dsrna。使用这些定量来计算用多少t1酶来消化。用于本实验的t1酶浓度为186,309.88u/ml。标准方案是在37℃下1000u/ug持续15分钟，但是为了保存酶，使用500u/ug持续30分钟。将样品e1-e8(泳道4)和c1-c8(泳道7)用rna酶t1消化，而将其他样品(e9、e10、c9和c10)保持未用rna酶处理，以在凝胶上可视化t1处理的dsrna样品和t1未处理的总rna样品之间的差异。消化后，将e1-e8纯化并合并，以确保对应于dsrna的任何条带都能够被可视化，假定了我们使用凝胶进行dsrna检测限度(约20ng/条带)。c1-c8用相同方式处理。根据biobasickit制造商方案进行纯化。将来自对照细胞和实验细胞的t1消化的总rna提取物的8个等分试样中的每一个用450ulrlt缓冲液稀释。合并实验消化的提取物(泳道4)，并合并对照提取物(泳道7)。将所得溶液用1800ul100％etoh(v/v)稀释。使两种溶液通过其相应的对照和实验rna离心柱。洗涤柱并在30ul无rna酶的水中洗脱。这使得实验浓度为70.2ng/ul，而对照浓度为101.5ng/ul。由于不会消化掉基因组，因此这些数量在很大程度上受到基因组存在的影响。将t1处理和纯化的实验rna样品上样到泳道4中，并将t1处理和纯化的对照rna样品上样到泳道7中。如图12所示，在泳道4中明显检测到位于500bp的条带，表明存在dsrna。使用zymoresearchrnagelextraction试剂盒根据制造商方案提取实验样品e1-e8(泳道4)的dsrna。如预期那样，在以相同方式处理的阴性对照等分试样中不存在条带(泳道7)。将泳道4的条带在8ul无rna酶的水中洗脱。通过nanodrop定量后，浓度为7.2ng/ul。为了得到172.8ng装载到实验小细胞中的dsrna，假设整个凝胶提取洗脱级分中的dsrna是均质的，将7.2ng/ul乘以8。由于从凝胶中提取了该条带，因此在8ul体积中产生了57.6ngdsrna。由于凝胶上孔的体积限制，在上述30ult1消化的总rna提取物中，只有10ul在凝胶上运行。还假设30ult1消化的总rna提取物的dsrna含量是均质的，因此将57.6ngdsrna乘以3，以得到172.8ng装载到实验小细胞中的总dsrna。根据定量数据和基于洗脱体积的调整，如果考虑到纯化过程中dsrna的损失，则将至少172.8ngdsrna装载和/或包封到小细胞中。实施例8.用戊二醛处理的dsrna保留为了证明dsrna随时间推移得以保留，以与实施例7中所述相同的方法装载小细胞。在本实施例中要添加的步骤是用浓度为0.25％(v/v)的戊二醛处理dsrna装载的小细胞。在4℃下孵育5天后，利用与实施例7中所述相同的方法分析小细胞。与实施例6中所述类似地产生小细胞并使其为感受态。经过感受处理后，细胞的od600为0.932。这样就形成了5,200ul的实验细胞重复。还产生了od600大约相同的200ul对照细胞。将所有细胞悬浮液在冰上装载1,500ng500bpdsrna(在ivt生成后未消化)一小时。装载后，将所有细胞在10,000rcf下离心1分钟，并用200ul1xpbs洗涤。洗涤后，将细胞在10,000rcf离心1分钟，然后在4℃下用戊二醛(0.25％)处理过夜。在分析之前，将该溶液在4℃下保持5天。在trizol提取之前，将细胞用200ulpbs洗涤三次。将细胞用trizol重悬，并使用注射器均质化。均质化后，将溶液在12,000rcf下离心1分钟，并提取上清液。对五个实验样品和一个对照进行此操作。取上清液并用600ul100％(v/v)etoh稀释，然后添加到6个单独的direct-zolrnaminiprep离心柱(五个用于实验，并且一个用于对照)。根据制造商方案的其余部分结合并洗涤rna。对该实验进行柱上dna消化。将总rna捕获物用100ul洗脱并用4ul定量，留下剩下的96ul。表14.实验样品和对照样品中的总rna浓度和量样品名称[rna]ng/ul洗脱体积(ul)存在的总rna(ug)e121.581002.071e258.941005.658e321.871002.099e46.231000.598e531.341003.008对照0.9881000.095细胞中存在的绝大部分rna是ssrna。将rna酶t1处理至总rna提取物，以去除该绝大部分提取的ssrna，因此仅保留包封的dsrna。使用这些定量来计算用多少t1酶来消化。用于本实验的t1酶浓度为199,150.12u/ml。将总rna提取物在37℃下用浓度为1000u/ug的t1消化15分钟。将样品e1-e5(泳道2)和对照(泳道3)用rna酶t1消化。消化后，将e1-e5纯化并合并，以确保对应于dsrna的任何条带都能够被可视化，假定了我们使用凝胶进行dsrna检测的限度(约20ng/条带)。对照用相同方式处理。根据biobasickit制造商方案进行纯化。将来自实验细胞的t1消化的总rna提取物的5个等分试样中每一种连同对照提取物一起用约900ulrlt缓冲液稀释。合并实验消化的提取物。根据试剂盒制造商方案，将所得实验溶液用约2500ul100％etoh(v/v)稀释，而将对照溶液用500ul100％etoh(v/v)稀释。使两种溶液通过其相应的对照和实验rna离心柱，然后用20ul无rna酶的水洗涤和洗脱。洗脱后，在凝胶上运行10ul。结果在图13中示出。如预期那样，在泳道3的对照中未检测到信号，因为大多数总rna提取物是ssrna，可通过rna酶t1处理去除。从对照细胞(ht115b10小细胞)中提取上样到泳道3中的rna。使用zymoresearchrnagelextraction试剂盒根据制造商方案从凝胶中提取目标500bp条带，表明存在dsrna。在以与对照相同的方式(泳道3)处理的对照等分试样中不存在条带。将泳道2中所示的条带在8ul无rna酶的水中洗脱。通过nanodrop定量后，浓度为6.23ng/ul。为了得到至少99.68ng装载到实验小细胞中的dsrna，假设整个凝胶提取洗脱级分在dsrna中是均质的，将6.23ng/ul乘以8。由于从凝胶中提取了该条带，因此这在8ul体积中产生了49.84ngdsrna。由于凝胶上孔的体积限制，在上述20ult1消化的总rna提取物中，只有10ul在凝胶上运行。还假设20ult1消化的总rna提取物的dsrna含量是均质的，因此将49.84ngdsrna乘以2，以在4℃下孵育5天后得到99.68ng装载到实验小细胞中的总dsrna。根据定量数据和基于洗脱体积的调整，孵育/包封5天后，至少99.68ngdsrna被封装在小细胞中。实施例9.rna酶a处理对dsrna的保护为了证明dsrna包封和保留，如实施例7和8中所述用ivt产物装载小细胞。与上述实施例不同，将总计80ugdsrna(ivt产物)添加到pbs溶液或cacl2溶液，而不是使用40ugdsrna。装载、孵育和洗涤dsrna后，将小细胞与浓度为50ug/ml的rna酶a在室温下孵育30分钟。通过沉淀小细胞并将其重悬于trizol试剂中终止rna酶a活性。如实施例7和8中所述进行rna提取、在1％琼脂糖凝胶上确认dsrna以及定量装载的dsrna。如图14所示，泳道2展示了用cacl2处理并装载有80ugivt产物但未暴露于rna酶a的小细胞的总rna提取物。泳道3展示了用pbs处理并装载有80ugivt产物且暴露于rna酶a(50ug/ml)的小细胞的总rna提取物。泳道4展示了用cacl2处理并装载有80ugivt产物且暴露于rna酶a的小细胞的总rna提取物。泳道5展示了暴露于rna酶a(50ug/ml)的80ugivt产物。泳道6展示了暴露于rna酶a的相同数量细胞(亲本和小细胞)的内部产生的dsrna。针对洗脱体积调整的定量数据使得泳道4中的条带为210ng，并且泳道6中的条带为631ng。使用zymoresearchrnagelextraction试剂盒根据制造商方案提取微弱可见的条带。将泳道4中的目标条带在14ul无rna酶的水中洗脱。通过nanodrop定量后，浓度为6.26ng/ul。将泳道6中的目标条带在14ul无rna酶的水中洗脱。通过nanodrop定量后，浓度为18.77ng/ul。为了得到210.44ng在泳道4中装载到实验小细胞中的dsrna，假设整个凝胶提取洗脱级分在dsrna中是均质的，将6.26ng/ul乘以14。由于从凝胶中提取了该条带，因此这在14ul体积中产生了87.64ngdsrna。由于凝胶上孔的体积限制，在上述24ult1消化的总rna提取物中，只有10ul在凝胶上运行。还假设24ult1消化的总rna提取物的dsrna含量是均质的，因此将87.64ngdsrna乘以2.4，以得到210.44ng装载到实验小细胞中并与rna酶a孵育的总dsrna。在泳道6中，以相同方式计算630.67ng大小合适的dsrna。将18.77ng/ul乘以14以说明整个洗脱级分，从而在14ul体积中产生了262.78ng。将其加倍以说明凝胶体积限制(乘以2.4)，以在rna酶a孵育后剩下630.67ngdsrna。这些结果表明，由小细胞包封的dsrna在存在rna酶的环境中得以保存和保护，并且可以以稳定且安全的方式递送到其靶标。实施例10.小细胞中的drb4表达为了改善dsrna包封和保留，1)在小细胞内部产生dsrna结合蛋白，然后装载ivt产物(drb4*+外部产生的dsrna)，2)在小细胞内部共表达dsrna结合蛋白连同dsrna(drb4*+内部产生的dsrna)，或者3)在小细胞内部共表达dsrna结合蛋白连同dsrna，然后装载ivt产物(drb4*+内部产生的dsrna，另外补充有外部产生的dsrna)。实施例7中所述的ivt(体外转录)产物是外部产生的dsrna。该蛋白可以是但不限于来自拟南芥的drb4*蛋白。该drb4*蛋白能够从细胞裂解物中识别和纯化dsrna，并且与dsrna非特异性结合。将ht115-b10(对照)和ht115-b10_pgex-6p-2_drb4_cal_t7(实验)的菌落挑选在5mllb中，并使其在37℃下生长过夜，以产生种子培养物。对于对照和实验培养物，用1.5ml种子培养物接种150ml体积的选择性2xyt培养基。使这些培养物生长直到od600(在600nm下测得的光学密度)为约0.4，然后用1mm异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)诱导。添加iptg后，使培养物在37℃下诱导过夜。第二天，通过在10,000rcf下离心10分钟来终止诱导，并在裂解之前冷冻沉淀物。利用注射器将实验细胞和对照细胞均质化，并用pbuffer(添加有mgcl2(2mm)和溶菌酶(10mg/ml)的edta阴性)裂解。每种细胞沉淀(约1/20培养体积)使用8ml裂解缓冲液，并在第二次冻融循环之前在37℃下孵育1小时。pbuffer是用于gst纯化的主要缓冲液，并且含有0.1mtris-hcl(ph8.0)、500mmnacl和5mmedta(除了由于mgcl2存在而裂解)。pbuffer是在使用前从其所有组分的浓缩液中新鲜制备的。解冻裂解物时，将1.2ml(1ml床体积)的谷胱甘肽琼脂糖4bgst-标记的蛋白纯化树脂(gehealthcare)添加到20ml色谱柱(bio-rad)，并使用10倍柱体积的pbuffer(edta阳性)进行平衡。通过在4℃下将裂解物(实验和对照)在10,000rcf下离心10分钟来澄清，然后转移到含有树脂的柱中。将澄清的裂解物在管旋转器中孵育1小时，以使目标蛋白质(drb4*)与树脂结合。在使蛋白质足够长时间与树脂结合之后，取每种裂解物的样品用于sds-page分析。使裂解物流过其相应的柱(实验和对照)，从而产生其相应的流过级分，所述流过级分已经保存用于sds-page分析。用5个级分洗涤树脂，每个级分5mlpbuffer(edta阳性)，同时使用nanodrop(1abs＝1mg/ml蛋白质)定量监测每个洗涤级分中存在的蛋白质浓度。当第五个洗涤级分的蛋白质浓度接近0时，停止洗涤，从而确保树脂已经被有效地洗涤掉非特异性结合的蛋白质。保存对照和实验树脂的洗涤级分3-5，用于sds-page分析。对于对照和实验树脂，以10个0.5ml洗脱缓冲液(50mmtris-hcl(ph8.0)和50mm还原型谷胱甘肽)级分从树脂中洗脱蛋白质。在使用前立即制备洗脱缓冲液。通过sds-page分析洗脱级分1和2中是否存在大约62kda预期大小的目标蛋白drb4*。以相同方式制备通过sds-page分析的所有级分。将19.5ul样品添加到7.5ulnupagetmlds样品缓冲液(thermofisherscientific)和3ul2-巯基乙醇。通过将10ulpagerulertmplusprestainedproteinladder(10至250kda)添加到7.5ul上述lds样品缓冲液和12.5ul水来制备梯状物。在上样之前，将这些溶液在70℃下孵育10分钟，以确保溶液中蛋白质的线性化。加热后，将15ul每个样品(包括梯状物)上样到1.5mm、15孔的nupagetm4-12％bis-tris蛋白凝胶(thermofisherscientific)上。使凝胶在mes运行缓冲液中在200伏特下运行35分钟，以确保适当的电泳分离。运行后，使用simplybluetmsafestain可视化凝胶内的蛋白质，以便使用微波方案对蛋白质进行凝胶检测。通过如下步骤在超纯水中洗涤凝胶：微波加热凝胶/水溶液直到几乎沸腾，然后是摇动步骤2分钟。在添加染色剂之前将其洗涤3次。将染色剂与凝胶一起微波加热直到几乎沸腾，然后与凝胶一起摇动10分钟。将凝胶在超纯水中脱色10分钟(不加热)，然后在20％(w/v)nacl溶液中进行最终脱色(5分钟)，以达到最大灵敏度(5ng/条带)。该结果在图19中示出。可以清楚地看到，在实验细胞系的洗脱级分1和2(分别为泳道13和15)中可以看到大约62kda预期重量的蛋白质，预期该蛋白质可以产生gst融合的drb4*蛋白。在来自对照细胞系的洗脱级分中没有检测到这种大小的条带，这些对照细胞系不应能够产生任何gst标记的蛋白质，而是细胞系天然的所有其他蛋白质。设计该对照是为了说明与drb4*蛋白无关的任何非特异性捕获的蛋白质。从该结果可以得出结论，已经成功产生和纯化了全长drb4*蛋白。实施例11.内部产生的dsrna和外部产生的dsrna的增强包封和保留将ht115-b10(野生型)、ht115-b10_pgex-6p-2_drb4_cal_t7(drb4*)和ht115-b10_l4440_celegans(秀丽隐杆线虫)的菌落挑选在5mllb中，并使其在37℃下生长过夜，以产生种子培养物。对于所有培养物，用4.5ml种子培养物接种450ml体积的选择性2xyt培养基。使这些培养物生长直到od600(在600nm下测得的光学密度)为约0.4，然后用1mm异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)诱导。添加iptg后，使培养物在37℃下诱导过夜。利用2000rcf离心10分钟将小细胞与亲本细胞分离。通过随后10000rcf离心10分钟从该上清液中收集小细胞。使用2个瓶子离心每种450ml培养物。在每种培养物的两个瓶中的一个中，将从最终离心得到的沉淀物重悬于3mlpbs中，以对cacl2悬浮液的od600定规格，从而使小细胞为感受态。这产生了以下od600。表15.小细胞的od600结果培养物od6001od6002od6003平均od600野生型0.9620.9460.9630.957drb4*1.2631.2551.2531.257秀丽隐杆线虫1.0871.0971.0971.094野生型：不携带一种或多种异源重组载体的小细胞drb4*：从ht115-b10_pgex-6p-2_drb4_cal_t7内部表达drb4蛋白的小细胞秀丽隐杆线虫：从ht115-b10_l4440_celegans内部表达靶向秀丽隐杆线虫ubc9的dsrna的小细胞用cacl2溶液处理小细胞以使小细胞为感受态。将cacl2处理的细胞重悬于3ml0.1mcacl2和15％甘油溶液中，而将pbs处理的细胞重悬于3mlpbs中。此时将细胞的od600测量为预加载od600。表16.cacl2和pbs处理后小细胞的od600结果每种溶液(a-f)均已加载30ugdsrna(10ug/ml)其中，并在冰上孵育1小时。孵育后，将每种溶液通过利用10000rcf离心1分钟并重悬于3mlpbs中来洗涤两次。洗涤后，将所有细胞沉淀并重悬于4.8mltri试剂中，以通过带有zymo-spiniiicg柱的direct-zolrnaminiprepplus(zymoresearch)试剂盒进行裂解和总rna提取。通过注射器将4.8ml于tri试剂中的悬浮液均质化，然后将细胞碎片在10000rcf下离心5分钟。将上清液添加到4.8ml100％(v/v)乙醇(etoh)。使每种tri试剂etoh溶液通过4个柱，以确保收集所有存在的rna。使用柱上dna酶i消化方案提供的试剂盒消化掉收集在柱中的dna。消化后，在洗脱之前按照制造商的指示洗涤柱。将每个柱用125ul无rna酶的水洗脱。洗脱后，将来自每种条件的四个级分合并，并经由nanodrop定量，然后使用来自米曲霉(aspergillusoryzae)的t1核糖核酸酶进行消化。使用4ul进行定量。定量结果以及t1(500u/ugrna)的对应体积如下。表17.定量结果以及t1(500u/ugrna)的对应体积样品[rna]ng/ul剩余体积(ul)rna(ng)体积t1(ul)a50.54962504513b117.14965808129c123.74966137031d168.14968338342e50.74962513113f143.04967094836将每种溶液在37℃下消化30分钟。消化后，利用带有zymo-spiniiicg柱的direct-zolrnaminiprepplus(zymoresearch)试剂盒纯化每种溶液。所用的tri试剂的体积为每1ul溶液体积3ul。添加等体积的乙醇，然后使每种溶液通过1个柱。不进行dna酶消化，并且使用制造商方案洗涤柱。洗涤后，将每个柱在三个级分中洗脱，每个级分各自为24ul无rna酶的水。将来自每个级分中的10ul与2xrna上样染料(newenglandbiolabs)合并后，使其在凝胶上运行。图20a和图20b显示了在存在drb4蛋白的情况下用cacl2溶液处理时，在包封内部产生的dsrna和外源产生的dsrna的小细胞中的dsrna包封和保留都有所增加。在图20a中，泳道2是从样品a(pbs溶液中与外部产生的dsrna一起孵育的ht115野生型小细胞)中提取的rna酶t1消化的rna。泳道3是从样品b(cacl2溶液中与外部产生的dsrna一起孵育的ht115野生型小细胞)中提取的rna酶t1消化的rna。如泳道3中明显可见，根据梯状物，在500bp标记处存在条带，表明成功用cacl2溶液包封。泳道4是泳道3的第二次洗脱。泳道5是从样品c(pbs溶液中包封内部产生的dsrna和外部产生的dsrna的ht115小细胞)中提取的rna酶t1-消化的rna。泳道6是从样品d(cacl2溶液中包封内部产生的dsrna和外部产生的dsrna的ht115小细胞)中提取的rna酶t1消化的rna。如泳道6中明显可见，cacl2溶液使得在500bp处存在强得多的条带，表明dsrna的产生和用dsrna的装载会使得更多dsrna被包封。泳道7是泳道6的第二次洗脱。泳道8是从样品e(pbs溶液中表达drb4蛋白并包封外部产生的dsrna的ht115小细胞)中提取的rna酶t1消化的rna。该drb4蛋白在装载外部产生的dsrna之前表达过夜。该蛋白质的存在以及在500bp标记处存在的所得条带表明，dsrna对ca2+阳离子的静电吸引可以在一定程度上被drb4蛋白的存在替换，以便将dsrna包封在小细胞内。泳道9是从样品f(cacl2溶液中表达drb4蛋白并包封外部产生的dsrna的ht115小细胞)中提取的rna酶t1消化的rna。将具有drb4蛋白的小细胞与外部产生的dsrna在cacl2溶液中孵育，这使得在500bp标记处存在强得多的条带。泳道10是泳道9的第二次洗脱。从凝胶上切下如图20a和20b的图解中所述的所有条带。由于不存在条带，所以未切除样品a级分。将其他条带在两个级分(每个级分6ul)中洗脱，以确保完全洗脱所有捕获的dsrna。通过nanodrop使用4ul定量每个洗脱级分，得到以下结果。表18.洗脱的rna浓度将低于3ng/ul的所有浓度作为噪声丢弃(突出显示)，并且将剩余的洗脱级分乘以6(6ul洗脱体积)，并且如果它们来自同一条带，则将它们加在一起。这就产生了捕获的条带总dsrna。将从t1消化物(1-3)产生的每个条带乘以2.4，以说明凝胶内10ul运行体积限制。然后将所有调整后的条带总和相加，得出以下结果。表19.捕获的总dsrna捕获的总rna(ng)细胞系/装载溶液b519.74野生型/cacl2c476.64秀丽隐杆线虫/pbsd1137.89秀丽隐杆线虫/cacl2e417.30drb4*/pbsf1115.96drb4*/cacl2如从数量和质量上都可以看出，通过cacl2处理装载dsrna使得在所有条件下包封的量都明显提高。包含dsrna结合蛋白(drb4*)也明显提高了包封的dsrna的量。实施例12.小细胞表面上的acc脱氨酶表达使用brka系统构建用于acc脱氨酶的细菌表面展示融合蛋白的表达载体完成后，使用与实施例2中所述相同的方案，用接头蛋白融合的acc脱氨酶表达质粒转化遗传修饰的小细胞-产生性细菌菌株。使用transformaid细菌转化试剂盒根据其标准方案进行到核糖核酸酶缺乏的细胞系(用于brk表面表达质粒的ht115菌株)中的转化。将acc脱氨酶与接头蛋白融合以确保表面表达。为了确认质粒的存在，对来自细胞系的培养物进行小量制备，并将质粒提交用于测序。对于表面表达acc脱氨酶质粒(genejetplasmidminiprepkit)，所有测序结果回到阳性。使转化菌株在5ml含有适当抗生素的培养物中生长过夜。第二天，在2xyt培养基加适当抗生素中进行1:100接种(将2.5ml过夜培养物接种在250ml2xyt培养基中)。2xyt培养基提供了有效蛋白质产生所必需的过剩营养。一旦培养物达到指数生长期(od为约0.4)，就将其用1mmiptg诱导并在30℃下孵育过夜。然后第二天对培养物的acc脱氨酶产生进行分析。对细胞进行染色，以确定存在表面表达的acc脱氨酶。针对表达acc脱氨酶的产生小细胞的细菌菌株和未用表达acc脱氨酶的质粒转化的产生小细胞的细菌菌株(作为对照样品)的透化和未透化样品，对载玻片显色。将250ul聚-l-赖氨酸吸移到载玻片上保持15分钟。用500ulpbs洗涤三次后，将500ul正确的细胞类型吸移到载玻片上保持15分钟。用500ulpbs洗涤三次后，将750ul4％多聚甲醛吸移到载玻片上保持15分钟，以将细胞样品固定至载玻片。用pbs洗涤三次后，将500ul.1％tritonx-100pbs添加到被分配为透化样品的载玻片保持10分钟。对于未透化的样品，在此步骤中将500ulpbs添加到载玻片，以保持样品在载玻片上水合。用pbs洗涤三次后，将100ul2％牛血清白蛋白吸移到所有载玻片上作为封闭剂。用pbs洗涤三次后，将100ul1mg/mlthetmhis标签抗体[fitc](mab，小鼠抗体，与acc脱氨酶融合蛋白的6x-his标签组分结合)吸移到载玻片上。然后将载玻片与抗体在室温避光孵育1小时。用pbs洗涤5-10次后，将3-4滴含dapi的fluoroshield封固介质施加于盖玻片上，以将盖玻片封固到载玻片上。然后可以进行荧光显微术以分析明场细胞与荧光探针之间的定位，该定位指示细胞的存在和表面表达的蛋白质的存在。在540nm处测量了1-氨基环丙烷-1-羧酸酯分解成α-酮丁酸酯。将表面表达acc脱氨酶的小细胞与必需的缓冲液一起在1-氨基环丙烷-1-羧酸酯溶液中孵育，然后在540nm处在适当的缓冲液中分析，并与标准曲线进行比较。α-酮丁酸酯的标准曲线由0.1至1微摩尔制成。将所有细胞都用thehis标签抗体[fitc](genscript)染色。实验小细胞是包含质粒pgex-6p-1_brkaccdeaminase的ht115b10小细胞，该质粒被设计为产生his标记的acc脱氨酶蛋白，该蛋白利用brk自转运蛋白融合蛋白转运到表面。在透化和未透化的实验小细胞中，用his标签抗体染色在表达brk-add脱氨酶蛋白的大多数细胞群体中都显示出强信号(图24a和24b)。然而，his标签抗体几乎没有从透化和未透化的实验小细胞中检测到信号(图24c和24d)。对照小细胞是不包含质粒的ht115b10小细胞，因此不能产生his标记的蛋白，所以不能检测到融合蛋白。因此，his标签染色结果表明从用重组cbm表达质粒转化的小细胞表达了融合acc脱氨酶，而对照细胞没有表达。未透化的小细胞(图24a)显示出表面表达的acc脱氨酶蛋白，表明acc脱氨酶通过brk接头蛋白定位在小细胞表面上。然而，根据将未透化的细胞与透化的细胞进行比较，重组acc脱氨酶蛋白并非全部在表面表达(图24b)，表明重组融合acc脱氨酶也可以在小细胞内表达。明显可见，对照细胞(图24c和24d)未产生来源于结合的his标签抗体的信号，而实验小细胞的确产生了表明his标记的acc脱氨酶表达的信号。还可以看到，未透化的实验细胞从结合的抗his标签抗体产生了信号，该信号表明brk自转运蛋白成功地将acc脱氨酶定位在小细胞表面上。实施例13.小细胞内的信息素包封为了测试信息素包封，将小细胞的菌落挑选在500mllb培养基和培养物中，并使其生长过夜，以产生种子培养物。将使用两步离心纯化过程从亲本细胞中纯化小细胞。在2000gs下的第一个离心步骤去除沉淀物中的大多数亲本细胞。然后将来自该第一步骤的上清液在10000gs下再次离心。然后将纯化小细胞的该第二沉淀物重悬于pbs(ph7.4)中，以使od600达到约2.0。将3-5ml细胞溶液等分至50ml管中。将等体积的信息素溶液引入实验样品的细胞溶液中。信息素溶液是包含25％乙醇和25％peg600(v/v％)的水溶液。将细胞溶液和信息素溶液混合后，溶液中细胞的有效浓度变为8x10^8个细胞/ml(od600为约1)，并且peg600和乙醇的有效浓度都变为12.5％(v/v％)。对于对照样品，将细胞溶液与等体积的pbs和25％peg600和25％乙醇(v/v％)混合，以达到与实验样品相同的溶剂有效浓度。然后将细胞和信息素溶液孵育2小时(rpm180，37℃)。然后，从孵育物中取出1ml溶液样品并离心(15000g，10分钟)以备分析。如果要用固定剂(例如戊二醛)处理细胞，则从孵育物中取出1ml溶液样品，并用有效浓度为1％的戊二醛处理。使戊二醛处理在室温下进行过夜；然后将细胞和信息素溶液离心以备分析。通过如下过程分析细胞：去除信息素溶液上清液并将沉淀物重悬于pbs中，以洗去未包封的任何残留游离信息素。然后，再次离心细胞(15000g，10分钟)，并将沉淀物重悬于850ul裂解溶液(来自genejetplasmidminiprep试剂盒)中。然后离心裂解的溶液(15000g，10分钟)，并使用分光光度计分析上清液在特定于信息素化合物的波长下的吸光度。从实验样品的信号中减去来自对照样品(未与信息素孵育但洗涤和裂解的细胞)的信号作为背景。这样确保了分析准确地表示溶液中信息素的浓度。气相色谱法是用于分析信息素包封的另一种方法。包封有信息素的小细胞与信息素将具有显著的质量比，这意味着包封的信息素的质量除以包封的信息素的质量和小细胞的质量将为至少1％。一旦优化配制和包封过程，就有望获得高载荷(+10％)的信息素。这种包封的信息素产品具有从几天到几个月不等的可调节释放动力学。缓慢释放动力学对行栽作物会很有用，因为信息素昂贵。较快释放动力学对特色作物会很有用。实施例14.小细胞到植物的侵入性递送为了测试包封生物活性化合物的小细胞到植物的侵入性递送，将小细胞菌落挑取在500mllb培养基内的产生小细胞的细菌菌株的菌落中，并使其生长过夜，以产生种子培养物。使用2步离心纯化过程从亲本细胞中纯化小细胞。第一个离心步骤在2000gs下去除沉淀物中的大多数亲本细胞；然后将来自该第一步骤的上清液在10000gs下再次离心。然后将纯化小细胞的该第二沉淀物重悬于pbs(ph7.4)中，以使od600达到约2.0。将3-5ml细胞溶液等分至50ml管中。将等体积的活性(例如荧光素)溶液引入实验样品的细胞溶液。然后将细胞和荧光素溶液孵育2小时(180rpm，37℃)。然后，从孵育物中取出1ml溶液样品并离心(15000g，10分钟)以备分析。如果要用固定剂(例如戊二醛)处理细胞，则从孵育物中取出1ml溶液样品，并用有效浓度为1％的戊二醛处理。使戊二醛处理在室温下进行过夜；然后将细胞和荧光素溶液离心以备分析。通过如下过程分析细胞：去除荧光素溶液上清液并将沉淀物重悬于pbs中，以洗去未包封的任何残荧光素。然后，再次离心细胞(15000g，10分钟)，并将沉淀物重悬于850ul裂解溶液(来自genejetplasmidminiprep试剂盒)中。然后离心裂解的溶液(15000g，10分钟)，并使用分光光度计分析上清液在特定于荧光素化合物的波长下的吸光度。从实验样品的信号中减去来自对照样品(未与信息素孵育但洗涤和裂解的细胞)的信号作为背景。这样可以确保分析准确地表示溶液中荧光素的浓度。一旦分析了包封的荧光素的量，就可以开始温室试验。将测试这些变量：a.在有包封的荧光素的情况下在mso中的表达cbm的小细胞b.在有包封的荧光素的情况下在mso中的未表达cbm的小细胞c.在有包封的荧光素的情况下表达cbm的小细胞d.在有包封的荧光素的情况下未表达cbm的小细胞e.单独的荧光素f.在mso中的单独的荧光素将一升每种变量施加于一株大豆植株上。在分析之前使溶液干燥。从每株大豆植株上收集叶片。洗涤收集的叶片，以消除任何表面残留物造成的任何错误。然后，将叶片压碎并置于溶剂中提取穿透的物质。然后根据所需的精度通过分光光度计或质谱仪分析溶剂。也可以对叶片内的样品进行成像以查看荧光素。实施例15.包封生物活性化合物的小细胞平台的应用如上述实施例所述，小细胞可以包封生物活性化合物。可以将包封生物活性化合物的小细胞配制成液体、干燥组合物、粉末、颗粒剂、种子包衣、浸液、沟内组合物或叶面喷雾剂。可以将配制的包封活性化合物的小细胞施加于植物、害虫、昆虫、蠕虫、臭虫、病原体、寄生虫、细菌、真菌或病毒中发现的靶细胞，但不能施加于哺乳动物细胞。将进行实验以将包封生物活性化合物的配制小细胞直接和/或间接施加于目标靶细胞上。首先，可以将本文所述的包封至少一种生物活性化合物的小细胞施加于作物，包括但不限于高粱、油菜、西红柿、草莓、大麦、大豆、棉花、水稻、玉米和小麦。其次，杀虫剂中的一种(例如螺虫乙酯)。另外，可以将小细胞施加于水生植物，诸如藻类、漂水植物、沉水植物和挺水植物。另外，可以将小细胞施加于害虫、昆虫、蠕虫、臭虫、病原体、寄生虫、细菌、真菌、病毒或水生动物(诸如鱼、贝类和甲壳动物)。实施例16.用于侵入性递送包封生物活性化合物的佐剂处理可以将本公开所述的包封活性化合物的小细胞与试剂(诸如表面活性剂、乳化剂、作物油浓缩液、穿透剂、盐或其组合)一起施加于靶细胞。靶细胞是在植物、害虫、昆虫、蠕虫、臭虫、病原体、寄生虫、细菌、真菌或病毒中而不是在哺乳动物细胞中发现的。将小细胞与试剂(诸如甲基化种子油、n,n-二甲基癸酰胺和/或n-癸基-n-甲基甲酰胺)一起直接和/或间接施加于目标靶细胞。实施例17.蛋白质纯化和活性小细胞准备好进行蛋白纯化以进行功能研究。bl21和bl21-ai菌株用于蛋白酶缺乏小细胞，并对其进行了遗传分析。另外，ht115菌株可以用于核糖核酸酶缺乏的小细胞，并对其进行了遗传分析。将细胞与裂解缓冲液在37℃下孵育至少六小时。然后将它们冷冻在-20℃。在纯化之前，它们再经历至少一个冻融循环。一旦裂解过程完成，就将细胞样品在10,000rcf下离心10分钟以沉淀细胞碎片。然后在蛋白纯化过程之前，通过puradisc25mm无菌whatman0.45um过滤器过滤上清液。在来回旋转混合器中将上清液在20mleconopacgravityflow柱中与约2ml已用4ml平衡缓冲液平衡过的hispurtmcobaltsuperflowagarose一起孵育30分钟。使上清液流过柱子。然后，将树脂用4ml洗涤缓冲液洗涤三次，然后分别用4个级分(每个级分2ml洗脱缓冲液)洗脱。将等体积的甘油添加到洗脱级分1和2中，并在50％甘油(v/v)和50mm磷酸钠缓冲溶液(ph7.2)中透析过夜。透析后，使用脂肪酶测定法检查洗脱级分中是否存在融合蛋白。相对于各种对照纯化，使用50mm4-硝基苯基-丁酸酯通过下述脂肪酶测定法阐明了每个洗脱级分中脂肪酶的存在。首先，将蛋白酶缺乏的b8和p678-54细胞系用作对照，因为它们不包含重组脂肪酶表达质粒。因此，它们没有重组蛋白，导致在脂肪酶测定中没有脂肪酶活性。虽然p678-54菌株是可商购获得的野生型小细胞-产生性菌株，b8小细胞菌株是由bl21(de3)菌株产生的，但是t7rna聚合酶活性连同minc/mind/mincd敲除效应一起被额外沉默。该b8菌株是没有t7rna聚合酶的蛋白酶缺乏产生小细胞的菌株，使其适合作为脂肪酶测定的阴性对照。将没有融合脂肪酶的蛋白酶缺乏的b8菌株用作蛋白酶缺乏对照。此外，还将brk-cbm和inak-cbm(cbm：纤维素结合结构域)融合蛋白用作另一种连接机制对照，该对照展示不能作用于脂肪酶测定给定底物的纯化的活性cbm融合酶。如图25a-25c所示，与蛋白酶缺乏对照、野生菌株对照和连接机制对照相比，aida-1脂肪酶、brk-脂肪酶和inak-脂肪酶分别产生了可测量的脂肪酶活性，从而证明了bl21(de3)来源的小细胞中产生了重组脂肪酶。实施例18.功能性脂肪酶活性分析为了进一步确认在如实施例17所述的蛋白质纯化洗脱级分和细胞表面中都存在功能性脂肪酶融合蛋白，使用脂肪酶底物4-硝基苯基-丁酸酯设计脂肪酶活性测定。使用sigma-aldrich脂蛋白脂肪酶(ec3.1.1.34)质量控制测定设计该测定，所述脂蛋白也可以用作与表面表达载剂蛋白融合的同一类型脂肪酶即三酰基甘油脂肪酶(ec3.1.1.3)的底物，所述三酰基甘油脂肪酶使用来自猪胰腺以及sigmaaldrich在线网页上的“脂蛋白脂肪酶的酶促测定方案(enzymaticassayoflipoproteinlipaseprotocol)”中所述的ii型脂肪酶。使用比尔定律(a＝εlc)和消光系数0.0148(um-1*cm-1)，使用连续分光光度法测定在400nm下进行脂肪酶的酶促反应的动力学分析。根据已知的孔体积(200ul)和孔的表面积(0.32cm2)计算出路径长度为0.625cm。对于酶促测定，需要反应缓冲液(ph7.2的100mm磷酸钠缓冲溶液、0.5％(v/v)triton-x100、150mm氯化钠)、1xpbs中的酶/细胞溶液以及底物溶液(其是不同浓度的在乙腈中的4-硝基苯基-丁酸酯)。将148ul反应缓冲液、50ul酶/细胞溶液和2ul底物溶液加载到每个孔中，然后立即开始在37℃下连续5分钟进行分光光度速率测定。然后，通过计算浓度增加(比尔定律)相对于反应进行时间(以秒为单位)的线斜率来计算速率。通过根据表10改变底物浓度计算出的速率的michaelis-menten拟合来确定活性。使用graphpadprismmichaelis-menten拟合参数计算vmax和km。图26a-c显示了aida-脂肪酶(图26a和表21)、brk-脂肪酶(图26b和表22)和inak-脂肪酶(图26c和表23)分别与4-硝基苯基-丁酸酯底物的酶促反应。表20.用于计算酶促反应速率的底物浓度原液浓度(mm)孔中浓度(mm)002.50.02550.057.50.075100.1150.15200.2250.25300.3350.35400.4450.45500.5600.6700.7800.85005表21.paida-脂肪酶的酶促反应速率paida-脂肪酶实验平均速率(um/s)michaelis-menten细胞/孔：99,946,667最佳拟合值vmax0.08174km0.1803标准误差vmax0.008508km0.0591295％ci(轮廓似然性)vmax0.06857至0.09734km0.104至0.2922拟合优度自由度49r方0.6414绝对平方和0.01626sy.x0.01822约束条件kmkm>0表22.brk-脂肪酶的酶促反应速率brk-脂肪酶brk-脂肪酶平均速率(um/s)michaelis-menten细胞/孔：17,706,667最佳拟合值vmax0.04453km0.2207标准误差vmax0.003487km0.0502595％ci(轮廓似然性)vmax0.03894至0.05088km0.1503至0.3134拟合优度自由度49r方0.7838绝对平方和0.002289sy.x0.006834约束条件kmkm>0表23.inak-脂肪酶的酶促反应速率inak-脂肪酶实验平均速率(um/s)michaelis-menten细胞/孔：107,840,000最佳拟合值vmax0.06354km0.3015标准误差vmax0.009548km0.110995％ci(轮廓似然性)vmax0.04894至0.08074km0.1649至0.5114拟合优度自由度49r方0.6375绝对平方和0.009709sy.x0.01539约束条件kmkm>0尽管已经通过图示和实施例的方式相当详细地描述了前述公开内容，目的是为了清楚地理解，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离在所附权利要求中描述的本公开的精神和范围的情况下可进行某些改变和修改。因此，该描述不应被解释为限制本公开的范围。表24.序列文件中的序列表本公开的编号实施方案尽管有所附权利要求书，但是本公开提出了以下编号实施方案：农业制剂1.一种农业制剂，包含：a.完整小细胞，所述完整小细胞在所述小细胞内包含至少一种生物活性化合物，其中所述生物活性化合物选自由以下各项组成的组i.核酸，其中所述核酸靶向靶标的细胞内编码多肽的转录物，ii.生物防治化合物，其中所述生物防治化合物对害虫具有活性，以及iii.生物刺激剂化合物，其中所述生物刺激剂化合物刺激植物的生长或健康，其中所述靶标是植物或害虫。2.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞与至少一种农业上适合的添加剂或佐剂一起施加。3.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞来源于原核细胞、革兰氏阴性细菌细胞、革兰氏阳性细菌细胞或真核细胞。4.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞来源于内生菌或植物病原细菌。5.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞是蛋白酶缺乏的或是核糖核酸酶缺乏的。6.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞是蛋白酶缺乏的。7.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞是核糖核酸酶缺乏的。8.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞是蛋白酶缺乏的和是核糖核酸酶缺乏的。9.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞是蛋白酶缺乏的，并且其中所述生物活性化合物是蛋白质。10.前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞是核糖核酸酶缺乏的，并且其中所述生物活性化合物是核酸。11.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述生物活性化合物是所述核酸，所述核酸选自由以下各项组成的组：反义核酸、双链rna(dsrna)、短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、核酶、适体及其组合。12.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述生物活性化合物对除所述靶标的细胞以外的细胞是惰性的。13.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述生物防治化合物是肽、多肽、发酵产物、代谢物、抗体、化学信息素或微量营养素。14.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述生物刺激剂化合物是肽、多肽、发酵产物、代谢物、抗体、化学信息素或微量营养素。15.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述靶标包括植物、昆虫、蠕虫、细菌、真菌、病毒和水生动物，其中所述水生动物包括鱼、贝类和甲壳动物。16.如前述条款中任一项所述的农业制剂，还在所述小细胞内包含多肽，其中所述多肽在所述小细胞内表达，其中所述多肽与所述核酸结合。17.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述多肽是dsrna结合蛋白，并且其中所述dsrna结合蛋白增加负载并增强dsrna的稳定性。18.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞还包含至少一种融合蛋白，并且其中所述融合蛋白在所述小细胞的表面上表达。19.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分，并且其中所述靶细胞粘附部分包含由纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域组成的碳水化合物结合模块。20.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞用溶剂、试剂、固定剂、防腐剂或交联剂处理以具有更好的溶解性、增加的稳定性或增强的完整性。21.如前述条款中任一项所述的农业制剂，其中所述小细胞表现出所述生物活性化合物的控制释放速率，其中所述释放可以是稳定释放或初始突释然后稳定释放。22.一种递送至少一种生物活性化合物的方法，包括：将前述条款中任一项的所述小细胞施加于靶细胞。23.如条款22所述的方法，其中将所述小细胞施加于靶标并通过内吞作用将其递送到所述靶标的细胞中。24.如条款22-23中任一项所述的方法，还包括：将所述小细胞与试剂一起施加于所述靶细胞，其中所述试剂是用于改善所述小细胞穿透到所述靶细胞中的佐剂。25.如条款22-24中任一项所述的方法，其中所述试剂是表面活性剂、乳化剂、作物油浓缩液、穿透剂、盐或其组合。递送方法1.一种递送至少一种生物活性化合物的方法，包括：将农业上适合的基于无核细胞的平台施加于靶细胞，其中所述农业上适合的基于无核细胞的平台包含：a.来源于细菌亲代细胞的完整无核细胞，所述完整无核细胞在其中包含所述生物活性化合物，其中所述生物活性化合物选自由以下各项组成的组i.核酸，其中所述核酸靶向所述靶细胞内编码多肽的转录物，ii.生物防治化合物，以及iii.生物刺激剂化合物。2.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述生物活性化合物是所述核酸，所述核酸选自由以下各项组成的组：反义核酸、双链rna(dsrna)、短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、核酶、适体及其组合。3.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述生物防治化合物是肽、多肽、发酵产物、代谢物、抗体、化学信息素或微量营养素。4.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述生物刺激剂化合物是肽、多肽、发酵产物、代谢物、抗体、化学信息素或微量营养素。5.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述靶细胞包括植物细胞、昆虫细胞、蠕虫细胞、细菌细胞、真菌细胞、病毒和水生动物的细胞，其中所述水生动物包括鱼、贝类和甲壳动物。6.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含至少一种融合蛋白，并且其中所述融合蛋白在所述小细胞的表面上表达。7.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分，并且其中所述靶细胞粘附部分包含由纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域组成的碳水化合物结合模块。基于核糖核酸酶缺乏的细胞的平台1.一种用于包封和递送至少一种生物活性化合物的工业上适合的基于无核细胞的平台，包含：a.来源于核糖核酸酶缺乏的亲代细胞的完整无核细胞，所述细胞在所述细胞内包含至少一种生物活性化合物，其中所述生物活性化合物是核酸，其中所述核酸靶向靶细胞内编码多肽的转录物，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。2.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，还包含：b.至少一种生物学上可接受的载剂。3.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种生物活性化合物选自由以下各项组成的组：反义核酸、双链rna(dsrna)、短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、核酶、适体及其组合。4.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种生物活性化合物与所述转录物特异性结合并抑制所述转录物翻译。5.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种生物活性化合物对除所述靶细胞以外的细胞是惰性的。6.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述核酸是反义核酸。7.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述核酸是dsrna。8.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述核酸是shrna。9.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述核酸是sirna。10.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述核酸是mirna。11.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述核酸是核酶。12.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述核酸是适体。13.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞来源于原核细胞。14.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是细菌来源的小细胞。15.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由革兰氏阴性细菌属产生的。16.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由选自由以下各项组成的组的细菌属产生的：埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、假单胞菌属和土壤杆菌属。17.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由选自由以下各项组成的组的细菌种产生的：大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺菌和铜绿假单胞菌。18.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由缺乏核糖核酸酶的亲代细菌细胞产生的细菌来源的小细胞。19.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由缺乏核糖核酸酶的大肠埃希氏菌亲代细菌细胞产生的细菌来源的小细胞。20.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由缺乏核糖核酸酶的ht115大肠埃希氏菌亲代细菌细胞产生的细菌来源的小细胞。21.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由革兰氏阳性细菌属产生的。22.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由选自由以下各项组成的组的细菌属产生的：芽孢杆菌属、棒状杆菌属和乳杆菌属。23.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由选自由以下各项组成的组的细菌种产生的：枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和嗜酸乳杆菌。24.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞来源于真核细胞。25.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述靶细胞包括植物细胞、昆虫细胞、蠕虫细胞、细菌细胞、真菌细胞、病毒和水生动物的细胞，其中所述水生动物包括鱼、贝类和甲壳动物。26.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述植物细胞存在于作物中，其中所述作物是玉米、小麦、大豆或棉花。27.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述植物细胞存在于选自由以下各项组成的组的水生植物中：藻类、漂水植物、沉水植物、挺水植物和海藻。28.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，还在所述细胞内包含多肽，其中所述多肽在所述细胞内表达，并且其中所述多肽与所述细胞内的所述至少一种生物活性化合物结合。29.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种生物活性化合物是dsrna，并且其中所述多肽是dsrna结合蛋白。30.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述dsrna结合蛋白增加所述dsrna的稳定性并保护所述dsrna免于降解。31.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，还包含至少一种融合蛋白，其中所述融合蛋白在所述完整无核细胞的表面上表达。32.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分。33.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分，其中所述表面表达部分包含跨膜结构域并且选自由以下各项组成的组：冰核蛋白(inp)、brka(博德特菌属血清抗性杀伤蛋白)和aida(涉及扩散粘附的粘附素)。34.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分，其中所述表面表达部分包含输出细菌蛋白并且选自由以下各项组成的组：lamb(λ受体)、oprf(铜绿假单胞菌外膜蛋白f)、ompa(外膜蛋白a)、lpp(脂蛋白)、male(麦芽糖结合蛋白)、phoa(碱性磷酸酶)、bla(tem-1b-内酰胺酶)、f1或m13主要衣壳(来源于基因viii)和f1或m13次要衣壳(基因iii)。35.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分，其中所述靶细胞粘附部分包含碳水化合物结合模块。36.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分，其中所述靶细胞粘附部分包含选自由以下各项组成的组的碳水化合物结合模块：纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域。37.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞在其表面上表达增加与所述靶细胞的表面的粘附的多肽。38.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞在其表面上表达靶标粘附多肽。39.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的碳水化合物结合模块。40.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源碳水化合物结合模块。41.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的纤维素结合结构域。42.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源纤维素结合结构域。43.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的几丁质结合结构域。44.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源几丁质结合结构域。45.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞用溶剂处理。46.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述溶剂是cacl2溶液、乙醇、dmso、聚乙二醇或甘油。47.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞除了用所述溶剂处理外，还用试剂处理。48.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述试剂是固定剂、防腐剂或交联剂。49.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述交联剂是戊二醛、甲醛、京尼平或表没食子儿茶素没食子酸酯。50.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述溶剂增加所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的溶解度。51.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述溶剂增加所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的溶解度，并且其中所述溶剂增加所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的扩散。52.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述试剂将所述至少一种生物活性化合物捕获在所述无核细胞的膜内。53.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述试剂将所述至少一种生物活性化合物捕获在所述无核细胞的膜内，并且其中所述试剂使所述至少一种生物活性化合物与所述无核细胞交联，这改善了所述无核细胞的完整性和稳定性。54.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述试剂增强所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的负载能力。55.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述试剂增强所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的负载能力，并且其中所述试剂控制所述至少一种生物活性化合物从所述无核细胞的释放速率。56.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表现出所述至少一种生物活性化合物的控制释放速率。57.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表现出所述至少一种生物活性化合物的控制释放速率，并且其中所述至少一种生物活性化合物以稳定速率释放。58.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表现出初始突释所述至少一种生物活性化合物。59.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表现出初始突释所述至少一种生物活性化合物，所述突释包括释放至少约40％的所述至少一种生物活性化合物。60.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述无核细胞表现出所述至少一种生物活性化合物的控制释放速率，并且其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的所述至少一种生物活性化合物。61.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放小于15％的所述至少一种生物活性化合物。62.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放小于10％的所述至少一种生物活性化合物。63.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放约5％的所述至少一种生物活性化合物。64.一种递送至少一种生物活性化合物的方法，包括：将前述条款中任一项的所述无核细胞施加于靶细胞，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。65.如条款64所述的方法，其中通过内吞作用将施加于所述靶细胞的所述基于无核细胞的平台递送到所述靶细胞中。66.如条款64和65中任一项所述的方法，还包括：将所述无核细胞与试剂一起施加于所述靶细胞。67.如条款64-66中任一项所述的方法，其中所述试剂是用于改善所述无核细胞穿透到所述靶细胞中的佐剂。68.如条款64-67中任一项所述的方法，其中所述试剂是表面活性剂、乳化剂、作物油浓缩液、穿透剂、盐或其组合。69.如条款64-68中任一项所述的方法，其中所述试剂是甲基化种子油。70.如条款64-68中任一项所述的方法，其中所述试剂是n,n-二甲基癸酰胺。71.如条款64-68中任一项所述的方法，其中所述试剂是n-癸基-n-甲基甲酰胺。基于核糖核酸酶缺乏和/或蛋白酶缺乏细胞的平台1.一种用于包封至少一种生物活性化合物并将其递送到靶细胞的工业上适合的基于无核细胞的平台，包含：a.来源于核糖核酸酶缺乏和/或蛋白酶缺乏的亲代细胞的完整无核细胞，所述细胞在所述细胞内包含所述生物活性化合物，其中所述生物活性化合物是生物防治剂或生物刺激剂，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。2.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，还包含：b.至少一种生物学上可接受的载剂。3.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述生物防治剂选自由以下各项组成的组：核酸、多肽、化学信息素、代谢物和微量营养素。4.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述生物刺激剂选自由以下各项组成的组：核酸、多肽、化学信息素、代谢物和微量营养素。来源于细菌细胞的平台1.一种用于包封至少一种生物活性化合物并将其递送到靶细胞的工业上适合的基于无核细胞的平台，包含：a.来源于细菌亲本细胞的完整无核细菌小细胞，所述小细胞在所述小细胞内包含所述生物活性化合物，其中所述生物活性化合物是生物防治剂，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。2.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，还包含：b.至少一种生物学上可接受的载剂。3.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述生物防治剂是信息素。4.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述生物防治剂是代谢物。5.一种用于包封至少一种生物活性化合物并将其递送到靶细胞的工业上适合的基于无核细胞的平台，包含：a.来源于细菌亲本细胞的完整无核细菌小细胞，所述小细胞在所述小细胞内包含所述生物活性化合物，其中所述生物活性化合物是生物刺激剂，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。6.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，还包含：b.至少一种生物学上可接受的载剂。7.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述生物刺激剂是信息素。8.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述生物刺激剂是代谢物。使用来源于细菌细胞的小细胞递送生物活性化合物的方法1.一种递送至少一种生物活性化合物的方法，包括：将工业上适合的基于无核细胞的平台施加于靶细胞，其中所述工业上适合的基于无核细胞的平台包含：a.来源于细菌亲代细胞的完整无核细胞，所述完整无核细胞在其中包含所述生物活性化合物，其中所述生物活性化合物是生物防治剂或生物刺激剂，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。2.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞还包含：b.至少一种生物学上可接受的载剂。3.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述生物防治剂选自由以下各项组成的组：化学信息素、代谢物和微量营养素。4.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述生物刺激剂选自由以下各项组成的组：化学信息素、代谢物和微量营养素。5.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述代谢物是发酵产物。6.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述代谢物是选自由以下各项组成的组的激素：生长素、脱落酸、细胞分裂素、乙烯和赤霉素。7.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述化学信息素包括信息素、利己素、利它素和互利素。8.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述信息素是2,3-丁二醇。9.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述信息素是(z)-9-十六烷烯醛、(z)-ii-十六烷烯醛、(z)-13-十八烷烯醛或其组合。10.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述微量营养素是维生素。11.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述微量营养素选自硼(b)、氯(cl)、铜(cu)、铁(fe)、锰(mn)、钼(mo)和锌(zn)。12.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述靶细胞包括植物细胞、昆虫细胞、蠕虫细胞、细菌细胞、真菌细胞、病毒和水生动物的细胞，其中所述水生动物包括鱼、贝类和甲壳动物。13.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述植物细胞存在于作物中，其中所述作物是玉米、小麦、大豆或棉花。14.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述植物细胞存在于选自由以下各项组成的组的水生植物中：藻类、漂水植物、沉水植物、挺水植物和海藻。15.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞还包含至少一种融合蛋白，其中所述融合蛋白在所述完整无核细胞的表面上表达。16.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分。17.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分,其中所述表面表达部分包含跨膜结构域并且选自由以下各项组成的组：冰核蛋白(inp)、brka(博德特菌属血清抗性杀伤蛋白)和aida(涉及扩散粘附的粘附素)。18.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分,其中所述表面表达部分包含输出细菌蛋白并且选自由以下各项组成的组：lamb(λ受体)、oprf(铜绿假单胞菌外膜蛋白f)、ompa(外膜蛋白a)、lpp(脂蛋白)、male(麦芽糖结合蛋白)、phoa(碱性磷酸酶)、bla(tem-1b-内酰胺酶)、f1或m13主要衣壳(来源于基因viii)和f1或m13次要衣壳(基因iii)。19.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分,其中所述靶细胞粘附部分包含碳水化合物结合模块。20.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分,其中所述靶细胞粘附部分包含选自由以下各项组成的组的碳水化合物结合模块：纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域。21.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞在其表面上表达增加与所述靶细胞的表面的粘附的多肽。22.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞在其表面上表达靶标粘附多肽。23.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的碳水化合物结合模块。24.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源碳水化合物结合模块。25.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的纤维素结合结构域。26.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源纤维素结合结构域。27.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的几丁质结合结构域。28.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源几丁质结合结构域。29.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞用溶剂处理。30.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述溶剂是乙醇、dmso、聚乙二醇或甘油。31.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞除了用所述溶剂处理外，还用试剂处理。32.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是固定剂、防腐剂或交联剂。33.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述交联剂是戊二醛、甲醛、京尼平或表没食子儿茶素没食子酸酯。34.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述溶剂增加所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的溶解度。35.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述溶剂增加所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的溶解度，并且其中所述溶剂增加所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的扩散。36.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂将所述至少一种生物活性化合物捕获在所述无核细胞的膜内。37.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂将所述至少一种生物活性化合物捕获在所述无核细胞的膜内，并且其中所述试剂使所述至少一种生物活性化合物与所述无核细胞交联，这改善了所述无核细胞的完整性和稳定性。38.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂增强所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的负载能力。39.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂增强所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的负载能力，并且其中所述试剂控制所述至少一种生物活性化合物从所述无核细胞的释放速率。40.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞表现出所述至少一种生物活性化合物的控制释放速率。41.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞表现出所述至少一种生物活性化合物的控制释放速率，并且其中所述至少一种生物活性化合物以稳定速率释放。42.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞表现出初始突释所述至少一种生物活性化合物。43.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞表现出初始突释所述至少一种生物活性化合物，所述突释包括释放至少约40％的所述至少一种生物活性化合物。44.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞表现出所述至少一种生物活性化合物的控制释放速率，并且其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的所述至少一种生物活性化合物。45.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放小于15％的所述至少一种生物活性化合物。46.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放小于10％的所述至少一种生物活性化合物。47.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放约5％的所述至少一种生物活性化合物。48.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞降解部分。49.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞降解部分，其中所述靶细胞降解部分包含角质酶和纤维素酶。50.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞在其表面表达促进所述无核细胞穿透植物角质层进入所述靶细胞的角质酶。51.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源角质酶。52.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞在其表面上表达分解靶细胞壁并促进所述无核细胞穿透到所述靶细胞中的纤维素酶。53.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源纤维素酶。54.如前述条款中任一项所述的方法，还包括：将所述无核细胞与试剂一起施加于所述靶细胞。55.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是用于改善所述无核细胞穿透到所述靶细胞中的佐剂。56.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是表面活性剂、乳化剂、作物油浓缩液、穿透剂、盐或其组合。57.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是甲基化种子油。58.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是n,n-二甲基癸酰胺。59.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是n-癸基-n-甲基甲酰胺。使用蛋白酶缺乏的小细胞递送生物活性化合物的方法1.一种递送至少一种生物活性化合物的方法，包括：将工业上适合的基于无核细胞的平台施加于靶细胞，其中所述工业上适合的基于无核细胞的平台包含：a.来源于蛋白酶缺乏的亲代细胞的完整无核细胞，所述细胞在所述细胞内包含所述生物活性化合物，其中所述生物活性化合物是多肽，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。2.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞还包含：b.至少一种生物学上可接受的载剂。3.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述多肽是选自由以下各项组成的组的酶：acc脱氨酶、几丁质酶、纤维素酶、植酸酶、几丁质酶、蛋白酶、磷酸酶、核酸酶、脂肪酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、肽酶、过氧化物酶、木质素酶、果胶酶、半纤维素酶和角蛋白酶。4.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述acc脱氨酶调节植物生长的乙烯水平。5.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述多肽是融合蛋白。6.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述多肽是蛋白质毒素。7.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述多肽是亲代细胞外源的抗体或抗体衍生物。8.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述靶细胞包括植物细胞、昆虫细胞、蠕虫细胞、细菌细胞、真菌细胞、病毒和水生动物的细胞，其中所述水生动物包括鱼、贝类和甲壳动物。9.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述植物细胞存在于作物中。10.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述植物细胞存在于选自由以下各项组成的组的水生植物中：藻类、漂水植物、沉水植物、挺水植物和海藻。11.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞刺激部分。12.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞刺激部分，其中所述表面表达部分包含跨膜结构域并且选自由以下各项组成的组：冰核蛋白(inp)、brka(博德特菌属血清抗性杀伤蛋白)和aida(涉及扩散粘附的粘附素)。13.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞刺激部分，其中所述表面表达部分包含输出细菌蛋白并且选自由以下各项组成的组：lamb(λ受体)、oprf(铜绿假单胞菌外膜蛋白f)、ompa(外膜蛋白a)、lpp(脂蛋白)、male(麦芽糖结合蛋白)、phoa(碱性磷酸酶)、bla(tem-1b-内酰胺酶)、f1或m13主要衣壳(来源于基因viii)和f1或m13次要衣壳(基因iii)。14.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞刺激部分，其中所述靶细胞刺激部分包含acc脱氨酶。15.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞在其表面上表达调节植物乙烯水平以促进植物生长并增加靶植物对生物和非生物胁迫的抗性的acc脱氨酶。16.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源acc脱氨酶。17.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞还包含至少一种融合蛋白，其中所述融合蛋白在所述完整无核细胞的表面上表达。18.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分。19.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分。其中所述表面表达部分包含跨膜结构域并且选自由以下各项组成的组：冰核蛋白(inp)、brka(博德特菌属血清抗性杀伤蛋白)和aida(涉及扩散粘附的粘附素)。20.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分,其中所述表面表达部分包含输出细菌蛋白并且选自由以下各项组成的组：lamb(λ受体)、oprf(铜绿假单胞菌外膜蛋白f)、ompa(外膜蛋白a)、lpp(脂蛋白)、male(麦芽糖结合蛋白)、phoa(碱性磷酸酶)、bla(tem-1b-内酰胺酶)、f1或m13主要衣壳(来源于基因viii)和f1或m13次要衣壳(基因iii)。21.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分,其中所述靶细胞粘附部分包含碳水化合物结合模块。22.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞粘附部分,其中所述靶细胞粘附部分包含选自由以下各项组成的组的碳水化合物结合模块：纤维素结合结构域、木聚糖结合结构域、几丁质结合结构域和木质素结合结构域。23.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞在其表面上表达增加与所述靶细胞的表面的粘附的多肽。24.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞在其表面上表达靶标粘附多肽。25.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的碳水化合物结合模块。26.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源碳水化合物结合模块。27.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的纤维素结合结构域。28.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源纤维素结合结构域。29.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞降解部分。30.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个表面表达部分和至少一个靶细胞降解部分，其中所述靶细胞降解部分包含角质酶和纤维素酶。31.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞在其表面表达促进所述无核细胞穿透植物角质层进入所述靶细胞的角质酶。32.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源角质酶。33.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞在其表面上表达分解靶细胞壁并促进所述无核细胞穿透到所述靶细胞中的纤维素酶。34.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源纤维素酶。35.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的几丁质结合结构域。36.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述完整无核细胞表达在其表面上展示的异源几丁质结合结构域。37.如前述条款中任一项所述的方法，还包含：用溶剂将所述工业上适合的无核细胞施加于所述靶细胞。38.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述溶剂是乙醇、dmso、聚乙二醇或甘油。39.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞除了用所述溶剂处理外，还用试剂处理。40.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是固定剂、防腐剂或交联剂。41.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述交联剂是戊二醛、甲醛、京尼平或表没食子儿茶素没食子酸酯。42.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述溶剂增加所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的溶解度。43.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述溶剂增加所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的溶解度，并且其中所述溶剂增加所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的扩散。44.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂将所述至少一种生物活性化合物捕获在所述无核细胞的膜内。45.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂将所述至少一种生物活性化合物捕获在所述无核细胞的膜内，并且其中所述试剂使所述至少一种生物活性化合物与所述无核细胞交联，这改善了所述无核细胞的稳定性。46.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂增强所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的负载能力。47.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂增强所述至少一种生物活性化合物在所述无核细胞中的负载能力，并且其中所述试剂控制所述至少一种生物活性化合物从所述无核细胞的释放速率。48.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞表现出所述至少一种生物活性化合物的控制释放速率。49.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞表现出所述至少一种生物活性化合物的控制释放速率，并且其中所述至少一种生物活性化合物以稳定速率释放。50.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞表现出初始突释所述至少一种生物活性化合物。51.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞表现出初始突释所述至少一种生物活性化合物，所述突释包括释放至少约40％的所述至少一种生物活性化合物。52.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述无核细胞表现出所述至少一种生物活性化合物的控制释放速率，并且其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的所述至少一种生物活性化合物。53.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放小于15％的所述至少一种生物活性化合物。54.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放小于10％的所述至少一种生物活性化合物。55.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述控制释放速率为每天从所述无核细胞释放约5％的所述至少一种生物活性化合物。56.如前述条款中任一项所述的方法，还包括：将所述无核细胞与试剂一起施加于所述靶细胞。57.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是用于改善所述无核细胞穿透到所述靶细胞中的佐剂。58.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是表面活性剂、乳化剂、作物油浓缩液、穿透剂、盐或其组合。59.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是甲基化种子油。60.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是n,n-二甲基癸酰胺。61.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述试剂是n-癸基-n-甲基甲酰胺。来源于病原细菌细胞的平台1.一种用于包封至少一种生物活性化合物并将其递送到靶细胞的工业上适合的基于无核细胞的平台，包含：a.来源于病原细菌亲本细胞的完整无核细菌小细胞，所述小细胞在所述小细胞内包含所述生物活性化合物，其中所述生物活性化合物是生物防治剂或生物刺激剂，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。2.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，还包含：b.至少一种生物学上可接受的载剂。3.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由病原细菌属产生的。4.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由选自由以下各项组成的组的病原细菌属产生的：假单胞菌属、罗尔斯通菌属、土壤杆菌属、黄单胞菌属、欧文氏菌属、木杆菌属、迪基氏菌属、果胶杆菌属、棍状杆菌属和候选属。5.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由选自由以下各项组成的组的病原细菌种产生的：丁香假单胞菌致病变种、青枯罗尔斯通菌、根癌土壤杆菌、水稻黄单胞菌水稻致病变种、野油菜黄单胞菌、地毯草黄单胞菌致病变种、淀粉欧文氏菌、苛养木杆菌、达旦提迪基氏菌、茄迪基氏菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、黑腐果胶杆菌、密执安棍状杆菌、萨氏假单胞菌和候选柑橘黄龙病菌。来源于内生菌的平台1.一种用于包封至少一种生物活性化合物并将其递送到靶细胞的工业上适合的基于无核细胞的平台，包含：a.来源于内生菌的完整无核细菌小细胞，所述小细胞在所述小细胞内包含所述生物活性化合物，其中所述生物活性化合物是生物防治剂或生物刺激剂，并且其中所述靶细胞不是哺乳动物细胞。2.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，还包含：b.至少一种生物学上可接受的载剂。3.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由内生菌属产生的。4.如前述条款中任一项所述的基于无核细胞的平台，其中所述完整无核细胞是由选自由以下各项组成的组的内生菌属产生的：食酸菌属、慢生根瘤菌属、根瘤菌属、红球菌属、炭疽菌属、弯孢属、香柱菌属、镰刀菌属、球腔菌属、内生真菌、梨形孢属和梨型孢菌属。基于核糖核酸酶缺乏和蛋白酶缺乏的细胞的平台1.一种来源于细菌亲本细胞的小细胞，其中所述细菌亲本细胞是蛋白酶缺乏的和是核糖核酸酶缺乏的。通过引用并入本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请都通过引用全文并入出于所有目的。然而，对本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不被视为也不应被视为承认或以任何形式建议它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。参考文献agrospheres，inc.compositionsandmethodsforenzymeimmobilization，pct/us2018/030328agrospheres，inc.compositionsandmethodsfortheencapsulationandscalabledeliveryofagrochemicals，pct/us2018/030329pourtaherip.，zomorodis.，davisz.g.，shakeela.m.，frankj.，moshashas.r.，khokhlacheva.，kesterm.，compositionsandmethodsforpesticidedegradation，wo2017/180650a1sabbadinir.，berkleyn.，surberm.，klepperr.，minicellbaseddeliveryofbiologicallyactivecompoundsus9,017,986b2giacalonem.j.，maloys.，tsujis.，regulatedgeneticsuicidemechanismcompositionsandmethods，us9,045,761b2giacalonem.j，newmanm.j.，therapeuticcompositionsandmethodsforantibodyandfc-containingtargetingmolecule-basedtargeteddeliveryofbioactivemoleculesbybacterialminicells，us2/012/0207754a1enzymeimmobilization-advancesinindustry，agriculture，|alkadwevedi|springer.(n.d.).retrievedfromwww.springer.com/us/book/9783319414164gai，s.a.，&wittrup，k.d.(2007).yeastsurfacedisplayforproteinengineeringandcharacterization.currentopinioninstructuralbiology，17(4)，467-473.https：//doi.org/10.1016/j.sbi.2007.08.012karlsson，s.，holmbom，b.，spetz，p.，mustranta，a.，&buchert，j.(2001).reactivityoftrameteslaccaseswithfattyandresinacids.appliedmicrobiologyandbiotechnology，55(3)，317-320.mitra，s.d.，afonina，i.，&kline，k.a.(2016).rightplace，righttime：focalizationofmembraneproteinsingram-positivebacteria.trendsinmicrobiology，24(8)，611-621.lee，s.h.，lee，s.y.，&park，b.c.(2005).cellsurfacedisplayoflipaseinpseudomonasputidakt2442usingoprfasananchoringmotifanditsbiocatalyticapplications.appliedandenvironmentalmicrobiology，71(12)，8581-8586.routledge，s.j.，mikaliunaite，l.，patel，a.，clare，m.，cartwright，s.p.，bawa，z.，...bill，r.m.(2016).thesynthesisofrecombinantmembraneproteinsinyeastforstructuralstudies.methods，95，26-37.vinh，d.khue，n.studyonminicellgenerationoflactobacillusacidophilusvtcc-b-871fordrugdelivery.journalofappliedpharmaceuticalscience.vol.3(05)，33-36.wieczorek，a.s.，biot-pelletier，d.，&martin，v.j.j.(2013).recombinantcellulaseandcellulosomesystems.patentus20130337545minicellbaseddeliveryofbiologicallyactivecompoundsfershta.structureandmechanisminproteinscience：aguidetoenzymecatalysisandproteinfolding.newyork：w.h.freeman&company；1998.p.615.powersr.comparisonofproteinactivesitestructuresforfunctionalannotationofproteinsanddrugdesign.proteinsstructfunctbioinf.2006；65：124-35.nelsonjm，hitchcockdi.theactivityofadsorbedinvertase.jamchemsoc.1921；43：1956-61.mclarenad.concerningthephdependenceofenzymereactionsoncells，particulatesandinsolution.science.1957；125：697.mosbachk，mosbachr.entrapmentofenzymesandmicroorganismsinsyntheticcross-linkedpolymersandtheirapplicationincolumntechniques.actachemscand.1966；20：2807-10.chenlf，richardsonr.enzymederivativescontainingreactivegroups.immobilizationofalpha-amylaseonhumanerythrocytes.pharmacolrescommun.1974；6：27380.kennedyjf，zamira.theuseofcellulosexanthatefortheimmobilisationofbiologicalmolecules.carbohydrres.1975；41：227-33.cordonnierm，lawnyf，chapotd，thomasd.magneticenzymemembranesasactiveelementsofelectrochemicalsensors.lactose，saccharose，maltosebienzymeelectrodes.febslett.1975；59：263-7.sinml，machke，wongpk，liaojc.advancesandchallengesinbiosensor-baseddiagnosisofinfectiousdiseases.expertrevmoldiagn.2014；14：225-44.hortonhr，swaisgoodhe.immobilizationasameansofinvestigatingtheacquisitionoftertiarystructureinchymotrypsinogen.methodsenzymol.1976；44：516-26.dasn，kayasthaam，malhotraop.immobilizationofureasefrompigeonpea(cajanuscajanl.)onpolyacrylamidegelsandcalciumalginatebeads.biotechnolapplbiochem.1998；27：25-9.nakaranim，kayasthaam.kineticsanddiffusionstudiesinurease-alginatebiocatalystbeads.orientpharmexpmed.2007；7：79-84.allouewa，destainj，elmedjoubt，ghalfih，kabranp，thonartp.comparisonofyarrowialipolyticalipaseimmobilizationyieldofentrapment，adsorption，andcovalentbondtechniques.applbiochembiotechnol.2008；150：51-63.hageds，waltersrr，hethcotehw.split-peakaffinitychromatographicstudiesoftheimmobilization-dependentadsorptionkineticsofproteina.analchem.1986；58：274-9.marquezlds，cabralbv，freitasff，cardosovl，ribeiroej.optimizationofinvertaseimmobilizationbyadsorptioninionicexchangeresinforsucrosehydrolysis.jmolcatalb：enzym.2008；51：86-92.dasn，prabhakarp，kayasthaam，srivastavarc.enzymeentrappedinsidethereversemicelleinthefabricationofanewureasensor.biotechnolbioeng.1997；54：329-32.isom，shirahaset，hanamuras，urushiyamas，omis.immobilizationofenzymebymicroencapsulationandapplicationoftheencapsulatedenzymeinthecatalysis.jmicroencapsul.1989；6：165-76.isom，kandot，omis.afundamentalstudyofthemicroencapsulationprocedureutilizingcoacervationinapolystyrene-cyclohexanesolution.jmicroencapsul.1985；2：275-87.mauguetmc，legrandj，brujesl，carnelleg，larrec，popineauy.gliadinmatricesformicroencapsulationprocessesbysimplecoacervationmethod.jmicroencapsul.2002；19：377-84.kayasthaam，srivastavapk，miksab，slomkowskis.uniqueactivityofureasesimmobilizedonpoly(styrene-co-acrolein)microspheres.jbioactcompatpolym.2003；18：113-24.reddykrc，kayasthaam.improvedstabilityofureaseuponcouplingtoalkylamineandarylamineglassanditsanalyticaluse.jmolcatalb：enzym.2006；38：104-12.trevanmd.enzymeimmobilizationbycovalentbonding.methodsmolbiol.1988；3：495-510.williamsra，blanchhw.covalentimmobilizationofproteinmonolayersforbiosensorapplications.biosensbioelectron.1994；9：159-67.pierresj，thiesjc，dureaulta，cameronnr，vanhestjcm，caretten，michont，weberskirchr.covalentenzymeimmobilizationontophotopolymerizedhighlyporousmonoliths.advmater.2006；18：1822-6.dwevedia，kayasthaam.optimalimmobilizationofbeta-galactosidasefrompea(psbgal)ontosephadexandchitosanbeadsusingresponsesurfacemethodologyanditsapplications.bioresourtechnol.2009；100：2667-75.dwevedia，kayasthaam.stabilizationofbeta-galactosidase(frompeas)byimmobilizationontoamberlitemb-150beadsanditsapplicationinlactosehydrolysis.jagricfoodchem.2009；57：682-8.mulagalapallis，kumars，kalathurrc，kayasthaam.immobilizationofureasefrompigeonpea(cajanuscajan)onagartabletsanditsapplicationinureaassay.applbiochembiotechnol.2007；142：291-7.dasn，kayasthaam，malhotraop.immobilizationofureasefrompigeonpea(cajanuscajanl.)inpolyacrylamidegelsandcalciumalginatebeads.biotechnolapplbiochem.1998；27：25-9.dasn，kayasthaam.immobilizationofureasefrompigeonpea(cajanuscajanl.)onflannelclothusingpolyethylenimine.worldjmicrobiolbiotechnol.1998；14：927-9.kayasthaam，srivastavapk.pigeonpea(cajanuscajanl.)ureaseimmobilizedonglutaraldehydeactivatedchitosanbeadsanditsanalyticalapplications.applbiochembiotechnol.2001；96：41-53.tripathip，kumaria，rathp，kayasthaam.immobilizationofα-amylasefrommungbeans(vignaradiata)onamberlitemb150andchitosanbeads：acomparativestudy.jmolcatalb：enzym.2007；49：69-74.kumars，dwevedia，kayasthaam.immobilizationofsoybean(glycinemax)ureaseonalginateandchitosanbeadsshowingimprovedstability：analyticalapplications.jmolcatalb：enzym.2009；58：138-45.netosa，fortijc，zucolottov，ciancaglinip，deandradear.thekineticbehaviorofdehydrogenaseenzymesinsolutionandimmobilizedontonanostructuredcarbonplatforms.processbiochem.2011；46：2347-52.delouisela，millerbl.enzymeimmobilizationinporoussilicon：quantitativeanalysisofthekineticparametersforglutathione-s-transferases.analchem.2005；77：1950-6.reddykrc，turcuf，schultea，kayasthaam，schuhmannw.fabricationofapotentiometric/amperometricbifunctionalenzymemicrobiosensor.analchem.2005；77：5063-7.line-w，boehnken，maynardhd.protein-polymerconjugationvialigandaffinityandphotoactivationofglutathiones-transferase.bioconjugatechem.2014；25：1902-9.alconcelsns，baasas，maynardhd.fdaapprovedpoly(ethyleneglycol)-proteinconjugatedrugs.polymchem.2011；2：1442-8.canallela，lowikd，vanhestjcm.polypeptide-polymerbioconjugates.chemsocrev.2010；39：329-53.self-assembly-latestresearchandnews|nature.(n.d.).retrievedfromwww.nature.com/subjects/self-assemblysilhavy，t.j.，benson，s.a.，&emr，s.d.(1983).mechanismsofproteinlocalization.microbiologicalreviews，47(3)，313-344.mitra，s.d.，afonina，i.，&kline，k.a.(2016).rightplace，righttime：focalizationofmembraneproteinsingram-positivebacteria.trendsinmicrobiology，24(8)，611-621.routledge，s.j.，mikaliunaite，l.，patel，a.，clare，m.，cartwright，s.p.，bawa，z.，...bill，r.m.(2016).thesynthesisofrecombinantmembraneproteinsinyeastforstructuralstudies.methods，95，26-37.h.i.adler，w.d.fisher，a.cohenandalicea.hardigree，miniatureescherichiacolicellsdeficientindnaproceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamericavol.57，no.2(feb.15,1967)，pp.321-326pieta.j.deboer，robine.crossley，andlawrencei.rothfield，(1990)centralrolefortheescherichiacolimincgeneproductintwodifferentcelldivision-inhibitionsystems，proc.natl.acad.sci.usavol.87，pp.1129-1133，xuan-chuanyuandwilliammargolindeletionoftheminoperonresultsinincreasedthermosensitivityofanftsz84mutantandabnormalftszringassembly，placement，anddisassembly，jbacteriol.2000nov；182(21)：6203-6213.murphykc.targetedchromosomalgeneknockoutusingpcrfragments.methodsmolbiol.2011；765：27-42.maralrahimzadeh，majidsadeghizadeh，farhoodnajafi，seyedarab，andhamidmobasheriimpactofheatshocksteponbacterialtransformationefficiency，molbiolrescommun.2016dec；5(4)：257-261.https：//www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/sigma/general_information/lipoprotein_lipase.pdfmitra，sd.，afonina，i.andkline，k.a(2016)rightplace，righttime：focalizationofmembraneproteinsingram-positivebacteria.trendsinmicrobiology24(8)：611-621.inselburgj，segregationintoandreplicationofplasmiddeoxyribonucleicacidinchromosomelesssegregantsofescherichiacoli1970j.bacteriol.102(3)：642-647frazerac，curtissr3rd，production，propertiesandutilityofbacterialminicells1975，curr.topicsmicrobiol.immunol.69：1-84reeve，j.n.，andn.h.mendelson.1973.pronasedigestionofaminoacidbindingcomponentsonthesurfaceofbacillussubtiliscellsandminicells.biochem.biophys.res.commun.53：1325-1330tankersleywg，woodwardjm，browna.inductionandisolationofaminicell-producingstrainofsalmonellatyphimurium.procsocexpbiolmed.1974mar；145(3)：802-805reevejn，mendelsonnh，coynesi，hallockll，colerm，minicellsofbacillussubtilis，1973，j.bacteriol.114(2)：860-873mendelsonnh，reevejn，colerm，physiologicalstudiesofbacillussubtilisminicells1974j.bacteriol.117(3)：1312-1319.yangx，suns，wanghf，hanghy2013，comparisonofautotransporterandicenucleationproteinascarrierproteinsforantibodydisplayonthecellsurfaceofescherichiacoliprogressinbiochemistryandbiophysics40(12)：1209-1219cid，m.，pedersen，h.l.，kaneko，s.，coutinho，p.m.，henrissat，b.，willats，w.g.t.，&boraston，a.b.(2010).recognitionofthehelicalstructureofβ-1，4-galactanbyanewfamilyofcarbohydrate-bindingmodules.journalofbiologicalchemistry，285(46)，35999-36009.datta，s.，christena，l.r.，&rajaram，y.r.s.(2013).enzymeimmobilization：anoverviewontechniquesandsupportmaterials.3biotech，3(1)，1-9.dimov，n.，kastner，e.，hussain，m.，perrie，y.，&szita，n.(2017).formationandpurificationoftailoredliposomesfordrugdeliveryusingamodule-basedmicrocontinuous-flowsystem.scientificreports，7(1)，12045.enzymeimmobilization-advancesinindustry，agriculture，|alkadwevedi|springer.(2016).retrievedfromwww.springer.com/us/book/9783319414164farley，m.m.，hu，b.，margolin，w.，&liu，j.(2016).minicells，backinfashion.journalofbacteriology，198(8)，1186-1195.gill，h.k.，&garg，h.(2014).pesticides：environmentalimpactsandmanagementstrategies.jose，j.，maas，r.m.，&teese，m.g.(2012).autodisplayofenzymes--molecularbasisandperspectives.journalofbiotechnology，161(2)，92-103.linder，m.，&teeri，t.t.(1997).therolesandfunctionofcellulose-bindingdomains.journalofbiotechnology，57(1),15-28.macdiarmid，j.a.，mugridge，n.b.，weiss，j.c.，phillips，l.，burn，a.l.，paulin，r.p.，brahmbhatt，h.(2007).bacteriallyderived400nmparticlesforencapsulationandcancercelltargetingofchemotherapeutics.cancercell，11(5)，431-445.mahmood，t.，&yang，p.-c.(2012).westernblot：technique，theory，andtroubleshooting.northamericanjournalofmedicalsciences，4(9)，429-434.nuruzzaman，m.，rahman，m.m.，liu，y.，&naidu，r.(2016).nanoencapsulation，nano-guardforpesticides：anewwindowforsafeapplication.journalofbiologicallyactiveandfoodchemistry，64(7)，1447-1483.pimentel，d.(2005).‘environmentalandeconomiccostsoftheapplicationofpesticidesprimarilyintheunitedstates.’environment，developmentandsustainability，7(2)，229-252.shoseyov，o.，shani，z.，&levy，i.(2006).carbohydratebindingmodules：biochemicalpropertiesandnovelapplications.microbiologyandmolecularbiologyreviews，70(2)，283-295.singh，r.，kumar，m.，mittal，a.，&mehta，p.k.(2016).microbialenzymes：industrialprogressin21stcentury.3biotech，6(2).sührer，i.，langemann，t.，lubitz，w.，weuster-botz，d.，&castiglione，k.(2015).anovelone-stepexpressionandimmobilizationmethodfortheproductionofbiocatalyticpreparations.microbialcellfactories，14，180.sun，f.，pang，x.，xie，t.，zhai，y.，wang，g.，&sun，f.(2015).brkautodisplay：functionaldisplayofmultipleexogenousproteinsonthesurfaceofescherichiacolibyusingbrkaautotransporter.microbialcellfactories，14.swords，w.e.(2003).chemicaltransformationofe.coli.methodsinmolecularbiology(clifton，n.j.)，235，49-53.wendel，s.，fischer，e.c.，martinez，v.，s.，&m.h.h.(2016).ananobody：gfpbacterialplatformthatenablesfunctionalenzymedisplayandeasyquantificationofdisplaycapacity.microbialcellfactories，15.zhang，s.，&cahalan，m.d.(2007).purifyingplasmiddnafrombacterialcoloniesusingtheqiagenminiprepkit.journalofvisualizedexperiments：jove，(6).zhang，y.，chen，s.，xu，m.，cavoco-paulo，a.，wu，j.，&chen，j.(2010).characterizationofthermobifidafuscacutinase-carbohydrate-bindingmodulefusionproteinsandtheirpotentialapplicationinbioscouring.appliedandenvironmentalmicrobiology，76(20)，6870-6876.raymondj.st.legerchengshu，wangweiguofang(2011)newperspectivesoninsectpathogens，fungalbiologyreviewsvolume25，issue2：84-88r.jog，g.nareshkumarands.rajkumar(2012)plantgrowthpromotingpotentialandsoilenzymeproductionofthemostabundantstreptomycesspp.fromwheatrhizospherejournalofappliedmicrobiology113：1154--1164arumugamsathya，rajendranvijayabharathi，andsubramaniamgopalakrishnan(2017),plantgrowth-promotingactinobacteria：anewstrategyforenhancingsustainableproductionandprotectionofgrainlegumes3biotech7(2)：102.beysdasilvawo，santil，schranka，vainsteinmh.(2010)metarhiziumanisopliaelipolyticactivityplaysapivotalroleinrhipicephalus(boophilus)microplusinfection.fungalbiol.2010jan；114(1)：10-5.kanchiswamycn，malnoym，maffeime(2015)bioprospectingbacterialandfungalvolatilesforsustainableagriculture，trendsplantsci.20(4)：206-211choong-minryu，mohameda.farag，chia-huihu，munagalas.reddy，josephw.kloepper，andpaulw.paré7.(2004)bacterialvolatilesinducesystemicresistanceinarabidopsis’plantphysiol.2004mar；134(3)：1017-1026.choong-minryu，mohameda.farag，chia-huihu，munagalas.reddy，han-xunwei，paulw.paré，andjosephw.kloepper(2003)bacterialvolatilespromotegrowthinarabidopsis，pnas100(8)：4927-4932witzgallp，kirschp，corka.(2010)sexpheromonesandtheirimpactonpestmanagement，jchemecol.36(1)：80-100.a.cork，k.desouza，k.krishnaiah，d.v.s.s.r.kumar(1996)controlofyellowstemborer，scirpophagaincertulas(lepidoptera：pyralidae)bymatingdisruptiononriceinindia：effectofunnaturalpheromoneblendsandapplicationtimeonefficacy，86(5)：515-524rathpichyangkurasupachitrachadchawan(2015)biostimulantactivityofchitosaninhorticulture，scientiahorticulturae196(3)：49-65giuseppecolla，lorihoagland，maurizioruzzi，mariateresacardarelli，paolobonini，renaudcanaguier，andyoussefrouphael，(2017)biostimulantactionofproteinhydrolysates：unravelingtheireffectsonplantphysiologyandmicrobiome，frontplantsci.8：2202.t.alshaal*andh.el-ramady，(2017)foliarapplication：fromplantnutritiontobiofortificationenv.biodiv.soilsecurity1：71-83c.j.wangz.q.liu(2007)foliaruptakeofpesticides-presentstatusandfuturechallengepesticidebiochemistryandphysiology87(1)：1-8schwabf，zhaig，kernm，turnera，schnoorjl，wiesnermr(2016)barriers，pathwaysandprocessesforuptake，translocationandaccumulationofnanomaterialsinplants-criticalreview，nanotoxicology.2016；10(3)：257-78.weiqingzeng，maelimelotto，andshengyanghe(2010)plantstomata：acheckpointofhostimmunityandpathogenvirulence，curropinbiotechnol.2010oct；21(5)：599-603.gaofk，daicc，liuxz.mechanismoffungalendophytesinplantprotectionagainstpathogen.afrjmicrobiolres.2010；4(13)：1346-1351.序列表<110>农业球体公司(agrospheres,inc.)<120>用于可规模化生产和递送生物制剂的组合物和方法<130>agro-004/02wo330377-2009<150>us62/666,981<151>2018-05-04<150>us62/562,723<151>2017-09-25<160>45<170>patentinversion3.5<210>1<211>50<212>dna<213>大肠埃希氏菌(escherichiacoli)<400>1cgaagtaacaacaataatgcgtgccatagaaattccttgttaaaaaggga50<210>2<211>50<212>dna<213>大肠埃希氏菌(escherichiacoli)<400>2cctggccttactcaattagctattaatcatcgccagcgcgcgatgatgtt50<210>3<211>50<212>dna<213>大肠埃希氏菌(escherichiacoli)<400>3ttggctgtgtttttcttccgcgagagaaagaaatcgagtaatgccataac50<210>4<211>50<212>dna<213>大肠埃希氏菌(escherichiacoli)<400>4agaaattccttgttaaaaagggatcaatttaacggttgaacggtcaaagc50<210>5<211>1773<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>注释的aida-1<400>5atgaataaggcctacagtatcatttggagccactccagacaggcctggattgtggcctca60gagttagccagaggacatggttttgtccttgcaaaaaatacactgctggtattggcggtt120gtttccacaatcggaaatgcatttgcagtcgaccaccatcaccatcaccatctggaagcg180ctgttccagggtccgggtacccagaaacagcgtaccgagctcgaaaacctgtacttccag240ggtgaacagaaactgattagcgaagaagatctgtctagagtgaataacaatggaagcatt300gtcattaataacagcattataaacgggaatattacgaatgatgctgacttaagttttggt360acagcaaagctgctctctgctacagtgaatggtagtcttgttaataacaaaaatatcatt420cttaatcctacaaaagaaagtgcggccgctataggtaatactcttaccgtgtcaaattat480actgggacaccgggaagtgttatttctcttggtggtgtgcttgaaggagataattcactt540acggaccgtctggtggtgaaaggtaatacctctggtcaaagtgacatcgtttatgtcaat600gaagatggcagtggtggtcagacgagagatggtattaatattatttctgtagagggaaat660tctgatgcagaattctctctgaagaaccgcgtagttgccggagcttatgattacacactg720cagaaaggaaacgagagtgggacagataataagggatggtatttaaccagtcatcttccc780acatctgatacccggcaatacagaccggagaacggaagttatgctaccaatatggcactg840gctaactcactgttcctcatggatttgaatgagcgtaagcaattcagggccatgagtgat900aatacacagcctgagtctgcatccgtgtggatgaagatcactggaggaataagctctggt960aagctgaatgacgggcaaaataaaacaacaaccaatcagtttatcaatcagctcgggggg1020gatatttataaattccatgctgaacaactgggtgattttaccttagggattatgggagga1080tacgcgaatgcaaaaggtaaaacgataaattacacgagcaacaaagctgccagaaacaca1140ctggatggttattctgtcggggtatacggtacgtggtatcagaatggggaaaatgcaaca1200gggctctttgctgaaacttggatgcaatataactggtttaatgcatcagtgaaaggtgac1260ggactggaagaagaaaaatataatctgaatggtttaaccgcttctgcaggtgggggatat1320aacctgaatgtgcacacatggacatcacctgaaggaataacaggtgaattctggttacag1380cctcatttgcaggctgtctggatgggggttacaccggatacacatcaggaggataacgga1440acggtggtgcagggagcagggaaaaataatattcagacaaaagcaggtattcgtgcatcc1500tggaaggtgaaaagcaccctggataaggataccgggcggaggttccgtccgtatatagag1560gcaaactggatccataacactcatgaatttggtgttaaaatgagtgatgacagccagttg1620ttgtcaggtagccgaaatcagggagagataaagacaggtattgaaggggtgattactcaa1680aacttgtcagtgaatggcggagtcgcatatcaggcaggaggtcacgggagcaatgccatc1740tccggagcactggggataaaatacagcttctga1773<210>6<211>3033<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>注释的brkautotransporter<400>6atgtatctggatcgctttcgccagtgcccgagcagcctgcagattccgcgcagcgcgtgg60cgcctgcatgcgctggcggcggcgctggcgctggcgggcatggcgcgcctggcgccggcg120gcggcgcaggcgccgcagccgccggtggcgggcgcgccgcatgcgcaggatgcgggccag180gaaggcgaatttgatcatcgcgataacaccctgattgcggtgtttgatgatggcgtgggc240attaacctggatgatgatccggatgaactgggcgaaaccgcgccgccgaccctgaaagat300attcatattagcgtggaacataaaaacccgatgagcaaaccggcgattggcgtgcgcgtg360agcggcgcgggccgcgcgctgaccctggcgggcagcaccattgatgcgaccgaaggcggc420attccggcggtggtgcgccgcggcggcaccctggaactggatggcgtgaccgtggcgggc480ggcgaaggcatggaaccgatgaccgtgagcgatgcgggcagccgcctgagcgtgcgcggc540ggcgtgctgggcggcgaagcgccgggcgtgggcctggtgcgcgcggcgcagggcggccag600gcgagcattattgatgcgaccctgcagagcattctgggcccggcgctgattgcggatggc660ggcagcattagcgtggcgggcggcagcattgatatggatatgggcccgggctttccgccg720ccgccgccgccgctgccgggcgcgccgctggcggcgcatccgccgctggatcgcgtggcg780gcggtgcatgcgggccaggatggcaaagtgaccctgcgcgaagtggcgctgcgcgcgcat840ggcccgcaggcgaccggcgtgtatgcgtatatgccgggcagcgaaattaccctgcagggc900ggcaccgtgagcgtgcagggcgatgatggcgcgggcgtggtggcgggcgcgggcctgctg960gatgcgctgccgccgggcggcaccgtgcgcctggatggcaccaccgtgagcaccgatggc1020gcgaacaccgatgcggtgctggtgcgcggcgatgcggcgcgcgcggaagtggtgaacacc1080gtgctgcgcaccgcgaaaagcctggcggcgggcgtgagcgcgcagcatggcggccgcgtg1140accctgcgccagacccgcattgaaaccgcgggcgcgggcgcggaaggcattagcgtgctg1200ggctttgaaccgcagagcggcagcggcccggcgagcgtggatatgcagggcggcagcatt1260accaccaccggcaaccgcgcggcgggcattgcgctgacccatggcagcgcgcgcctggaa1320ggcgtggcggtgcgcgcggaaggcagcggcagcagcgcggcgcagctggcgaacggcacc1380ctggtggtgagcgcgggcagcctggcgagcgcgcagagcggcgcgattagcgtgaccgat1440accccgctgaaactgatgccgggcgcgctggcgagcagcaccgtgagcgtgcgcctgacc1500gatggcgcgaccgcgcagggcggcaacggcgtgtttctgcagcagcatagcaccattccg1560gtggcggtggcgctggaaagcggcgcgctggcgcgcggcgatattgtggcggatggcaac1620aaaccgctggatgcgggcattagcctgagcgtggcgagcggcgcggcgtggcatggcgcg1680acccaggtgctgcagagcgcgaccctgggcaaaggcggcacctgggtggtgaacgcggat1740agccgcgtgcaggatatgagcatgcgcggcggccgcgtggaatttcaggcgccggcgccg1800gaagcgagctataaaaccctgaccctgcagaccctggatggcaacggcgtgtttgtgctg1860aacaccaacgtggcggcgggccagaacgatcagctgcgcgtgaccggccgcgcggatggc1920cagcatcgcgtgctggtgcgcaacgcgggcggcgaagcggatagccgcggcgcgcgcctg1980ggcctggtgcatacccagggccagggcaacgcgacctttcgcctggcgaacgtgggcaaa2040gcggtggatctgggcacctggcgctatagcctggcggaagatccgaaaacccatgtgtgg2100agcctgcagcgcgcgggccaggcgctgagcggcgcggcgaacgcggcggtgaacgcggcg2160gatctgagcagcattgcgctggcggaaagcaacgcgctggataaacgcctgggcgaactg2220cgcctgcgcgcggatgcgggcggcccgtgggcgcgcacctttagcgaacgccagcagatt2280agcaaccgccatgcgcgcgcgtatgatcagaccgtgagcggcctggaaattggcctggat2340cgcggctggagcgcgagcggcggccgctggtatgcgggcggcctgctgggctatacctat2400gcggatcgcacctatccgggcgatggcggcggcaaagtgaaaggcctgcatgtgggcggc2460tatgcggcgtatgtgggcgatggcggctattatctggataccgtgctgcgcctgggccgc2520tatgatcagcagtataacattgcgggcaccgatggcggccgcgtgaccgcggattatcgc2580accagcggcgcggcgtggagcctggaaggcggccgccgctttgaactgccgaacgattgg2640tttgcggaaccgcaggcggaagtgatgctgtggcgcaccagcggcaaacgctatcgcgcg2700agcaacggcctgcgcgtgaaagtggatgcgaacaccgcgaccctgggccgcctgggcctg2760cgctttggccgccgcattgcgctggcgggcggcaacattgtgcagccgtatgcgcgcctg2820ggctggacccaggaatttaaaagcaccggcgatgtgcgcaccaacggcattggccatgcg2880ggcgcgggccgccatggccgcgtggaactgggcgcgggcgtggatgcggcgctgggcaaa2940ggccataacctgtatgcgagctatgaatatgcggcgggcgatcgcattaacattccgtgg3000agctttcatgcgggctatcgctatagcttttga3033<210>7<211>2343<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>brkautotransporter_cbm<400>7atgtatctggatcgctttcgccagtgcccgagcagcctgcagattccgcgcagcgcgtgg60cgcctgcatgcgctggcggcggcgctggcgctggcgggcatggcgcgcctggcgccggcg120gcggcgcaggcgccgcagccgccggtggcgggcgcgccgcatgcgcaggatgcgggccac180catcaccatcaccatgttcagctggttgaaagcggtggtgcactggttcagcctggtggt240agcctgcgtctgagctgtgcagcaagcggttttccggttaatcgttatagcatgcgttgg300tatcgtcaggcaccgggtaaagaacgtgaatgggttgcaggtatgagcagtgccggtgat360cgtagcagctacgaagatagcgttaaaggtcgttttaccatcagccgtgatgatgcacgt420aataccgtttatctgcaaatgaatagcctgaaaccggaagataccgcagtgtattattgc480aacgttaacgtgggctttgaatattggggtcagggcacccaggttaccgttagcagcaaa540ctcgagcggccgcatcgtgacgcgtcgtctggtcctgccggctgccaagtcctttggggc600gtgaatcagtggaacacaggtttcacggcgaatgttaccgtcaagaatacgtcctccgct660cctgttgacggctggaccttgaccttcagtttcccatcaggacaacaagtcactcaagcc720tggtcatctaccgtgacccagagtggatctgcggtcacagtacgtaacgctccgtggaac780ggttcgattcccgcgggcgggactgctcagttcgggtttaacggaagccacactggcact840aatgctgcaccaactgccttctcacttaacggcacgccgtgcaccgtaggcgaacagaaa900ctgattagcgaagaagatctggaaaacctgtacttccagggtgcgggcattagcctgagc960gtggcgagcggcgcggcgtggcatggcgcgacccaggtgctgcagagcgcgaccctgggc1020aaaggcggcacctgggtggtgaacgcggatagccgcgtgcaggatatgagcatgcgcggc1080ggccgcgtggaatttcaggcgccggcgccggaagcgagctataaaaccctgaccctgcag1140accctggatggcaacggcgtgtttgtgctgaacaccaacgtggcggcgggccagaacgat1200cagctgcgcgtgaccggccgcgcggatggccagcatcgcgtgctggtgcgcaacgcgggc1260ggcgaagcggatagccgcggcgcgcgcctgggcctggtgcatacccagggccagggcaac1320gcgacctttcgcctggcgaacgtgggcaaagcggtggatctgggcacctggcgctatagc1380ctggcggaagatccgaaaacccatgtgtggagcctgcagcgcgcgggccaggcgctgagc1440ggcgcggcgaacgcggcggtgaacgcggcggatctgagcagcattgcgctggcggaaagc1500aacgcgctggataaacgcctgggcgaactgcgcctgcgcgcggatgcgggcggcccgtgg1560gcgcgcacctttagcgaacgccagcagattagcaaccgccatgcgcgcgcgtatgatcag1620accgtgagcggcctggaaattggcctggatcgcggctggagcgcgagcggcggccgctgg1680tatgcgggcggcctgctgggctatacctatgcggatcgcacctatccgggcgatggcggc1740ggcaaagtgaaaggcctgcatgtgggcggctatgcggcgtatgtgggcgatggcggctat1800tatctggataccgtgctgcgcctgggccgctatgatcagcagtataacattgcgggcacc1860gatggcggccgcgtgaccgcggattatcgcaccagcggcgcggcgtggagcctggaaggc1920ggccgccgctttgaactgccgaacgattggtttgcggaaccgcaggcggaagtgatgctg1980tggcgcaccagcggcaaacgctatcgcgcgagcaacggcctgcgcgtgaaagtggatgcg2040aacaccgcgaccctgggccgcctgggcctgcgctttggccgccgcattgcgctggcgggc2100ggcaacattgtgcagccgtatgcgcgcctgggctggacccaggaatttaaaagcaccggc2160gatgtgcgcaccaacggcattggccatgcgggcgcgggccgccatggccgcgtggaactg2220ggcgcgggcgtggatgcggcgctgggcaaaggccataacctgtatgcgagctatgaatat2280gcggcgggcgatcgcattaacattccgtggagctttcatgcgggctatcgctatagcttt2340tga2343<210>8<211>330<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>cbm<400>8gcgtcgtctggtcctgccggctgccaagtcctttggggcgtgaatcagtggaacacaggt60ttcacggcgaatgttaccgtcaagaatacgtcctccgctcctgttgacggctggaccttg120accttcagtttcccatcaggacaacaagtcactcaagcctggtcatctaccgtgacccag180agtggatctgcggtcacagtacgtaacgctccgtggaacggttcgattcccgcgggcggg240actgctcagttcgggtttaacggaagccacactggcactaatgctgcaccaactgccttc300tcacttaacggcacgccgtgcaccgtaggc330<210>9<211>696<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>gfp-纳米抗体cbm<400>9gttcagctggttgaaagcggtggtgcactggttcagcctggtggtagcctgcgtctgagc60tgtgcagcaagcggttttccggttaatcgttatagcatgcgttggtatcgtcaggcaccg120ggtaaagaacgtgaatgggttgcaggtatgagcagtgccggtgatcgtagcagctacgaa180gatagcgttaaaggtcgttttaccatcagccgtgatgatgcacgtaataccgtttatctg240caaatgaatagcctgaaaccggaagataccgcagtgtattattgcaacgttaacgtgggc300tttgaatattggggtcagggcacccaggttaccgttagcagcaaactcgagcggccgcat360cgtgacgcgtcgtctggtcctgccggctgccaagtcctttggggcgtgaatcagtggaac420acaggtttcacggcgaatgttaccgtcaagaatacgtcctccgctcctgttgacggctgg480accttgaccttcagtttcccatcaggacaacaagtcactcaagcctggtcatctaccgtg540acccagagtggatctgcggtcacagtacgtaacgctccgtggaacggttcgattcccgcg600ggcgggactgctcagttcgggtttaacggaagccacactggcactaatgctgcaccaact660gccttctcacttaacggcacgccgtgcaccgtaggc696<210>10<211>537<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>inak<400>10atggtcttagacaaggcgctagttctacgtacctgcgctaataatatggccgatcactgc60ggcttgatttggcctgcctcagggaccgtcgagtcaaggtattggcaatctacacgtcgt120cacgagaacggactggtaggtcttctttggggagcaggaacttctgctttcttgtcagtc180catgcagacgcccgctggatcgtgtgcgaagtggctgttgccgatattatctccctagag240gagcccggaatggttaaatttcctcgggccgaagtggtgcatgtgggcgatcgaatcagc300gcttctcattttatttcggcgcggcaggcagatcccgcgagtacgagtacttcaacgtcg360acaagtactcttactcccatgcccacggcaatccccacccctatgccagcggtggcgtca420gtgacgttaccggtggctgagcaagcgcggcatgaggtgtttgatgtagctagtgtgagc480gccgcggctgctcccgtgaacactttacctgtcacgacaccccaaaacctccagacg537<210>11<211>1305<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>inak-tev-cbm-his-myc-gfpnb<400>11atggtcttagacaaggcgctagttctacgtacctgcgctaataatatggccgatcactgc60ggcttgatttggcctgcctcagggaccgtcgagtcaaggtattggcaatctacacgtcgt120cacgagaacggactggtaggtcttctttggggagcaggaacttctgctttcttgtcagtc180catgcagacgcccgctggatcgtgtgcgaagtggctgttgccgatattatctccctagag240gagcccggaatggttaaatttcctcgggccgaagtggtgcatgtgggcgatcgaatcagc300gcttctcattttatttcggcgcggcaggcagatcccgcgagtacgagtacttcaacgtcg360acaagtactcttactcccatgcccacggcaatccccacccctatgccagcggtggcgtca420gtgacgttaccggtggctgagcaagcgcggcatgaggtgtttgatgtagctagtgtgagc480gccgcggctgctcccgtgaacactttacctgtcacgacaccccaaaacctccagacggaa540aacctgtacttccagggtgcgtcgtctggtcctgccggctgccaagtcctttggggcgtg600aatcagtggaacacaggtttcacggcgaatgttaccgtcaagaatacgtcctccgctcct660gttgacggctggaccttgaccttcagtttcccatcaggacaacaagtcactcaagcctgg720tcatctaccgtgacccagagtggatctgcggtcacagtacgtaacgctccgtggaacggt780tcgattcccgcgggcgggactgctcagttcgggtttaacggaagccacactggcactaat840gctgcaccaactgccttctcacttaacggcacgccgtgcaccgtaggccaccatcaccat900caccatgttcagctggttgaaagcggtggtgcactggttcagcctggtggtagcctgcgt960ctgagctgtgcagcaagcggttttccggttaatcgttatagcatgcgttggtatcgtcag1020gcaccgggtaaagaacgtgaatgggttgcaggtatgagcagtgccggtgatcgtagcagc1080tacgaagatagcgttaaaggtcgttttaccatcagccgtgatgatgcacgtaataccgtt1140tatctgcaaatgaatagcctgaaaccggaagataccgcagtgtattattgcaacgttaac1200gtgggctttgaatattggggtcagggcacccaggttaccgttagcagcaaactcgagcgg1260ccgcatcgtgacgaacagaaactgattagcgaagaagatctgtga1305<210>12<211>5561<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>paida-1<400>12tttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttca60cacaggaaagcttcatatgaataaggcctacagtatcatttggagccactccagacaggc120ctggattgtggcctcagagttagccagaggacatggttttgtccttgcaaaaaatacact180gctggtattggcggttgtttccacaatcggaaatgcatttgcagtcgaccaccatcacca240tcaccatctggaagcgctgttccagggtccgggtacccagaaacagcgtaccgagctcga300aaacctgtacttccagggtgaacagaaactgattagcgaagaagatctgtctagagtgaa360taacaatggaagcattgtcattaataacagcattataaacgggaatattacgaatgatgc420tgacttaagttttggtacagcaaagctgctctctgctacagtgaatggtagtcttgttaa480taacaaaaatatcattcttaatcctacaaaagaaagtgcggccgctataggtaatactct540taccgtgtcaaattatactgggacaccgggaagtgttatttctcttggtggtgtgcttga600aggagataattcacttacggaccgtctggtggtgaaaggtaatacctctggtcaaagtga660catcgtttatgtcaatgaagatggcagtggtggtcagacgagagatggtattaatattat720ttctgtagagggaaattctgatgcagaattctctctgaagaaccgcgtagttgccggagc780ttatgattacacactgcagaaaggaaacgagagtgggacagataataagggatggtattt840aaccagtcatcttcccacatctgatacccggcaatacagaccggagaacggaagttatgc900taccaatatggcactggctaactcactgttcctcatggatttgaatgagcgtaagcaatt960cagggccatgagtgataatacacagcctgagtctgcatccgtgtggatgaagatcactgg1020aggaataagctctggtaagctgaatgacgggcaaaataaaacaacaaccaatcagtttat1080caatcagctcgggggggatatttataaattccatgctgaacaactgggtgattttacctt1140agggattatgggaggatacgcgaatgcaaaaggtaaaacgataaattacacgagcaacaa1200agctgccagaaacacactggatggttattctgtcggggtatacggtacgtggtatcagaa1260tggggaaaatgcaacagggctctttgctgaaacttggatgcaatataactggtttaatgc1320atcagtgaaaggtgacggactggaagaagaaaaatataatctgaatggtttaaccgcttc1380tgcaggtgggggatataacctgaatgtgcacacatggacatcacctgaaggaataacagg1440tgaattctggttacagcctcatttgcaggctgtctggatgggggttacaccggatacaca1500tcaggaggataacggaacggtggtgcagggagcagggaaaaataatattcagacaaaagc1560aggtattcgtgcatcctggaaggtgaaaagcaccctggataaggataccgggcggaggtt1620ccgtccgtatatagaggcaaactggatccataacactcatgaatttggtgttaaaatgag1680tgatgacagccagttgttgtcaggtagccgaaatcagggagagataaagacaggtattga1740aggggtgattactcaaaacttgtcagtgaatggcggagtcgcatatcaggcaggaggtca1800cgggagcaatgccatctccggagcactggggataaaatacagcttctgataatgatcctg1860gcacgcggcgcgccccttggtgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttc1920ccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctc1980ggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcg2040cggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacac2100gacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctc2160actgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgattt2220aaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgac2280caaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccttaataagatgatc2340ttcttgagatcgttttggtctgcgcgtaatctcttgctctgaaaacgaaaaaaccgcctt2400gcagggcggtttttcgaaggttctctgagctaccaactctttgaaccgaggtaactggct2460tggaggagcgcagtcaccaaaacttgtcctttcagtttagccttaaccggcgcatgactt2520caagactaactcctctaaatcaattaccagtggctgctgccagtggtgcttttgcatgtc2580tttccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcggactgaacgg2640ggggttcgtgcatacagtccagcttggagcgaactgcctacccggaactgagtgtcaggc2700gtggaatgagacaaacgcggccataacagcggaatgacaccggtaaaccgaaaggcagga2760acaggagagcgcacgagggagccgccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtc2820gggtttcgccaccactgatttgagcgtcagatttcgtgatgcttgtcaggggggcggagc2880ctatggaaaaacggctttgccgcggccctctcacttccctgttaagtatcttcctggcat2940cttccaggaaatctccgccccgttcgtaagccatttccgctcgccgcagtcgaacgaccg3000agcgtagcgagtcagtgagcgaggaagcggaatatatcctgtatcacatattctgctgac3060gcaccggtgcagccttttttctcctgccacatgaagcacttcactgacaccctcatcagt3120gccaacatagtaagccagtatacactccgctagcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggt3180gttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagcca3240cggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgcc3300acggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagtt3360cgatttattcaacaaagccacgttgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagat3420aaaaatatatcatcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggt3480gttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgagtatccgctcatgagattatcaa3540aaaggatcttcacctagatccttttgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataag3600atcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaat3660ggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaaca3720ttttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatat3780tacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattca3840cattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggagtttcgtatggcaatgaaagacggtga3900gctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaac3960gttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattc4020gcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaa4080tatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggc4140caatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcga4200caaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgt4260cggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatt4320tttttaaggcgacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgccc4380ggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcaga4440gtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttc4500tgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccg4560cgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtct4620ggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactggg4680tgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggt4740gcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgacca4800ggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctc4860tgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgt4920ggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttc4980tgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattca5040gccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgca5100aatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgct5160gggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagt5220gggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaaca5280ggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggcca5340ggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggc5400gcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacg5460acaggtttcccgactggaaagcgggcaagtgagtggataaccgtattaccgcctttgagt5520gagctgataccgggaattctcactcattaggcaccccaggc5561<210>13<211>6242<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>paida-1_cbm-纳米抗体<400>13tttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttca60cacaggaaagcttcatatgaataaggcctacagtatcatttggagccactccagacaggc120ctggattgtggcctcagagttagccagaggacatggttttgtccttgcaaaaaatacact180gctggtattggcggttgtttccacaatcggaaatgcatttgcagtcgaccaccatcacca240tcaccatctggaagcgctgttccagggtccgggtaccgttcagctggttgaaagcggtgg300tgcactggttcagcctggtggtagcctgcgtctgagctgtgcagcaagcggttttccggt360taatcgttatagcatgcgttggtatcgtcaggcaccgggtaaagaacgtgaatgggttgc420aggtatgagcagtgccggtgatcgtagcagctacgaagatagcgttaaaggtcgttttac480catcagccgtgatgatgcacgtaataccgtttatctgcaaatgaatagcctgaaaccgga540agataccgcagtgtattattgcaacgttaacgtgggctttgaatattggggtcagggcac600ccaggttaccgttagcagcaaactcgagcggccgcatcgtgacgcgtcgtctggtcctgc660cggctgccaagtcctttggggcgtgaatcagtggaacacaggtttcacggcgaatgttac720cgtcaagaatacgtcctccgctcctgttgacggctggaccttgaccttcagtttcccatc780aggacaacaagtcactcaagcctggtcatctaccgtgacccagagtggatctgcggtcac840agtacgtaacgctccgtggaacggttcgattcccgcgggcgggactgctcagttcgggtt900taacggaagccacactggcactaatgctgcaccaactgccttctcacttaacggcacgcc960gtgcaccgtaggcgagctcgaaaacctgtacttccagggtgaacagaaactgattagcga1020agaagatctgtctagagtgaataacaatggaagcattgtcattaataacagcattataaa1080cgggaatattacgaatgatgctgacttaagttttggtacagcaaagctgctctctgctac1140agtgaatggtagtcttgttaataacaaaaatatcattcttaatcctacaaaagaaagtgc1200ggccgctataggtaatactcttaccgtgtcaaattatactgggacaccgggaagtgttat1260ttctcttggtggtgtgcttgaaggagataattcacttacggaccgtctggtggtgaaagg1320taatacctctggtcaaagtgacatcgtttatgtcaatgaagatggcagtggtggtcagac1380gagagatggtattaatattatttctgtagagggaaattctgatgcagaattctctctgaa1440gaaccgcgtagttgccggagcttatgattacacactgcagaaaggaaacgagagtgggac1500agataataagggatggtatttaaccagtcatcttcccacatctgatacccggcaatacag1560accggagaacggaagttatgctaccaatatggcactggctaactcactgttcctcatgga1620tttgaatgagcgtaagcaattcagggccatgagtgataatacacagcctgagtctgcatc1680cgtgtggatgaagatcactggaggaataagctctggtaagctgaatgacgggcaaaataa1740aacaacaaccaatcagtttatcaatcagctcgggggggatatttataaattccatgctga1800acaactgggtgattttaccttagggattatgggaggatacgcgaatgcaaaaggtaaaac1860gataaattacacgagcaacaaagctgccagaaacacactggatggttattctgtcggggt1920atacggtacgtggtatcagaatggggaaaatgcaacagggctctttgctgaaacttggat1980gcaatataactggtttaatgcatcagtgaaaggtgacggactggaagaagaaaaatataa2040tctgaatggtttaaccgcttctgcaggtgggggatataacctgaatgtgcacacatggac2100atcacctgaaggaataacaggtgaattctggttacagcctcatttgcaggctgtctggat2160gggggttacaccggatacacatcaggaggataacggaacggtggtgcagggagcagggaa2220aaataatattcagacaaaagcaggtattcgtgcatcctggaaggtgaaaagcaccctgga2280taaggataccgggcggaggttccgtccgtatatagaggcaaactggatccataacactca2340tgaatttggtgttaaaatgagtgatgacagccagttgttgtcaggtagccgaaatcaggg2400agagataaagacaggtattgaaggggtgattactcaaaacttgtcagtgaatggcggagt2460cgcatatcaggcaggaggtcacgggagcaatgccatctccggagcactggggataaaata2520cagcttctgataatgatcctggcacgcggcgcgccccttggtgcgcaaactattaactgg2580cgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagt2640tgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctgg2700agccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctc2760ccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagaca2820gatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactc2880atatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagat2940cctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtc3000agaccccttaataagatgatcttcttgagatcgttttggtctgcgcgtaatctcttgctc3060tgaaaacgaaaaaaccgccttgcagggcggtttttcgaaggttctctgagctaccaactc3120tttgaaccgaggtaactggcttggaggagcgcagtcaccaaaacttgtcctttcagttta3180gccttaaccggcgcatgacttcaagactaactcctctaaatcaattaccagtggctgctg3240ccagtggtgcttttgcatgtctttccgggttggactcaagacgatagttaccggataagg3300cgcagcggtcggactgaacggggggttcgtgcatacagtccagcttggagcgaactgcct3360acccggaactgagtgtcaggcgtggaatgagacaaacgcggccataacagcggaatgaca3420ccggtaaaccgaaaggcaggaacaggagagcgcacgagggagccgccagggggaaacgcc3480tggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccaccactgatttgagcgtcagatttcgtga3540tgcttgtcaggggggcggagcctatggaaaaacggctttgccgcggccctctcacttccc3600tgttaagtatcttcctggcatcttccaggaaatctccgccccgttcgtaagccatttccg3660ctcgccgcagtcgaacgaccgagcgtagcgagtcagtgagcgaggaagcggaatatatcc3720tgtatcacatattctgctgacgcaccggtgcagccttttttctcctgccacatgaagcac3780ttcactgacaccctcatcagtgccaacatagtaagccagtatacactccgctagcgctga3840ggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatcc3900agccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtg3960attttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctga4020tccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccacgttgtgtctcaaaatctc4080tgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactgtctgcttac4140ataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgagt4200atccgctcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttgtaagaggttccaa4260ctttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttc4320aggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatc4380ccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataa4440ccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaa4500gttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggagtttcg4560tatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgt4620tttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccg4680gcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctattt4740ccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcac4800cagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatggg4860caaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgc4920cgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatga4980gtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcgacaccatcgaatggcgcaaaacctttcg5040cggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagt5100aacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggt5160gaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcgga5220gctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgat5280tggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaa5340atctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgt5400cgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcat5460taactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttcc5520ggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatga5580agacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgct5640gttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaata5700tctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtc5760cggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggt5820tgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgt5880tggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatccc5940gccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgctt6000gctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggt6060gaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccga6120ttcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcaagtgagtggata6180accgtattaccgcctttgagtgagctgataccgggaattctcactcattaggcaccccag6240gc6242<210>14<211>4341<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>pet-9a<400>14ttctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagtttatcacagttaaa60ttgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcatcgtcatcctcgg120caccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctctt180gcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctata240tgcgttgatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccg300ccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgac360cacacccgtcctgtggatatccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaaga420cccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaact480cagcttcctttcgggctttgttagcagccggatccgcgacccatttgctgtccaccagtc540atgctagccatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagagggaaac600cgttgtggtctccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctct660acgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctata720tcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtt780tcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgc840atgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcc900taatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccag960tcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttct1020ttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggacc1080gctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacg1140ccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggcca1200ttatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcgag1260gctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgt1320tgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggatcgc1380tcgcggctcttaccagcctaacttcgatcactggaccgctgatcgtcacggcgatttatg1440ccgcctcggcgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctataccttg1500tctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatggaag1560ccggcggcacctcgctaacggattcaccactccaagaattggagccaatcaattcttgcg1620gagaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgccatctc1680cagcagccgcacgcggcgcatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgat1740cgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaa1800tgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctg1860agcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtc1920agcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtgg1980aacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtc2040ccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttc2100atcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccat2160gaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaa2220catggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctgga2280cgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccg2340cagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccgga2400gacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtc2460agcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagt2520gtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgc2580ggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgctt2640cctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcact2700caaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgag2760caaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccata2820ggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacc2880cgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctg2940ttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgc3000tttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgg3060gctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtc3120ttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacagga3180ttagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacg3240gctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaa3300aaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttg3360tttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatctttt3420ctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaaca3480ataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgg3540gaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtat3600aaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaag3660cccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttaca3720gatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcat3780tttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagca3840ttccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtg3900ttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgta3960tttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgatttt4020gatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttg4080ccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttattttt4140gacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgatac4200caggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacgg4260ctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatg4320ctcgatgagtttttctaagaa4341<210>15<211>4981<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>pgex-6p-1_nogst<400>15acgttatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtg60gtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgt120tctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagc180tgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttca240cacaggaaacagtattctcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaac300ccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcg360atgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttc420cttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatag480ctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttg540aaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttg600aaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatc660gtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgt720atgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaat780tagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatcca840gcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatc900ctccaaaatcggatctggaagttctgttccaggggcccctgggatccccggaattcccgg960gtcgactcgagcggccgcatcgtgactgactgacgatctgcctcgcgcgtttcggtgatg1020acggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcgg1080atgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcg1140cagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtataattcttgaagacgaaagggcc1200tcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcag1260gtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacatt1320caaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaa1380ggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcatttt1440gccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagt1500tgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagtt1560ttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcgg1620tattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcaga1680atgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaa1740gagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctga1800caacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaa1860ctcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgaca1920ccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactactta1980ctctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccac2040ttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagc2100gtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtag2160ttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgaga2220taggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatacttt2280agattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgata2340atctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtag2400aaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa2460caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactcttt2520ttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagc2580cgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaa2640tcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaa2700gacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagc2760ccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaa2820gcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaa2880caggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcg2940ggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc3000tatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttg3060ctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttg3120agtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgagg3180aagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacacc3240gcataaattccgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcc3300cggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcag3360agtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgttt3420ctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaacc3480gcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtc3540tggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgg3600gtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcgg3660tgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgacc3720aggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtct3780ctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcg3840tggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagtt3900ctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattc3960agccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgc4020aaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgc4080tgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtag4140tgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaac4200aggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggcc4260aggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctgg4320cgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcac4380gacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctc4440actcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaatt4500gtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggc4560cgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgc4620agcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttc4680ccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagc4740ggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctc4800aaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattac4860ggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaa4920tgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttggaat4980t4981<210>16<211>7321<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>pgex-6p-1_nogst_brk-cbm<400>16acgttatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtg60gtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgt120tctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagc180tgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttca240cacaggaaacagtattctcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaac300ccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcg360atgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttc420cttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatag480ctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttg540aaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttg600aaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatc660gtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgt720atgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaat780tagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatcca840gcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatc900ctccaaaatcggatctggaagttctgttccaggggcccctgggatccatgtatctggatc960gctttcgccagtgcccgagcagcctgcagattccgcgcagcgcgtggcgcctgcatgcgc1020tggcggcggcgctggcgctggcgggcatggcgcgcctggcgccggcggcggcgcaggcgc1080cgcagccgccggtggcgggcgcgccgcatgcgcaggatgcgggccaccatcaccatcacc1140atgttcagctggttgaaagcggtggtgcactggttcagcctggtggtagcctgcgtctga1200gctgtgcagcaagcggttttccggttaatcgttatagcatgcgttggtatcgtcaggcac1260cgggtaaagaacgtgaatgggttgcaggtatgagcagtgccggtgatcgtagcagctacg1320aagatagcgttaaaggtcgttttaccatcagccgtgatgatgcacgtaataccgtttatc1380tgcaaatgaatagcctgaaaccggaagataccgcagtgtattattgcaacgttaacgtgg1440gctttgaatattggggtcagggcacccaggttaccgttagcagcaaactcgagcggccgc1500atcgtgacgcgtcgtctggtcctgccggctgccaagtcctttggggcgtgaatcagtgga1560acacaggtttcacggcgaatgttaccgtcaagaatacgtcctccgctcctgttgacggct1620ggaccttgaccttcagtttcccatcaggacaacaagtcactcaagcctggtcatctaccg1680tgacccagagtggatctgcggtcacagtacgtaacgctccgtggaacggttcgattcccg1740cgggcgggactgctcagttcgggtttaacggaagccacactggcactaatgctgcaccaa1800ctgccttctcacttaacggcacgccgtgcaccgtaggcgaacagaaactgattagcgaag1860aagatctggaaaacctgtacttccagggtgcgggcattagcctgagcgtggcgagcggcg1920cggcgtggcatggcgcgacccaggtgctgcagagcgcgaccctgggcaaaggcggcacct1980gggtggtgaacgcggatagccgcgtgcaggatatgagcatgcgcggcggccgcgtggaat2040ttcaggcgccggcgccggaagcgagctataaaaccctgaccctgcagaccctggatggca2100acggcgtgtttgtgctgaacaccaacgtggcggcgggccagaacgatcagctgcgcgtga2160ccggccgcgcggatggccagcatcgcgtgctggtgcgcaacgcgggcggcgaagcggata2220gccgcggcgcgcgcctgggcctggtgcatacccagggccagggcaacgcgacctttcgcc2280tggcgaacgtgggcaaagcggtggatctgggcacctggcgctatagcctggcggaagatc2340cgaaaacccatgtgtggagcctgcagcgcgcgggccaggcgctgagcggcgcggcgaacg2400cggcggtgaacgcggcggatctgagcagcattgcgctggcggaaagcaacgcgctggata2460aacgcctgggcgaactgcgcctgcgcgcggatgcgggcggcccgtgggcgcgcaccttta2520gcgaacgccagcagattagcaaccgccatgcgcgcgcgtatgatcagaccgtgagcggcc2580tggaaattggcctggatcgcggctggagcgcgagcggcggccgctggtatgcgggcggcc2640tgctgggctatacctatgcggatcgcacctatccgggcgatggcggcggcaaagtgaaag2700gcctgcatgtgggcggctatgcggcgtatgtgggcgatggcggctattatctggataccg2760tgctgcgcctgggccgctatgatcagcagtataacattgcgggcaccgatggcggccgcg2820tgaccgcggattatcgcaccagcggcgcggcgtggagcctggaaggcggccgccgctttg2880aactgccgaacgattggtttgcggaaccgcaggcggaagtgatgctgtggcgcaccagcg2940gcaaacgctatcgcgcgagcaacggcctgcgcgtgaaagtggatgcgaacaccgcgaccc3000tgggccgcctgggcctgcgctttggccgccgcattgcgctggcgggcggcaacattgtgc3060agccgtatgcgcgcctgggctggacccaggaatttaaaagcaccggcgatgtgcgcacca3120acggcattggccatgcgggcgcgggccgccatggccgcgtggaactgggcgcgggcgtgg3180atgcggcgctgggcaaaggccataacctgtatgcgagctatgaatatgcggcgggcgatc3240gcattaacattccgtggagctttcatgcgggctatcgctatagcttttgagaattcccgg3300gtcgactcgagcggccgcatcgtgactgactgacgatctgcctcgcgcgtttcggtgatg3360acggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcgg3420atgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcg3480cagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtataattcttgaagacgaaagggcc3540tcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcag3600gtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacatt3660caaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaa3720ggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcatttt3780gccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagt3840tgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagtt3900ttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcgg3960tattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcaga4020atgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaa4080gagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctga4140caacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaa4200ctcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgaca4260ccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactactta4320ctctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccac4380ttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagc4440gtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtag4500ttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgaga4560taggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatacttt4620agattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgata4680atctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtag4740aaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa4800caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactcttt4860ttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagc4920cgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaa4980tcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaa5040gacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagc5100ccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaa5160gcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaa5220caggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcg5280ggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc5340tatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttg5400ctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttg5460agtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgagg5520aagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacacc5580gcataaattccgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcc5640cggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcag5700agtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgttt5760ctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaacc5820gcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtc5880tggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgg5940gtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcgg6000tgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgacc6060aggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtct6120ctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcg6180tggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagtt6240ctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattc6300agccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgc6360aaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgc6420tgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtag6480tgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaac6540aggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggcc6600aggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctgg6660cgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcac6720gacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctc6780actcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaatt6840gtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggc6900cgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgc6960agcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttc7020ccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagc7080ggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctc7140aaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattac7200ggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaa7260tgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttggaat7320t7321<210>17<211>6283<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>pgex-6p-1_nogst_inak-cbm<400>17acgttatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtg60gtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgt120tctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagc180tgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttca240cacaggaaacagtattctcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaac300ccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcg360atgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttc420cttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatag480ctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttg540aaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttg600aaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatc660gtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgt720atgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaat780tagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatcca840gcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatc900ctccaaaatcggatctggaagttctgttccaggggcccctgggatccatggtcttagaca960aggcgctagttctacgtacctgcgctaataatatggccgatcactgcggcttgatttggc1020ctgcctcagggaccgtcgagtcaaggtattggcaatctacacgtcgtcacgagaacggac1080tggtaggtcttctttggggagcaggaacttctgctttcttgtcagtccatgcagacgccc1140gctggatcgtgtgcgaagtggctgttgccgatattatctccctagaggagcccggaatgg1200ttaaatttcctcgggccgaagtggtgcatgtgggcgatcgaatcagcgcttctcatttta1260tttcggcgcggcaggcagatcccgcgagtacgagtacttcaacgtcgacaagtactctta1320ctcccatgcccacggcaatccccacccctatgccagcggtggcgtcagtgacgttaccgg1380tggctgagcaagcgcggcatgaggtgtttgatgtagctagtgtgagcgccgcggctgctc1440ccgtgaacactttacctgtcacgacaccccaaaacctccagacggaaaacctgtacttcc1500agggtgcgtcgtctggtcctgccggctgccaagtcctttggggcgtgaatcagtggaaca1560caggtttcacggcgaatgttaccgtcaagaatacgtcctccgctcctgttgacggctgga1620ccttgaccttcagtttcccatcaggacaacaagtcactcaagcctggtcatctaccgtga1680cccagagtggatctgcggtcacagtacgtaacgctccgtggaacggttcgattcccgcgg1740gcgggactgctcagttcgggtttaacggaagccacactggcactaatgctgcaccaactg1800ccttctcacttaacggcacgccgtgcaccgtaggccaccatcaccatcaccatgttcagc1860tggttgaaagcggtggtgcactggttcagcctggtggtagcctgcgtctgagctgtgcag1920caagcggttttccggttaatcgttatagcatgcgttggtatcgtcaggcaccgggtaaag1980aacgtgaatgggttgcaggtatgagcagtgccggtgatcgtagcagctacgaagatagcg2040ttaaaggtcgttttaccatcagccgtgatgatgcacgtaataccgtttatctgcaaatga2100atagcctgaaaccggaagataccgcagtgtattattgcaacgttaacgtgggctttgaat2160attggggtcagggcacccaggttaccgttagcagcaaactcgagcggccgcatcgtgacg2220aacagaaactgattagcgaagaagatctgtgagaattcccgggtcgactcgagcggccgc2280atcgtgactgactgacgatctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgac2340acatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaag2400cccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcac2460gtagcgatagcggagtgtataattcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttt2520tataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaa2580atgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctca2640tgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattc2700aacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctc2760acccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggtt2820acatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgtt2880ttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacg2940ccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtact3000caccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctg3060ccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccga3120aggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttggg3180aaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaa3240tggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaac3300aattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttc3360cggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatca3420ttgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacgggga3480gtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgatta3540agcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttc3600atttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcc3660cttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatctt3720cttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctac3780cagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggct3840tcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccact3900tcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctg3960ctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggata4020aggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacga4080cctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaag4140ggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgaggg4200agcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgac4260ttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagca4320acgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctg4380cgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctc4440gccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctga4500tgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcataaattccgacacca4560tcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattca4620gggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctctt4680atcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaa4740aagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactgg4800cgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgt4860cgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgt4920cgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgc4980aacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtgg5040aagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatca5100acagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcat5160tgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgc5220gtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacggg5280aaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggca5340tcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgcca5400ttaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccg5460aagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctgg5520ggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatc5580agctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccg5640cctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactgg5700aaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccag5760gctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaattt5820cacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcg5880tgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgc5940cagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcct6000gaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggct6060ggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacgg6120ttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattacggtcaatccgccgtttgt6180tcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggct6240acaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttggaatt6283<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物f2mincko<400>18aacaacaataatgcgtgccat21<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物r2mincko<400>19gcgctggcgatgattaatag20<210>20<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物f9mincko<400>20agtaacaacaataatgcgtgcc22<210>21<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物r9mincko<400>21cgcgctggcgatgatt16<210>22<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物f7mindko<400>22ttccgcgagagaaagaaatcg21<210>23<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物r7mindko<400>23gaccgttcaaccgttaaattgat23<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物f10mindko<400>24ctgtgtttttcttccgcgag20<210>25<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物r10mindko<400>25tcaaccgttaaattgatcccttttt25<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物f6mincdko<400>26tccgcgagagaaagaaatcg20<210>27<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物r6mincdko<400>27cgcgctggcgatgatta17<210>28<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物f9mincdko<400>28ctgtgtttttcttccgcgag20<210>29<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物r9mincdko<400>29cgcgctggcgatgatt16<210>30<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物3'mincko_1<400>30ggccggataaaacttgtgct20<210>31<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物3'mincko_2<400>31agtcttcggaacatcatcgc20<210>32<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物5'mincko_1<400>32ccctttgcccgaagtaacaa20<210>33<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物5'mincko_2<400>33acggtgaaaacctggcctat20<210>34<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物minc_check_4_1<400>34tcaatttaacggttgaacggtca23<210>35<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物minc_check_4_2<400>35atgtcaaacacgccaatcga20<210>36<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物mind_check_2_1<400>36ttatcctccgaacaagcgtttga23<210>37<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成引物mind_check_2_2<400>37atggcacgcattattgttgttac23<210>38<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>扩增dsrna盒1<400>38gttttcccagtcacgacgtt20<210>39<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>扩增dsrna盒2<400>39agcgagtcagtgagcgag18<210>40<211>601<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>秀丽隐杆线虫ubc9靶标<400>40taatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatc60gataagcttgatatctgtcgggaattgctgcaggacgcctcgcggaagaaaggaaacact120ggcgaaaggatcatccattcggattcattgccaaaccagtcaagaacgccgacggaacat180tgaacctcttcaattgggaatgtgcaatcccagggagaaaggatacgatttgggaaggcg240gattatacagaattcggatgctcttcaaggacgatttcccgtcaacgccaccaaagtgca300agttcgagccaccactcttccatccaaatgtgtacccatcaggtaccgtgtgcttatctc360ttctggatgaaaacaaggattggaagccgtcaatctcaatcaagcaacttctcattggaa420ttcaagatttgctgaaccatccaaatattgaagatccagctcaggctgaagcctatcaga480tctactgtcagaatagggctgaatatgagaagcgagtgaagaaggaagctgtgaagtatg540ctgccgaactcgtccagaagcgatatcagatctgccggtctccctatagtgagtcgtatt600a601<210>41<211>412<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>科罗拉多马铃薯甲虫b-肌动蛋白靶标<400>41taatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatc60gataagcttgatatcgcacgaggtttttctgtctagtgagcagtgtccaacctcaaaaga120caacatgtgtgacgacgatgtagcggctcttgtcgtagacaatggatccggtatgtgcaa180agccggtttcgcaggagatgacgcaccccgtgccgtcttcccctcgatcgtcggtcgccc240aaggcatcaaggagtcatggtcggtatgggacaaaaggactcatacgtaggagatgaagc300ccaaagcaaaagaggtatcctcaccctgaaataccccatcgaacacggtatcatcaccaa360ctgggatgacatgatatcagatctgccggtctccctatagtgagtcgtatta412<210>42<211>3168<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>l4440秀丽隐杆线虫载体<400>42gtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttg60gtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccg120gcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgca180gaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtgga240acgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctaga300tccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggt360ctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgtt420catccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccat480ctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcag540caataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcct600ccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtt660tgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg720cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgca780aaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgt840tatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagat900gcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgac960cgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaa1020aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgt1080tgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactt1140tcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataa1200gggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcattt1260atcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaa1320taggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctaaattgtaagcgttaatatttt1380gttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaat1440cggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagt1500ttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgt1560ctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgag1620gtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacgggg1680aaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggc1740gctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgcc1800gctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggt1860gcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaag1920ttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgc1980gtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtat2040cgataagcttgatatctgtcgggaattgctgcaggacgcctcgcggaagaaaggaaacac2100tggcgaaaggatcatccattcggattcattgccaaaccagtcaagaacgccgacggaaca2160ttgaacctcttcaattgggaatgtgcaatcccagggagaaaggatacgatttgggaaggc2220ggattatacagaattcggatgctcttcaaggacgatttcccgtcaacgccaccaaagtgc2280aagttcgagccaccactcttccatccaaatgtgtacccatcaggtaccgtgtgcttatct2340cttctggatgaaaacaaggattggaagccgtcaatctcaatcaagcaacttctcattgga2400attcaagatttgctgaaccatccaaatattgaagatccagctcaggctgaagcctatcag2460atctactgtcagaatagggctgaatatgagaagcgagtgaagaaggaagctgtgaagtat2520gctgccgaactcgtccagaagcgatatcagatctgccggtctccctatagtgagtcgtat2580taatttcgataagccaggttgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggc2640tgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcagggg2700ataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaagg2760ccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgac2820gctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctg2880gaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcct2940ttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcgg3000tgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgct3060gcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccac3120tggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcg3168<210>43<211>2979<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>l4440cpbb-肌动蛋白载体序列<400>43gtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttg60gtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccg120gcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgca180gaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtgga240acgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctaga300tccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggt360ctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgtt420catccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccat480ctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcag540caataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcct600ccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtt660tgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg720cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgca780aaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgt840tatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagat900gcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgac960cgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaa1020aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgt1080tgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactt1140tcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataa1200gggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcattt1260atcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaa1320taggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctaaattgtaagcgttaatatttt1380gttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaat1440cggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagt1500ttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgt1560ctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgag1620gtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacgggg1680aaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggc1740gctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgcc1800gctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggt1860gcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaag1920ttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgc1980gtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtat2040cgataagcttgatatcgcacgaggtttttctgtctagtgagcagtgtccaacctcaaaag2100acaacatgtgtgacgacgatgtagcggctcttgtcgtagacaatggatccggtatgtgca2160aagccggtttcgcaggagatgacgcaccccgtgccgtcttcccctcgatcgtcggtcgcc2220caaggcatcaaggagtcatggtcggtatgggacaaaaggactcatacgtaggagatgaag2280cccaaagcaaaagaggtatcctcaccctgaaataccccatcgaacacggtatcatcacca2340actgggatgacatgatatcagatctgccggtctccctatagtgagtcgtattaatttcga2400taagccaggttgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgag2460cggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcag2520gaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgc2580tggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtc2640agaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccc2700tcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctccctt2760cgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcg2820ttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttat2880ccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcag2940ccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcg2979<210>44<211>3981<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>brk-acc脱氨酶表达盒<400>44ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcaca60caggaaacagtattctcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaaccc120actcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgat180gaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttcct240tattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagct300gacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaa360ggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaa420actctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgt480ttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtat540gacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaatta600gtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagc660aagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcct720ccaaaatcggatctggaagttctgttccaggggcccctgggatccatgtatctggatcgc780tttcgccagtgcccgagcagcctgcagattccgcgcagcgcgtggcgcctgcatgcgctg840gcggcggcgctggcgctggcgggcatggcgcgcctggcgccggcggcggcgcaggcgccg900cagccgccggtggcgggcgcgccgcatgcgcaggatgcgggccaccatcaccatcaccat960gttcagctggttgaaagcggtggtgcactggttcagcctggtggtagcctgcgtctgagc1020tgtgcagcaagcggttttccggttaatcgttatagcatgcgttggtatcgtcaggcaccg1080ggtaaagaacgtgaatgggttgcaggtatgagcagtgccggtgatcgtagcagctacgaa1140gatagcgttaaaggtcgttttaccatcagccgtgatgatgcacgtaataccgtttatctg1200caaatgaatagcctgaaaccggaagataccgcagtgtattattgcaacgttaacgtgggc1260tttgaatattggggtcagggcacccaggttaccgttagcagcaaactcgagcggccgcat1320cgtgacatgcgcggacgctcactgacgctgagccgcgtaaagttggaactggcccgccgc1380tccatgtcggctacttcagtgcctagcatggcggacttcttgaccaagaaaccctattcc1440cctccctcatgggcatcacacttacgccctttacctagccataccttctcgctggcccat1500cttccgaccccgattcaccgctggaatcttcccggtctgccgaatgggactgagttatgg1560attaagcgcgacgatttcacgggtatggaattgtcgggtaacaaagttcgtaaattggag1620tttcttatggccgaagcggtggaccaacatgccgacacagttatcaccatcggtggcatt1680cagagtaatcactgccgtgctaccgcgacggcgtcgaattatcttaacctgaattcgcac1740ttgattcttcgcacatccaaactgctggctgacgaagatcctgggttggttggcaacctt1800ctggtggagcgcctggtaggggccaacgttcatcttatttcgaaggaggagtatagttca1860attgggtccgaagctttgaccaacgcactgaaagagaagttagagaaagagggaaaaaag1920ccctatgtcatccccgtcggtggctctaactccctgggtacatggggttatatcgaagcc1980gctcgtgagattgaagaacagttgaactatcgcccggatgacttaaaatttgatgatatt2040gttgtggcttgtggtagcggtggcactatcgcgggcatttctctgggttcatggttaggg2100gcattgaaggccaaagtccacgctttttctgtatgtgatgacccggactacttttacgat2160ttcgtgcaggggctgcttgacggtttgcatgcaggcgtgaattctcgtgacattgttaat2220attcacaatgctaagggtaagggatacgccatgaacacgagcgaagaattggagtttgtg2280aagaaggtggcctcgtctactggagtgattctggatccagtttactccggtaaagccgct2340tatggcttgattaacgaaatcaccaaagatcccaagtgctgggaggggcgtaaaatcctt2400ttcattcatacgggcggtttgcttggcttatatgataaagttgaccaaatggcatccctt2460atgggaaactggagtcgcatggatgtcagcgaatccgtcccacgcaaggacggtgttggc2520aagatgttcgaacagaaactgattagcgaagaagatctggaaaacctgtacttccagggt2580gcgggcattagcctgagcgtggcgagcggcgcggcgtggcatggcgcgacccaggtgctg2640cagagcgcgaccctgggcaaaggcggcacctgggtggtgaacgcggatagccgcgtgcag2700gatatgagcatgcgcggcggccgcgtggaatttcaggcgccggcgccggaagcgagctat2760aaaaccctgaccctgcagaccctggatggcaacggcgtgtttgtgctgaacaccaacgtg2820gcggcgggccagaacgatcagctgcgcgtgaccggccgcgcggatggccagcatcgcgtg2880ctggtgcgcaacgcgggcggcgaagcggatagccgcggcgcgcgcctgggcctggtgcat2940acccagggccagggcaacgcgacctttcgcctggcgaacgtgggcaaagcggtggatctg3000ggcacctggcgctatagcctggcggaagatccgaaaacccatgtgtggagcctgcagcgc3060gcgggccaggcgctgagcggcgcggcgaacgcggcggtgaacgcggcggatctgagcagc3120attgcgctggcggaaagcaacgcgctggataaacgcctgggcgaactgcgcctgcgcgcg3180gatgcgggcggcccgtgggcgcgcacctttagcgaacgccagcagattagcaaccgccat3240gcgcgcgcgtatgatcagaccgtgagcggcctggaaattggcctggatcgcggctggagc3300gcgagcggcggccgctggtatgcgggcggcctgctgggctatacctatgcggatcgcacc3360tatccgggcgatggcggcggcaaagtgaaaggcctgcatgtgggcggctatgcggcgtat3420gtgggcgatggcggctattatctggataccgtgctgcgcctgggccgctatgatcagcag3480tataacattgcgggcaccgatggcggccgcgtgaccgcggattatcgcaccagcggcgcg3540gcgtggagcctggaaggcggccgccgctttgaactgccgaacgattggtttgcggaaccg3600caggcggaagtgatgctgtggcgcaccagcggcaaacgctatcgcgcgagcaacggcctg3660cgcgtgaaagtggatgcgaacaccgcgaccctgggccgcctgggcctgcgctttggccgc3720cgcattgcgctggcgggcggcaacattgtgcagccgtatgcgcgcctgggctggacccag3780gaatttaaaagcaccggcgatgtgcgcaccaacggcattggccatgcgggcgcgggccgc3840catggccgcgtggaactgggcgcgggcgtggatgcggcgctgggcaaaggccataacctg3900tatgcgagctatgaatatgcggcgggcgatcgcattaacattccgtggagctttcatgcg3960ggctatcgctatagcttttga3981<210>45<211>8194<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>pgex-6p-1_brk-acc脱氨酶载体<400>45acgttatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtg60gtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgt120tctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagc180tgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttca240cacaggaaacagtattctcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaac300ccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcg360atgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttc420cttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatag480ctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttg540aaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttg600aaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatc660gtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgt720atgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaat780tagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatcca840gcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatc900ctccaaaatcggatctggaagttctgttccaggggcccctgggatccatgtatctggatc960gctttcgccagtgcccgagcagcctgcagattccgcgcagcgcgtggcgcctgcatgcgc1020tggcggcggcgctggcgctggcgggcatggcgcgcctggcgccggcggcggcgcaggcgc1080cgcagccgccggtggcgggcgcgccgcatgcgcaggatgcgggccaccatcaccatcacc1140atgttcagctggttgaaagcggtggtgcactggttcagcctggtggtagcctgcgtctga1200gctgtgcagcaagcggttttccggttaatcgttatagcatgcgttggtatcgtcaggcac1260cgggtaaagaacgtgaatgggttgcaggtatgagcagtgccggtgatcgtagcagctacg1320aagatagcgttaaaggtcgttttaccatcagccgtgatgatgcacgtaataccgtttatc1380tgcaaatgaatagcctgaaaccggaagataccgcagtgtattattgcaacgttaacgtgg1440gctttgaatattggggtcagggcacccaggttaccgttagcagcaaactcgagcggccgc1500atcgtgacatgcgcggacgctcactgacgctgagccgcgtaaagttggaactggcccgcc1560gctccatgtcggctacttcagtgcctagcatggcggacttcttgaccaagaaaccctatt1620cccctccctcatgggcatcacacttacgccctttacctagccataccttctcgctggccc1680atcttccgaccccgattcaccgctggaatcttcccggtctgccgaatgggactgagttat1740ggattaagcgcgacgatttcacgggtatggaattgtcgggtaacaaagttcgtaaattgg1800agtttcttatggccgaagcggtggaccaacatgccgacacagttatcaccatcggtggca1860ttcagagtaatcactgccgtgctaccgcgacggcgtcgaattatcttaacctgaattcgc1920acttgattcttcgcacatccaaactgctggctgacgaagatcctgggttggttggcaacc1980ttctggtggagcgcctggtaggggccaacgttcatcttatttcgaaggaggagtatagtt2040caattgggtccgaagctttgaccaacgcactgaaagagaagttagagaaagagggaaaaa2100agccctatgtcatccccgtcggtggctctaactccctgggtacatggggttatatcgaag2160ccgctcgtgagattgaagaacagttgaactatcgcccggatgacttaaaatttgatgata2220ttgttgtggcttgtggtagcggtggcactatcgcgggcatttctctgggttcatggttag2280gggcattgaaggccaaagtccacgctttttctgtatgtgatgacccggactacttttacg2340atttcgtgcaggggctgcttgacggtttgcatgcaggcgtgaattctcgtgacattgtta2400atattcacaatgctaagggtaagggatacgccatgaacacgagcgaagaattggagtttg2460tgaagaaggtggcctcgtctactggagtgattctggatccagtttactccggtaaagccg2520cttatggcttgattaacgaaatcaccaaagatcccaagtgctgggaggggcgtaaaatcc2580ttttcattcatacgggcggtttgcttggcttatatgataaagttgaccaaatggcatccc2640ttatgggaaactggagtcgcatggatgtcagcgaatccgtcccacgcaaggacggtgttg2700gcaagatgttcgaacagaaactgattagcgaagaagatctggaaaacctgtacttccagg2760gtgcgggcattagcctgagcgtggcgagcggcgcggcgtggcatggcgcgacccaggtgc2820tgcagagcgcgaccctgggcaaaggcggcacctgggtggtgaacgcggatagccgcgtgc2880aggatatgagcatgcgcggcggccgcgtggaatttcaggcgccggcgccggaagcgagct2940ataaaaccctgaccctgcagaccctggatggcaacggcgtgtttgtgctgaacaccaacg3000tggcggcgggccagaacgatcagctgcgcgtgaccggccgcgcggatggccagcatcgcg3060tgctggtgcgcaacgcgggcggcgaagcggatagccgcggcgcgcgcctgggcctggtgc3120atacccagggccagggcaacgcgacctttcgcctggcgaacgtgggcaaagcggtggatc3180tgggcacctggcgctatagcctggcggaagatccgaaaacccatgtgtggagcctgcagc3240gcgcgggccaggcgctgagcggcgcggcgaacgcggcggtgaacgcggcggatctgagca3300gcattgcgctggcggaaagcaacgcgctggataaacgcctgggcgaactgcgcctgcgcg3360cggatgcgggcggcccgtgggcgcgcacctttagcgaacgccagcagattagcaaccgcc3420atgcgcgcgcgtatgatcagaccgtgagcggcctggaaattggcctggatcgcggctgga3480gcgcgagcggcggccgctggtatgcgggcggcctgctgggctatacctatgcggatcgca3540cctatccgggcgatggcggcggcaaagtgaaaggcctgcatgtgggcggctatgcggcgt3600atgtgggcgatggcggctattatctggataccgtgctgcgcctgggccgctatgatcagc3660agtataacattgcgggcaccgatggcggccgcgtgaccgcggattatcgcaccagcggcg3720cggcgtggagcctggaaggcggccgccgctttgaactgccgaacgattggtttgcggaac3780cgcaggcggaagtgatgctgtggcgcaccagcggcaaacgctatcgcgcgagcaacggcc3840tgcgcgtgaaagtggatgcgaacaccgcgaccctgggccgcctgggcctgcgctttggcc3900gccgcattgcgctggcgggcggcaacattgtgcagccgtatgcgcgcctgggctggaccc3960aggaatttaaaagcaccggcgatgtgcgcaccaacggcattggccatgcgggcgcgggcc4020gccatggccgcgtggaactgggcgcgggcgtggatgcggcgctgggcaaaggccataacc4080tgtatgcgagctatgaatatgcggcgggcgatcgcattaacattccgtggagctttcatg4140cgggctatcgctatagcttttgagaattcccgggtcgactcgagcggccgcatcgtgact4200gactgacgatctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagc4260tcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagg4320gcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgata4380gcggagtgtataattcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggtta4440atgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcg4500gaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaat4560aaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttcc4620gtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaa4680cgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaac4740tggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatga4800tgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaag4860agcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtca4920cagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataacca4980tgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaa5040ccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagc5100tgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaa5160cgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatag5220actggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggct5280ggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcac5340tggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaa5400ctatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggt5460aactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaat5520ttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtg5580agttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatc5640ctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtgg5700tttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagag5760cgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaact5820ctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtg5880gcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagc5940ggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccg6000aactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaagg6060cggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccag6120ggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtc6180gatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcct6240ttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatccc6300ctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagcc6360gaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtatt6420ttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcataaattccgacaccatcgaatggt6480gcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtga6540atgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccg6600tttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaag6660cggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaac6720agtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattg6780tcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtag6840aacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtca6900gtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcct6960gcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtatta7020ttttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcacc7080agcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctg7140gctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgact7200ggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttccca7260ctgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagt7320ccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagct7380catgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaacca7440gcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgc7500ccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctcccc7560gcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggc7620agtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacac7680tttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacagga7740aacagctatgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactggga7800aaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcg7860taatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcga7920atggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcga7980tcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgc8040gcccatctacaccaacgtaacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacgga8100gaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaagg8160ccagacgcgaattatttttgatggcgttggaatt8194当前第1页12当前第1页12