本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种提高多杀菌素产量的发酵方法。
背景技术：
多杀菌素(spinosad)，又名刺糖菌素，是由放线菌属中的刺糖多孢菌(saccharopolyoraspinosa)经过有氧发酵产生的胞内次级代谢产物，是一种新型的大环内酯类抗生素，其主要活性成份为spinosyna(约占85％-90％)和spinosynd(约占10％-15％)。
多杀菌素是天然生成的抗生素，对鳞翅目及双翅目等害虫均有良好的防治效果，多杀菌素对昆虫存在快速触杀和摄食毒性，通过刺激昆虫神经系统，导致非功能性的肌肉收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹。与一般杀虫剂相比，多杀菌素兼具生物农药的安全性和化学合成农药的快速性效果，具有低毒、低残留、对昆虫天敌安全、自然分解快等诸多优点。在日益重视环保和安全的今天，多杀菌素作为生物农药，以其无公害、安全、绿色环保受到越来越多的关注，成为开发研究的热点。
我国是农业大国，农药需求量很大，实现多杀菌素的产业化，以低毒的生物农药取代目前大量使用的毒性较高的化学农药，具有极其重要的意义，目前国内市售的多杀菌素，主要由美国陶氏益农公司(dowagrosciencescompany)生产的、分别用于蔬菜和棉花的虫害防治的菜喜(2.5％多杀菌素悬浮剂)和催杀(48％多杀菌素悬浮剂)，国内多杀菌素的研究还处于实验阶段。
cn103667404a公开了一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，通过控制多孢菌菌体生长和多杀菌素合成两个阶段的不同溶氧需求，提高多杀菌素产量，使得多杀菌素产量在发酵196小时达到160.9mg/l。
cn107523598a公开了一种提高多杀菌素产量的发酵方法，通过向发酵液中补充复合有机氮源，提高多杀菌素的产量，使得多杀霉素产量在发酵216小时达到5.66g/l。
综上所述，目前我国对多杀菌素发酵工艺的研究大多为控制不同阶段的溶解氧、优化发酵培养基，虽然取得了一定进步，但传统的调整发酵培养基的氮源和碳源对多杀菌素产量的影响较小，没有实质性突破，同时存在，发酵周期长，发酵过程中容易产生泡沫等问题，不能满足工业化生产的需求，因此，亟需一种有效的方法来提高多杀菌素发酵的产量。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种提高多杀菌素产量的发酵方法，提高了细胞的活性，实现了多杀菌素的高效生产，同时缩短了发酵周期，有效避免了发酵过程中泡沫的产生，降低了生产成本，为我国多杀菌素的产业化提供了技术支持。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种提高多杀菌素产量的发酵方法，包括以下步骤：
s1、菌种活化：
将刺糖多孢菌接种于种子培养液中进行活化培养，得到活化菌种；
s2、扩大培养：
将步骤s1得到的活化菌种，接种到增殖培养液中，进行扩大培养，得到增殖菌种；
所述的增殖培养液包括：玉米淀粉30-45g/l、大豆粉20-30g/l、海藻粉10-15g/l、硫酸镁0.1-0.3g/l和钼酸铵0.3-1.0g/l；120-130℃灭活30min；
s3、发酵产生多杀菌素：
将步骤s2得到的增殖菌种，接种到发酵培养液中，进行发酵培养，得到含多杀菌素的发酵液；
所述的发酵培养液包括：葡萄糖5-10g/l、糊精2-5g/l、大豆粉15-20g/l、海藻粉10-15g/l、硫酸镁0.1-0.3g/l和钼酸铵0.3-1.0g/l；120-130℃灭活30min。
优选地，步骤s1中所述的刺糖多孢菌为刺糖多胞菌(saccharopolysporaspinosa)sp5266。
优选地，步骤s1中所述的种子培养液包括：葡萄糖15-19g/l、糊精5-9g/l、大豆粉20-29g/l和硫酸镁0.5-0.75g/l；120-130℃灭活30min。
进一步优选地，所述的种子培养液灭菌前ph为7.0-8.5。
优选地，步骤s1中所述的活化培养的条件为：在24-28℃下，活化培养24-72小时。
优选地，步骤s2中所述的活化菌种的接种量为增殖培养液体积的2.0-4.5％。
优选地，步骤s2中所述的增殖培养液包括：玉米淀粉30-44g/l、大豆粉20-29g/l、海藻粉10-14g/l、硫酸镁0.1-0.25g/l和钼酸铵0.3-0.95g/l；120-130℃灭活30min。
进一步优选地，所述的增值培养液灭菌前的ph为7.2-8.0。
优选地，步骤s2中所述的扩大培养在培养罐中进行，扩大培养的条件为：搅拌速度为100-150rpm，罐压0.5-0.7kg/cm2，增殖培养液的溶氧量为50-60％，在30-33℃下，增殖培养72-98小时。
优选地，步骤s3中所述的增殖菌种的接种量为发酵培养液体积的7.0-9.0％。
优选地，步骤s3中所述的发酵培养液包括：葡萄糖5-9g/l、糊精2-4g/l、大豆粉15-19g/l、海藻粉10-14g/l、硫酸镁0.1-0.29g/l和钼酸铵0.3-0.95g/l；120-130℃灭活30min。
进一步优选地，所述的发酵培养液灭菌前的ph为7.4-8.0。
优选地，步骤s3中所述的发酵培养在培养罐中进行，发酵培养的条件为：搅拌速度为100-150rpm，罐压0.2-0.3kg/cm2，发酵培养液的溶氧量为35-40％，在27-29℃下，发酵培养72-96小时。
本发明的有益效果为：
(1)本发明利用海藻粉和大豆粉复配作为氮源对培养液的优化、对不同培养阶段的培养条件进行选择控制，缩短了发酵周期，提高了多杀菌素的发酵产量，实现了多杀菌素的高效生产，为工业化生产提供了技术支持。
(2)本发明中海藻粉和钼酸铵联合使用，可以增加细胞的活性，提高多杀菌素的产量；同时发现，海藻粉的添加可以有效的抑制发酵过程中泡沫的产生，从而避免了消泡剂对刺糖多孢菌的抑制作用。
(3)本发明的发酵方法工艺简单，发酵周期短，成本低，为多杀菌素的规模化生产提供了技术支持。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明提供了一种提高多杀菌素产量的发酵方法，包括以下步骤：
s1、菌种活化：
将刺糖多孢菌接种于种子培养液中进行活化培养，得到活化菌种；
s2、扩大培养：
将步骤s1得到的活化菌种，接种到增殖培养液中，进行扩大培养，得到增殖菌种；
所述的增殖培养液包括：玉米淀粉30-45g/l、大豆粉20-30g/l、海藻粉10-15g/l、硫酸镁0.1-0.3g/l和钼酸铵0.3-1.0g/l；120-130℃灭活30min；
s3、发酵产生多杀菌素：
将步骤s2得到的增殖菌种，接种到发酵培养液中，进行发酵培养，得到含多杀菌素的发酵液；
所述的发酵培养液包括：葡萄糖5-10g/l、糊精2-5g/l、大豆粉15-20g/l、海藻粉10-15g/l、硫酸镁0.1-0.3g/l和钼酸铵0.3-1.0g/l；120-130℃灭活30min。
本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
步骤s1中所述的刺糖多孢菌为刺糖多胞菌(saccharopolysporaspinosa)sp5266；所述的种子培养液可采用本领域技术人员熟知的种子培养液，并未特殊限制，优选地采用以下种子培养液组分：葡萄糖15-19g/l、糊精5-9g/l、大豆粉20-29g/l和硫酸镁0.5-0.75g/l；120-130℃灭活30min，所述的种子培养液灭菌前ph为7.0-8.5；所述的活化培养采用的条件为：在24-28℃下，活化培养24-72小时。
步骤s2中所述的菌种的接种方法为本领域技术人员熟知的接种方法，并无特殊的限制，所述的活化菌种的接种量优选为增殖培养液体积的2.0-4.5％；所述的增殖培养液包括：玉米淀粉30-44g/l、大豆粉20-29g/l、海藻粉10-14g/l、硫酸镁0.1-0.25g/l和钼酸铵0.3-0.95g/l；120-130℃灭活30min，所述的增值培养液灭菌前的ph为7.2-8.0。
步骤s2中所述的扩大培养在培养罐中进行，为本领域技术人员熟知的扩大培养方法，并无特殊的限制，所述扩大培养的条件优选为：搅拌速度为100-150rpm，罐压0.5-0.7kg/cm2，增殖培养液的溶氧量为50-60％，在30-33℃下，增殖培养72-98小时。
步骤s3中所述的菌种的接种方法为本领域技术人员熟知的接种方法，并无特殊的限制，所述的增殖菌种的接种量优选为发酵培养液体积的7.0-9.0％；所述的发酵培养液包括：葡萄糖5-9g/l、糊精2-4g/l、大豆粉15-19g/l、海藻粉10-14g/l、硫酸镁0.1-0.29g/l和钼酸铵0.3-0.95g/l；120-130℃灭活30min，发酵培养液灭菌前的ph为7.4-8.0。
步骤s3中所述的发酵培养在培养罐中进行，为本领域技术人员熟知的发酵培养方法，并无特殊的限制，发酵培养的条件优选为：搅拌速度为100-150rpm，罐压0.2-0.3kg/cm2，发酵培养液的溶氧量为35-40％，在27-29℃下，发酵培养72-96小时。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种l-缬氨酸的生产方法进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
一种提高多杀菌素产量的发酵方法，包括以下步骤：
s1、菌种活化：
将刺糖多胞菌(saccharopolysporaspinosa)sp5266接种于种子培养液中，在24℃下，活化培养48小时，得到活化菌种；
所述种子培养液包括：葡萄糖15g/l、糊精5g/l、大豆粉20g/l和硫酸镁0.5g/l；120℃灭活30min，所述的种子培养液灭菌前ph为7.0；
s2、扩大培养：
将步骤s1得到的活化菌种，按照体积比2.0％接种到增殖培养液中，进行扩大培养，得到增殖菌种；
所述的增殖培养液包括：玉米淀粉30-g/l、大豆粉20g/l、海藻粉10-15g/l、硫酸镁0.1g/l和钼酸铵0.3g/l；120℃灭活30min；所述增殖培养液灭菌前ph为7.2；
扩大培养条件为：搅拌速度为100rpm，罐压0.5kg/cm2，增殖培养液的溶氧量为50-60％，在30℃下，增殖培养72小时；
s3、发酵产生多杀菌素：
将步骤s2得到的增殖菌种，按照体积比7.0％接种到发酵培养液中，进行发酵培养，得到含多杀菌素的发酵液；
所述的发酵培养液包括：葡萄糖5g/l、糊精2g/l、大豆粉15g/l、海藻粉10g/l、硫酸镁0.1g/l和钼酸铵0.3g/l；120℃灭活30min；发酵培养液灭菌前的ph为7.4；
在发酵培养罐中进行发酵培养，发酵培养的条件为：搅拌速度为100rpm，罐压0.2kg/cm2，发酵培养液的溶氧量为35％，在27℃下，发酵培养72小时，通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为5.78g/l。
本发明所采用的hplc法，具体为：
取2ml发酵液，加入2ml无水甲醇，充分震荡2min，静置提取90min，3500r/min离心15min，取上清液进行hplc分析。
hplc分析条件为：waters515型高效液相色谱仪，安捷伦xdb-c18反向色谱柱，规格150mm×4.6mm。填料孔径5μm；流动相：甲醇:乙腈:0.05％乙酸铵水溶液＝45:45:10；流速1ml/min；检测波长254nm。根据积分面积，计算多杀菌素产量。
实施例2
一种提高多杀菌素产量的发酵方法，包括以下步骤：
s1、菌种活化：
将刺糖多胞菌(saccharopolysporaspinosa)sp5266接种于种子培养液中，在28℃下，活化培养72小时，得到活化菌种；
所述种子培养液包括：葡萄糖19g/l、糊精9g/l、大豆粉29g/l和硫酸镁0.75g/l；130℃灭活30min，所述的种子培养液灭菌前ph为8.5；
s2、扩大培养：
将步骤s1得到的活化菌种，按照体积比4.5％接种到增殖培养液中，进行扩大培养，得到增殖菌种；
所述的增殖培养液包括：玉米淀粉45g/l、大豆粉30g/l、海藻粉15g/l、硫酸镁0.3g/l和钼酸铵1.0g/l；130℃灭活30min；所述增殖培养液灭菌前ph为8.0；
扩大培养条件为：搅拌速度为150rpm，罐压0.7kg/cm2，增殖培养液的溶氧量为50-60％，在33℃下，增殖培养98小时；
s3、发酵产生多杀菌素：
将步骤s2得到的增殖菌种，按照体积比9.0％接种到发酵培养液中，进行发酵培养，得到含多杀菌素的发酵液；
所述的发酵培养液包括：葡萄糖10g/l、糊精5g/l、大豆粉20g/l、海藻粉15g/l、硫酸镁0.3g/l和钼酸铵1.0g/l；130℃灭活30min；发酵培养液灭菌前的ph为8.0；
在发酵培养罐中进行发酵培养，发酵培养的条件为：搅拌速度为150rpm，罐压0.3kg/cm2，发酵培养液的溶氧量为40％，在29℃下，发酵培养96小时，通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为5.81g/l。
实施例3
一种提高多杀菌素产量的发酵方法，包括以下步骤：
s1、菌种活化：
将刺糖多胞菌(saccharopolysporaspinosa)sp5266接种于种子培养液中，在26℃下，活化培养60小时，得到活化菌种；
所述种子培养液包括：葡萄糖15.5g/l、糊精5.5g/l、大豆粉21g/l和硫酸镁0.55g/l；122℃灭活30min，所述的种子培养液灭菌前ph为7.1；
s2、扩大培养：
将步骤s1得到的活化菌种，按照体积比2.3％接种到增殖培养液中，进行扩大培养，得到增殖菌种；
所述的增殖培养液包括：玉米淀粉44g/l、大豆粉29g/l、海藻粉14g/l、硫酸镁0.25g/l和钼酸铵0.95g/l；122℃灭活30min；所述增殖培养液灭菌前ph为7.3；
扩大培养条件为：搅拌速度为110rpm，罐压0.55kg/cm2，增殖培养液的溶氧量为51％，在31℃下，增殖培养84小时；
s3、发酵产生多杀菌素：
将步骤s2得到的增殖菌种，按照体积比7.2％接种到发酵培养液中，进行发酵培养，得到含多杀菌素的发酵液；
所述的发酵培养液包括：葡萄糖9g/l、糊精4g/l、大豆粉19g/l、海藻粉14g/l、硫酸镁0.29g/l和钼酸铵0.95g/l；122℃灭活30min；发酵培养液灭菌前的ph为7.6；
在发酵培养罐中进行发酵培养，发酵培养的条件为：搅拌速度为145rpm，罐压0.22kg/cm2，发酵培养液的溶氧量为36％，在28℃下，发酵培养84小时，通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为5.83g/l。
实施例4
一种提高多杀菌素产量的发酵方法，包括以下步骤：
s1、菌种活化：
将刺糖多胞菌(saccharopolysporaspinosa)sp5266接种于种子培养液中，在26.5℃下，活化培养65天，得到活化菌种；
所述种子培养液包括：葡萄糖16g/l、糊精7g/l、大豆粉21g/l和硫酸镁0.6g/l；126℃灭活30min，所述的种子培养液灭菌前ph为7.6；
s2、扩大培养：
将步骤s1得到的活化菌种，按照体积比3.9％接种到增殖培养液中，进行扩大培养，得到增殖菌种；
所述的增殖培养液包括：玉米淀粉37g/l、大豆粉26g/l、海藻粉13g/l、硫酸镁0.19g/l和钼酸铵0.39g/l；126℃灭活30min；所述增殖培养液灭菌前ph为7.5；
扩大培养条件为：搅拌速度为125rpm，罐压0.58kg/cm2，增殖培养液的溶氧量为57％，在32℃下，增殖培养75小时；
s3、发酵产生多杀菌素：
将步骤s2得到的增殖菌种，按照体积比7.8％接种到发酵培养液中，进行发酵培养，得到含多杀菌素的发酵液；
所述的发酵培养液包括：葡萄糖6.5g/l、糊精2.8g/l、大豆粉17g/l、海藻粉12.5g/l、硫酸镁0.18g/l和钼酸铵0.75g/l；126℃灭活30min；发酵培养液灭菌前的ph为7.8；
在发酵培养罐中进行发酵培养，发酵培养的条件为：搅拌速度为137rpm，罐压0.27kg/cm2，发酵培养液的溶氧量为38％，在28℃下，发酵培养86小时，通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为6.28g/l。
对比例1
本对比例与实施例4的不同之处在于：步骤s2中所述活化菌种的接种量为增殖培养液体积的5.8％，所述增殖培养液中不含钼酸铵；通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为1.00g/l。
对比例2
本对比例与实施例4的不同之处在于：步骤s2中所述活化菌种的接种量为增殖培养液体积的1.8％，所述增殖培养液中不含海藻粉；通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为1.28g/l。
对比例3
本对比例与实施例4的不同之处在于：步骤s3中所述增殖菌种的接种量为增殖培养液体积的9.5％，所述发酵培养液中不含钼酸铵；通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为1.52g/l。
对比例4
本对比例与实施例4的不同之处在于：步骤s3中所述增殖菌种的接种量为增殖培养液体积的6.5％，所述发酵培养液中不含大豆粉；通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为1.37g/l。
对比例5
本对比例与实施例4的不同之处在于：步骤s2中所述扩大培养的搅拌速度为165rpm，罐压0.75kg/cm2，增殖培养液的溶氧量为62％；通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为1.88g/l。
对比例6
本对比例与实施例4的不同之处在于：步骤s2中所述发酵培养的条件为：搅拌速度为95rpm，罐压0.18kg/cm2，发酵培养液的溶氧量为42％；通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为1.92g/l。
对比例7
本对比例与实施例4的不同之处在于：按照cn103667404a实施例2的发酵过程控制溶解氧；通过hplc法检测多杀菌素产量，得到多杀菌素产量为1.69g/l。
本发明实施例1-6发酵得到的多杀菌素含量均大于2g/l，可以用于工业化生产，为我国多杀菌素的商业化运行提供了技术支持；本发明通过海藻粉和大豆粉复配作为氮源，海藻粉和钼酸铵联合作为微量元素源进行培养液的优化、对不同培养阶段的培养条件进行选择控制，有效的增加了细胞活性，缩短了发酵周期，大大提高了多杀菌素的产量，同时发现，海藻粉的添加可以有效的抑制发酵过程中泡沫的产生，从而避免了消泡剂对刺糖多孢菌的抑制作用。