棉花衣分分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，棉花衣分分子标记及其应用。

背景技术：

棉花(gossypium)是世界上重要的经济作物和油料作物，棉花纤维是优良的天然可纺织纤维，是重要的纺织工业原料。世界各国棉花育种的主要目标目前仍然是提高棉纤维的产量。衣分是指轧花后所得纤维占整个棉铃籽棉的重量比例，它是棉花重要的产量构成因子之一，提高衣分对提高棉花品种的纤维产量具有较大作用。研究结果表明，衣分的遗传率高。在过去的40年中，中外的商业棉花品种纤维产量的改进与衣分的提高有密切关系。国内外许多研究也认为棉花纤维产量与衣分呈高度正相关。因此，对棉花衣分性状的遗传改良尤为重要。国内外的多个遗传定位研究发现了一个位于染色体a12上的一段dna序列存在显著降低衣分的效应，贡献率变幅为12.5～24.44％，为主效的衣分控制基因。

但是，由于衣分是多基因遗传，表型往往表现连续变异，基因效应难以定量。采用常规育种技术对这个衣分控制位点进行人为选择需要很长年限，且由于衣分表型易受环境影响，每次回交转育后仅凭表型判断难以确保此衣分控制基因在转育和改良过程中没有丢失，从而需要耗费大量的棉田、人力和财力。因此，如何通过分子标记辅助选择方法稳定可靠又快速简便的进行高衣分材料的选育和改良成为本发明的关键核心。

分子标记直接从dna水平反映出核苷酸序列的差异，它不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，具有数量非常丰富，遗传稳定等特点。目前，随着分子生物学的飞速发展，分子标记检测技术已经发展出几十种技术可用于分子标记的筛选，比较常用的有rflp、rapd、issr、ssr、scar、sts、aflp和snp等，随着分子标记技术的不断发展和应用，目前，国内外已经越来越多的将各种分子标记技术应用在作物育种材料的分子标记辅助选择育种中。snp(singlenucleotidepolymorphisms)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。在所有真核生物基因组中均存在并且含量非常丰富，具有多态性丰富、稳定性好、位点专一性、共显性等特点。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何解决现有技术中检测棉花衣分所需时间长、消耗大、准确性差的问题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了棉花衣分分子标记或检测所述棉花衣分分子标记的物质在检测或辅助检测棉花衣分中的应用；

所述棉花衣分分子标记为a1)或a2)：

a1)棉花基因组中对应于序列表中序列1的第310位的核苷酸，所述棉花衣分分子标记为t或a；

a2)含有a1)所述棉花衣分分子标记的dna片段。

上述应用中，所述检测所述棉花衣分分子标记的物质可为引物对，所述引物对满足：在以棉花基因组dna为模板利用所述引物对进行pcr扩增时，得到的扩增产物中含有所述棉花分子标记。

所述引物对可为a1或a2，所述a1由名称分别为p1和p2的单链dna组成，所述p1为序列表中序列2所示的单链dna，所述p2为序列表中序列3所示的单链dna；所述a2由名称分别为p3和p4的单链dna组成，所述p3为序列表中序列5所示的单链dna，所述p4为序列表中序列6所示的单链dna。

所述棉花衣分分子标记可为序列表中序列1所示的dna片段或序列4所示的dna片段。

本发明还提供了检测棉花基因型的方法，所述基因型为tt基因型、ta基因型和aa基因型；所述方法包括：检测待测棉花染色体中对应于序列表中序列1的第310位的核苷酸，如所述待测棉花基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测棉花为tt基因型棉花；如所述待测棉花基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测棉花为aa基因型棉花；如所述待测棉花基因组中两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测棉花为ta基因型棉花；

g1)对应于序列表中序列1的第310位的核苷酸为t；

g2)对应于序列表中序列1的第310位的核苷酸为a。

上述方法中，检测待测棉花染色体中对应于序列表中序列1的第310位的核苷酸可采用所述a1或所述a2进行，所述方法包括i和ii：

i、k1)和k2)：

k1)以待测棉花基因组dna为模板，采用所述a1进行pcr扩增得到pcr产物；

k2)检测步骤k1)得到的pcr产物的大小，根据所述pcr产物确定棉花基因型：如所述pcr产物中含有202bp的dna片段，所述待测棉花为tt或ta基因型棉花；如所述pcr产物中不含有202bp的dna片段，所述待测棉花为aa基因型棉花；

ii、l1)和l2)：

l1)以待测棉花基因组dna为模板，采用所述a2进行pcr扩增得到pcr产物；

l2)检测步骤l1)得到的pcr产物的序列，根据所述pcr产物序列确定棉花基因型：如所述pcr产物中含有序列1所示的dna片段，所述待测棉花为tt基因型棉花；如所述pcr产物中含有序列4所示的dna片段，所述待测棉花为aa基因型棉花；如所述pcr产物中含有序列1和4所示的dna片段，所述待测棉花为ta基因型棉花。

利用所述a1进行pcr扩增，可采用如下反应体系：1μl待测材料基因组dna溶液，10×pcrbuffer1.0μl，10mmdntps0.2μl，25mmmgcl20.8μl，10mm序列2所示p10.5μl，10mm序列3所示p20.5μl，2u/μltaqdna聚合酶0.2μl和ddh2o5.8μl。其中，引物对a2的两条引物在反应体系中的浓度均为0.5mm。

利用所述a1进行pcr扩增，可采用如下反应条件：95℃预变性2min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

利用所述a2进行pcr扩增，可采用如下反应体系：1μl待测材料基因组dna溶液，10×pcrbuffer1.0μl，10mmdntps0.2μl，25mmmgcl20.8μl，10mm序列5所示p30.5μl，10mm序列6所示p40.5μl，2u/μltaqdna聚合酶0.2μl和ddh2o5.8μl。

利用所述a2进行pcr扩增，可采用如下反应条件：95℃预变性2min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

本发明还提供了检测或辅助检测棉花衣分的方法，所述方法包括下述x1)或x2)：

x1)按照所述检测棉花基因型的方法检测待测棉花的基因型，aa基因型棉花具有或候选具有高衣分性状，tt基因型棉花具有或候选具有低衣分性状，ta基因型棉花具有或候选具有低衣分性状；

x2)按照所述检测棉花基因型的方法检测两种或两种以上待测棉花的基因型，tt基因型棉花衣分低于或候选低于aa基因型棉花，ta基因型棉花衣分低于或候选低于aa基因型棉花，tt基因型棉花衣分与ta基因型棉花衣分无差异。

所述高衣分性状是指衣分为35-45％，所述低衣分是指衣分为20-30％。

本发明还提供了所述棉花衣分分子标记。

本发明还提供了检测所述棉花衣分分子标记的物质，所述物质可包括所述a1或所述a2。

所述物质可为所述a1或所述a2。所述物质还可由所述a1或所述a2与进行pcr扩增所需的试剂组成，所述进行pcr扩增所需的试剂可为pcr缓冲液、dntps(含有datp、dttp、dctp、dgtp)、mgcl2和/或dna聚合酶。所述pcr缓冲液可为10×pcrbuffer(生工生物工程(上海)股份有限公司产品)。所述dntps可为10mmdntps(含有datp、dttp、dctp、dgtp，这四种dntp的浓度均为10mm)(生工生物工程(上海)股份有限公司产品)。所述mgcl2可为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。所述dna聚合酶可为taqdna聚合酶。所述taqdna聚合酶可为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

本发明还提供了下述任一应用：

h1)所述棉花衣分分子标记在棉花育种中的应用；

h2)检测所述棉花衣分分子标记的物质在棉花育种中的应用；

h3)检测所述棉花衣分分子标记的物质在检测或辅助检测棉花衣分中的应用；

h4)检测所述棉花衣分分子标记的物质在制备检测或辅助检测棉花衣分产品中的应用；

h5)所述棉花衣分分子标记在筛选或辅助筛选高衣分棉花中的应用；

h6)所述棉花衣分分子标记在制备筛选或辅助筛选高衣分棉花产品中的应用；

h7)检测所述棉花衣分分子标记的物质在筛选或辅助筛选高衣分棉花中的应用；

h8)检测所述棉花衣分分子标记的物质在制备筛选或辅助筛选高衣分棉花产品中的应用；

h9)所述检测棉花基因型的方法在检测或辅助检测棉花衣分中的应用；

h10)所述检测棉花基因型的方法在筛选或辅助筛选高衣分棉花中的应用；

h11)所述检测棉花基因型的方法在棉花育种中的应用；

h12)检测或辅助检测棉花衣分的方法在棉花育种中的应用。

本发明还提供了下述任一方法：

y1)筛选或辅助筛选高衣分棉花的方法，所述方法包括：按照所述检测棉花基因型的方法检测棉花的基因型，筛选得到的aa基因型棉花即为高衣分棉花；

y2)棉花育种方法，包括按照所述检测棉花基因型的方法检测棉花基因型，选择aa或ta基因型的棉花作为亲本进行育种。

实验证明，利用本发明的棉花衣分分子标记检测棉花基因型结果稳定、可靠，进一步可用于棉花衣分的检测。利用本发明的方法检测棉花衣分具有如下特点：

(1)速度快：基因特异标记鉴定对辅助选育高衣份的棉花品系具有重要作用。在棉花的衣分遗传改良过程中，涉及大量的自交鉴定等试验，并且需要调查大量的外部性状，需要投入大量的时间、人力和物力，且易受环境因素影响，因此，常规手段并不能完全准确、真实地反映棉花材料的遗传情况。本发明只需提供棉花材料的种子或叶片，提取dna后，用基因特异引物对进行分子标记鉴定，利用相应分子鉴定体系可以很快地鉴定出高衣分植株，同时利用本发明可以在棉花纤维品质育种中通过跟踪棉花衣分分子标记进行辅助育种，免去自交鉴定，从而极大加快衣分控制选育和改良过程。

(2)准确率高：检测本发明的棉花衣分分子标记具有简单、稳定可靠、重复性好等优点，很容易通过pcr快速扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本发明利用一对基因特异引物对高衣分进行鉴定，其与高衣分性状完全共分离，可靠性高，且分子鉴定不受环境因素的影响，真正从dna水平上鉴定高衣分的遗传情况，提高了准确性。

(3)实用简单：本发明检测棉花衣分分子标记和分子标记辅助选择育种的整个程序只是几次机械式的加样过程，易于操作，具有很好的商业化应用前景。

总之，本发明提供的棉花衣分分子标记及其引物能够快速鉴定高衣分的棉花品系，其鉴定方法简单实用，其鉴定结果准确可靠，所以本发明提供的棉花衣分分子标记及其引物能够快速有效的辅助棉花育种，对推动育种进程起了决定性的作用。

附图说明

图1为采用引物对a2对各材料进行pcr扩增得到的pcr扩增产物的电泳检测结果。m为dna分子量标准，marker；泳道1-5为群体单株。

图2为采用引物对a1对各材料pcr扩增产物的电泳检测结果。泳道m为dna分子量标准，泳道1为陆地棉标准系tm-1，泳道2为棉花品种n2，泳道3-46为陆地棉标准系tm-1与棉花品种n2杂交得到的f2群体植株，l表示低衣分植株，h表示高衣分植株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。

下述实施例中的棉花品种n2(棉花光子基因n1和n2的遗传分析及染色体定位的分子证据。南京农业大学学报，2010,33(1):21-26)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的陆地棉标准系tm-1(sequencingofallotetraploidcotton(gossypiumhirsutuml.acc.tm-1)providesaresourceforfiberimprovement。naturebiotechnology,2015,33(5):531-537)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

10×pcrbuffer、10mmdntps(含有datp、dttp、dctp、dgtp，这四种dntp的浓度均为10mm)、25mmmgcl2和taqdna聚合酶均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

实施例1、棉花衣分分子标记在检测棉花衣分中的应用

一、与棉花衣分相关的棉花衣分分子标记

本发明发现了一个与棉花衣分相关的snp位点，记为棉花衣分分子标记，该分子标记在棉花基因组中改为t或a，在低衣分棉花的两条染色体中对应于序列表中序列1的第310位的核苷酸均为t，将该棉花的基因型记为tt基因型；该分子标记在高衣分棉花的两条染色体中对应于序列表中序列1的第310位的核苷酸均为a，将该棉花的基因型记为aa基因型；将一条染色体对应于序列表中序列1的第310位核苷酸为t，另一条染色体中对应于序列表中序列1的第310位核苷酸为a的棉花的基因型记为ta基因型。

设计能够检测该snp位点的引物对a1，a1由名称为p1和p2的两条单链dna组成，p1为序列表中序列2所示的单链dna，p2为序列表中序列3所示的单链dna。引物对a1能够从tt基因型和ta基因型棉花的基因组dna中扩增得到序列表中序列1的第130-331位所示的dna分子，而以aa基因型棉花的基因组dna为模板则不能得到扩增产物，aa基因型棉花中对应于序列表中序列1的序列为序列4的第130-331位。

设计能够扩增该snp位点上下游序列的引物对a2，a2由名称为p3和p4的两条单链dna组成，p3为序列表中序列5所示的单链dna，p4为序列表中序列6所示的单链dna。引物对a2能够从tt基因型棉花的基因组dna中扩增得到序列表中序列1所示的dna分子，能够从aa基因型棉花的基因组dna中扩增得到序列表中序列4所示的dna分子，能够从ta基因型棉花的基因组dna中扩增得到序列表中序列1和4所示的dna分子。

二、棉花衣分分子标记与棉花衣分相关性的检测

1、待测材料

所用待测材料为：低衣分棉花品种n2(衣分在23％左右)，高衣分陆地棉标准系tm-1(衣分在40％左右)，在陆地棉标准系tm-1与棉花品种n2杂交得到的f2群体中随机选取的44株单株，共46个材料。

2、基因型的检测

提取得到步骤1的各材料的基因组dna，测定浓度后稀释到25ng/μl，-20℃保存备用；

分别及上述各材料的基因组dna为模板，利用引物对a2进行pcr扩增，所用pcr扩增体系为10μl体系，该扩增体系由以下物质组成：

1μl待测材料基因组dna溶液，10×pcrbuffer1.0μl，10mmdntps0.2μl，25mmmgcl20.8μl，10mm序列5所示p30.5μl，10mm序列6所示p40.5μl，2u/μltaqdna聚合酶0.2μl和ddh2o5.8μl。其中，引物对a2的两条引物在反应体系中的浓度均为0.5mm。

将扩增体系在如下条件下进行pcr扩增反应：95℃预变性2min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

将得到的扩增产物利用浓度为1.0％(质量比)的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结果如图1所示。

对得到的扩增产物进行测序，确定各植株的基因型，结果如表1所示。

3、衣分的检测

检测各植株的衣分，检测方法如下：每个单株收取正常成熟棉铃15个，称取籽棉重量，记为zm，采用轧花机对棉铃轧花获得皮棉，称取皮棉重量，记为pm。衣分yp＝pm/zm×100％。

结果如表1所示。

表1、棉花基因型与衣分的检测结果

表1中，编号1-46分别为图1中的泳道1-46。

结果显示，棉花品种n2的衣分显著低于陆地棉标准系tm-1。计算f2群体中不同基因型的衣分，结果显示，f2群体中aa基因型植株的衣分为36.1％，ta基因型植株的衣分均值为25.3％，tt基因型植株的衣分均值为25.4％。tt和ta基因型植株衣分显著低于aa基因型，tt和ta基因型没有显著差别。表明，棉花衣分分子标记是一个与棉花衣分相关的分子标记，在实际应用中，可通过检测待测植株的基因型确定待测植株的衣分情况：tt和ta基因型棉花为低衣分棉花，aa基因型棉花为高衣分棉花。进一步还可以根据比较两种待测棉花的衣分情况：tt和ta基因型棉花衣分均低于aa基因型棉花，tt和ta基因型棉花衣分无显著差异，同基因型棉花间衣分无显著差异。

3、基因型的分子标记检测

提取得到步骤1的各材料的基因组dna，测定浓度后稀释到25ng/μl，-20℃保存备用；

分别及上述各材料的基因组dna为模板，利用引物对a1进行pcr扩增，所用pcr扩增体系为10μl体系，该扩增体系由以下物质组成：

1μl待测材料基因组dna溶液，10×pcrbuffer1.0μl，10mmdntps0.2μl，25mmmgcl20.8μl，10mm序列2所示p10.5μl，10mm序列3所示p20.5μl，2u/μltaqdna聚合酶0.2μl和ddh2o5.8μl。其中，引物对a2的两条引物在反应体系中的浓度均为0.5mm。

将扩增体系在如下条件下进行pcr扩增反应：95℃预变性2min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。将得到的扩增产物利用浓度为6％(质量比)的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，电泳结果如图2所示。能扩增出特异条带的单株为tt或ta基因型棉花，均为较低衣份单株，而不能扩增出特征条带的单株均为aa基因型棉花，均为高衣份单株。

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>棉花衣分分子标记及其应用

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>366

<212>dna

<213>棉花（gossypiumspp）

<400>1

cggtaaagtggcatgcttcatttcatcttatatcatctctcttaggtgatggcaatagta60

caataaggaccctatatcgtttcttttagttgagatagtaaatgacagcataatatcgac120

cagtaccaccccaactattagtcagtaccaatgatcatgaattgttaactaccagttgta180

tttggaacctattatctagcttgggtttatttgtataattggattaataaatttatgtgt240

aatatataaatatgcataggtggtcggctattgcggctcatttgccaaaaagaacagaca300

atgagatcatgaactactggaatacacagttgaagaaaaggttgacgacgatagggatcg360

accctg366

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cccaactattagtcagtacca21

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aactgtgtattccagtagttga22

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<211>366

<212>dna

<213>棉花（gossypiumspp）

<400>4

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caataaggaccctatatcgtttcttttagttgagatagtaaatgacagcataatatcgac120

cagtaccaccccaactattagtcagtaccaatgatcatgaattgttaactaccagttgta180

tttggaacctattatctagcttgggtttatttgtataattggattaataaatttatgtgt240

aatatataaatatgcataggtggtcggctattgcggctcatttgccaaaaagaacagaca300

atgagatcaagaactactggaatacacagttgaagaaaaggttgacgacgatagggatcg360

accctg366

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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cggtaaagtggcatgcttcat21

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<212>dna

<213>人工序列

<400>6

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