本发明属于分子生物学领域，具体涉及一组检测范可尼贫血的生物标记及检测试剂盒。
背景技术：
：范可尼贫血是一种遗传性异质性疾病，以先天性躯体畸形、骨髓造血衰竭以及肿瘤易感性为主要特点。该病患者常伴有先天性身体畸形，常见骨骼畸形，也可有内脏畸形，眼、耳或生殖器畸形等；该病最严重的临床特征为血液系统的异常，患者多于出生或幼年发病，出现出血、感染、内分泌失调、免疫力低下等症状，进行性出现一系或者多系血细胞减少，极易发展为骨髓造血衰竭；另外，该病患者易患急性髓细胞性白血病(acutemyeloidleukemia，aml)及骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes，mds)等血液系统肿瘤及鳞状上皮癌、头颈部癌等非血液系统的实体瘤。范可尼贫血发病主要是由于互补群基因发生突变导致的dna损伤修复过程异常。该病较为罕见，临床表现具有高度异质性，且与其他疾病(全血细胞减少、再生障碍性贫血等)的某些症状相似，所以很难基于临床特征进行早期诊断。现阶段，范可尼贫血常规的诊断方法是染色体断裂实验。例如，auerbach等(fanconianemiadiagnosisandthediepoxybutane(deb)test.exphematol.1993,21:731-733.)使用双环氧丁烷(diepoxybutane，deb)进行dna交联检测；fernando等(diagnosisoffanconianemiainpatientswithbonemarrowfailure.haematologica.2009,94(4):487-495.)使用丝裂霉素c(mitomycinc，mmc)进行染色体稳定性检测。但这些常规检测方法常出现假阳性或假阴性结果，检测效率低。因此，我们需要一种准确检测范可尼贫血的技术。近年来，随着范可尼贫血分子发病基础研究取得的显著进展，目前已知发现了至少22种范可尼贫血的亚型，并成功克隆出22种相关基因：fanca、fancb、fancc等。研究者们发现可以通过相关基因的突变检测并明确易感基因，提高检测效率。其中分子生物学的实验方法主要有巢式pcr、一代测序等。但是pcr方法不能直观的得到具体的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。本发明通过二代高通量测序方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子以及相关序列；进行序列比对后，能够有效地与再生障碍性贫血等疾病进行区分，为临床医生辅助诊断范可尼贫血提供便利。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对目前范可尼贫血早期诊断的方法较为局限，特别是现有技术存在检测效率及准确率较低的问题。本发明提供的检测范可尼贫血的生物标记及检测试剂盒操作简单，检测效率及准确率高。一方面，本发明提供了一组检测范可尼贫血的生物标记，所述的生物标记为突变基因群，所述的突变基因群包括fanca基因、fancb基因、fancc基因、brca2基因、fancd2基因、fance基因、fancf基因、fancg基因、fanci基因、brip1基因、fancl基因、palb2基因、slx4基因、ercc4基因、ube2t基因、rad51基因、xrcc2基因、mad2l2基因和rad51c基因，共19个基因的突变基因的集合；所述的突变基因的外显子区域共携带155个突变位点；所述155个突变位点及其与所述19个基因的对应关系如表1所示。表1突变位点列表本发明提供了一种检测范可尼贫血的生物标记在制备检测范可尼贫血的试剂盒中的应用。所述的试剂盒包含用于检测上述的155个突变位点的试剂。本发明另一方面还提供了一种检测范可尼贫血的试剂盒，所述的试剂盒包括：用于检测上述的155个突变位点的试剂。所述的检测试剂包括用于扩增上述的155个突变位点的pcr引物如表2所示：表2pcr引物序列表所述的试剂盒还包括将基因组dna制成可供测序的文库的试剂，该种试剂为本领域常规使用试剂，只要能够满足pcr扩增对基因组dna质量的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，如使用二代测序dna快速建库试剂盒(iontorrent)，二代测序快速dna建库试剂盒(illumina)，ngs建库试剂盒(illumina)等。所述的试剂盒还包括用于二代测序的试剂，利用本发明提供的扩增引物，扩增得到的单个片段长度为275bp左右，结合二代测序技术，能够检测本发明所述突变基因群中的全部外显子区域。其中所述的用于二代测序的试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得，如：二代测序文库定量试剂盒，测序试剂试剂盒等。所述的试剂盒还包括dntp溶液、dna聚合酶、用于分离或纯化核酸的试剂、阳性对照或/和阴性对照。其中，所述的用于分离或纯化核酸的试剂为backman磁珠。其中，所述的阳性对照为本领域常规的阳性对照。优选地，所述的阳性对照为包含本发明所述突变基因群中突变基因序列的基因组dna储备液或包含相应突变基因群中突变基因序列的质粒。其中，所述的阴性对照为本领域常规的阴性对照。优选地，所述的阴性对照为源于健康人经确认不包含突变基因序列的野生型基因组dna序列储存液。所述的试剂盒的检测样本为外周血、骨髓和实体瘤样本中的一种或几种。优选地，所述的检测样本为外周血。一种本发明所述的试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：(1)利用本发明所述检测试剂盒抽提检测对象的外周血，提取基因组dna；(2)使用多重pcr引物，对样本的基因组dna进行外显子区域扩增，得到片段；(3)将步骤(2)中扩增所得的片段制成可供iontorrent测序平台测序的文库；(4)对步骤(3)中所得dna文库进行测序，得到下机数据；(5)对步骤(4)中的下机数据进行生物信息学分析，而后利用医学解读数据库进行解读做出诊断即可。本发明的有益效果在于：(1)本发明提供的可用于筛查范可尼贫血相关基因群的试剂盒，结合高通量测序技术，可以实现在形态学和流式细胞学之外对范可尼贫血进行辅助诊断，特别是对于疾病后续的治疗方向和效果做出预判具有特殊的优势。(2)本发明提供的检测范可尼贫血相关基因群的检测试剂盒具有检测效率高、检出率高等优点，使用该检测试剂盒所给出的医学解读报告更加准确、权威。具体实施方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1中国人群范可尼贫血突变基因群的筛选材料和方法：在中国医学科学院血液病医院和协和华美医学诊断中心2018年5月至2018年8月诊断的患者中，根据以下标准，我们进行连续性入组(12名)。入选标准：经临床症状和相关实验室检查符合全血细胞减少且怀疑为范可尼贫血的患者，并且临床医生筛选需要进行基因检测以进行辅助确认是否为范可尼贫血。12名患者的诊断结果如表3所示。表3患者诊断结果列表提取待测dna：收集3ml患者外周血提取基因组dna待测，该检测经过中国医学科学院血液病医院伦理委员会批准。样本处理：样本基因组的提取使用dna提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司，dp318-03)进行抽提，具体操作方法：(1)预处理：①在1.5ml的ep管中加入500μl全血，样品中加入800μl的细胞裂解液cl，颠倒混匀，10000rpm(～11500×g)离心1min；②吸去上清，留下细胞核沉淀；③向离心收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液gs，振荡至彻底混匀。(2)裂解细胞：①加入20μlproteinasek溶液，混匀；②加200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，使溶液变清亮。(3)dna沉淀及过柱吸附：①加200μl无水乙醇，立即充分颠倒混匀；②将①所得溶液和絮状沉淀加入吸附柱cb3中，12000rpm(～13400×g)离心30sec，将吸附柱cb3放入新收集管。(4)去蛋白、漂洗：①向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12000rpm(～13400×g)离心30sec，将吸附柱cb3放入新收集管；②向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm(～13400×g)离心30sec，将吸附柱cb3放入新收集管；③重复操作步骤②；④12000rpm(～13400×g)离心2min，将吸附柱cb3转入1.5mlep管中，将吸附柱cb3开盖置于生物安全柜中吹数分钟，晾干吸附材料中残余的漂洗液。(5)dna洗脱：①向吸附膜中间位置悬空滴加40μl提前预热的洗脱缓冲液tb，室温放置2-5min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中；②测量dna浓度。文库构建：选取19个范可尼相关基因的外显子编码区以及侧翼的部分内含子区域，利用ion扩增子测序文库构建试剂盒2.0-lv96(购自thermofisher)对基因组dna进行多重pcr方法建库，参考该试剂盒的使用说明书，具体步骤如下：(1)pcr扩增基因组dna的目标区域：①根据浓度向dna样本中加入纯水稀释至5ng/μl，包括pool1和pool2，分别建立反应体系：5*ionampliseqtmhifimix2μl、2*ionampliseqtmprimerpool5μl、基因组dna5ng/μl3μl，总体积10μl；②加盖后瞬时离心，振荡器混匀，再次瞬时离心，进行pcr，反应条件如下：99℃激活2min，99℃变性15sec、60℃退火/延伸4min、循环17个，维持10℃。(2)酶切：离心pcr管，将pool1反应液转移到pool2-pcr管中，加入1.9μl的fupareagent，密封后混匀，离心、轻柔涡旋再离心，酶切反应条件如下：50℃20min，55℃20min，60℃20min，10℃1h。(3)扩增有效文库：①溶解switchsloution，向每个酶切产物中加入相应体积的switchsolution和稀释好的barcode，组分如下：switchsolution4μl、barcode2μl，总体积28μl；②每孔加入2μl的dnaligase，混匀后反应条件如下：22℃30min，72℃10min，10℃1h(4)纯化未扩增的文库：①dna文库中每孔加入45μlampurebeads，1800rpm涡旋5min，室温放置5min，离心后将实验板移至磁力架上，放至澄清然后弃去上清，加入150μl新鲜70％的酒精，旋转ep管两圈或左右移动96孔板，弃去酒精；②重复一遍后风干磁珠；取下ep管加入100μl的lowte分散磁珠，柔涡旋混匀；③室温放置2min后移至磁力架上，待澄清后转移文库至干净ep管中。模板制备：参考iontorrent测序仪配套设备onetouch的使用说明书，具体步骤如下：(1)稀释文库和定量：①将建好的文库梯度至稀释200倍，充分涡旋后离心；②标准品10倍梯度稀释到6.8pm，0.68pm，0.068pm，abi7500仪器反应体系如下：2×mastermix5μl、20×taqman0.5μl、样本(标准品)4.5μl，反应条件如下：50℃维持2min、95℃维持2min，95℃15sec、60℃1min、循环40个；(2)油包水pcr扩增：①将稀释到200倍的文库充分涡旋混匀，按照如下反应体系依次加样：试剂体积ionp1tmenzymemix120μlionp1tmionspheretmparticles100μl无核酸酶的水(180-x)μl稀释后的文库x*μl总体积2400μl*：文库上样量按照qpcr定量结果进行计算，在700～750pmol总上样量进行调整②选择proton：ionpitmhi-qtmot2200kit程序运行油包水pcr反应；③取下油包水pcr反应后的recoverytube，弃去上层的recovery溶液，重悬微珠，配制melt-off溶液，体系如下：tween溶液280μl、1mnaoh40μl，总体积320μl；(3)磁珠富集：涡旋myonetmstreptavidinc1beads加入130μl-ionpitmmyonetmbeadscapturesolution进行富集。(4)onetouchandes：①将对应试剂转移es专用8连管进行es反应，顺序如下：1号100μl的阳性isp模板，2号130μl-myonetmbeads洗脱液，3号300μlionpitmeswashsolution，4号300μlionpitmeswashsolution，5号300μlionpitmeswashsolution，6号空，7号300μlmelt-off溶液，8号空；②离心es后的isp15500×g离心5min，弃上清仅留10μl重悬微珠；清洗并离心es后的isp15500×g×g离心5min，弃上清留取10μl重悬磁珠，补水至100μl，吹吸混匀10次测序反应：参考高通量测序仪iontorrent使用说明书，具体步骤如下：(1)制备测序样品：①涡旋ionpitmcontrolionspheretmparticles5sec，离心2sec，加4μl到es后的重悬液中，轻柔涡旋，15500×g离心3min；②弃去上清，留10μl，然后加入15μl-ionpitmannealingbuffer，再加入20μlsequencingprimer，轻柔涡旋，离心2sec；测序引物退火反应：95℃，2min；37℃，2min，25℃维持；③离心pcr管，加入10μlloadingbuffer，混匀并离心，共55μl。(2)ion-proton测序仪水洗、氯洗及初始化；(3)loading芯片；(4)上机测序；(5)对下机数据进行生物信息学分析，而后利用医学解读数据库进行解读做出诊断。生物信息学分析：首先，使用ionreport软件过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)，使用torrentvariantcaller子程序检测突变位点，软件参数使用的是默认的设置。最后对找出的突变包括snp和indel使用annovar软件进行注释，注释内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因，基因外显子编号，核苷酸水平变异，对应的蛋白水平变异，以及该突变在dbsnp数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，千人基因组数据库1000genomes(http://www.1000genomes.org/)，外显子组整合数据库exac(http://exac.broadinstitute.org/)和人类基因突变数据库hgmd(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中的注释，polyphe(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和sift(http://sift.jcvi.org/)功能预测结果等。进一步使用以下原则筛选致病突变位点：(1)根据突变所在的基因组位置和类型，过滤掉对蛋白产物序列不产生影响的突变；(2)利用1000genomes数据和exac数据，注释每个突变在人群中的比例，如果比例小于等于1％则不认为是多态性位点；(3)检索人类基因突变数据库，查询一个突变在hgmd中是否有记载，其出现在范可尼贫血等相关疾病中；(4)利用蛋白质功能预测软件polyphen-2和sift预测该突变是否影响蛋白功能；(5)如果经过(2)(3)(4)后，一个突变满足“非多态性”、“范可尼贫血记载过”和“影响蛋白功能”这三条中至少两条的，将被判为与疾病可能相关。最后，如果一个突变虽然不满足(5)但是在hgmd中有记录，则被判读为意义不明的突变。最后如果一个突变在文献中被明确记载未与疾病高度相关，则直接判为热点突变。统计分析：统计每个基因携带致病突变的比例，筛选出突变率最高的基因。医学解读：用医学解读数据库对生物信息学分析得出的基因突变型做出分子病理诊断。所用的医学解读数据库如下：范可尼贫血(fa)是一种罕见的遗传性异质性血液系统疾病，属于先天性再障。这类病人除有典型再障表现外，还伴有多发性的先天畸形包括小眼，小头畸形，拇指缺如，肾缺如、低位耳、生长迟缓、巨脑室、气管食管瘘、椎骨异常、无桡骨、肺节段性缺陷、心脏和大血管畸形、多发性牛奶咖啡斑等。患者的生长迟缓，体格、智力可发育落后，同时还可伴有精子减少等其它特征，经常与其它疾病伴发。主要的临床表现为先天性躯体畸形、骨髓造血衰竭和肿瘤易感性。患者还常表现为贫血，出血倾向及易感染。无肝、脾、淋巴结肿大。骨髓造血衰竭是fa患者最常见的致病和致死原因，多数患者在5～10岁时出现进行性骨髓造血衰竭，多进展为全血细胞减少，表现为重型再生障碍性贫血。实施例2合成检测试剂盒所需的引物引物设计：针对本发明所述突变位点，利用primer6.0软件设计扩增所需的多重pcr引物，最终发现如表2所示的复合扩增引物序列能够或者平衡、完整的扩增结果，使得所有突变位点均以相对较为接近的效率被扩增出。引物合成：将设计好的引物送至合成公司进行合成。实施例3利用实施例2所述试剂盒检测范可尼贫血病人样本收集3ml实施例1所述的患者的外周血，提取基因组dna，将包含本发明所述突变基因群中突变基因序列的基因组dna储备液作为阳性对照，将源于健康人经确认不包含突变基因序列的基因组dna序列储存液作为阴性对照；样本处理、文库构建、模板制备及测序反应同实施例1。12名患者所检测出19个基因的阳性率如下表4所示。表419个基因阳性率列表突变基因突变位点数突变率％突变基因突变位点数突变率％brca216.25％fanci318.75％brip1425％fancl00ercc416.25％mad2l200fanca425％palb200fancb00rad5100fancc16.25％rad51c00fancd2212.50％slx400fance00ube2t00fancf00xrcc200fancg00经统计后表明：12例患者中检测到3例为范可尼贫血(均符合复合杂合突变)，其他均为再生障碍性贫血或全血细胞减少等相关疾病，而且得出的结论与临床最终诊断相一致。由此可见，使用二代测序的方法对范可尼贫血患者进行辅助诊断，能够有效的与再生障碍性贫血等疾病进行区分，具有诊断准确、获得信息量大的特点。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12