本发明涉及基因工程及分子遗传学技术领域，具体涉及一种用于心血管系统用药的药物代谢基因的个性化捕获、测序的探针组及试剂盒。
背景技术：
上世纪50年代末，研究个体遗传变异对药物反应个体差异影响的遗传药理学做为药理学的一门分支学科被正式提出。药物基因组学的概念也随之出现。药物基因组学是通过关联基因表达或单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)与药物的吸收、分布、代谢、排泄(adme)过程以及药物受体靶标，来研究患者携带的先天遗传或是后天获得的遗传变异对药物作用的影响的学科。专利cn107273710a公开了一种建立药物代谢酶基因与药物代谢的关系模型的方法，该方法包括确定单个多态性位点与药物代谢类型关系以及多个多态性位点组合与药物代谢类型的关系，最终获得药物代谢酶基因与药物代谢的关系模型。药物基因组学是精准医疗的重要组成部分，在指导临床选择最佳治疗药物，以最适的剂量提高药物疗效、减少或者避免不良反应、改善预后和节约医疗成本方面，有重要的意义。从1990年起，心血管疾病持续为我国居民首位死亡原因，并呈不断上升趋势。心血管药物的使用同样受到药物基因组学的指导。专利cn101760528b公开了一种药物代谢相关位点检测方法，包括检测药物代谢相关基因cyp2c9基因、cyp2c19基因、cyp2d6基因及cyp3a4基因，该发明为服用某些药物时是否需要咨询专业医生以确定是否服用及服用剂量等提供参考依据。专利cn107022611a公开了一种用于检测4种常见临床心脑血管疾病药品精准用药的方法及专用引物。该发明高效一次性实验完成与阿司匹林抵抗、硝酸甘油抵抗、华法林个体差异、氯吡格雷抵抗相关的8个snp位点检测，一次性实验完成阿司匹林、硝酸甘油、华法林、氯吡格雷的精准用药基因检测。目前研究较多的、临床常用的心血管药物如他汀类降脂药、抗血小板药、服抗凝药、β受体阻断剂和血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensinconvertingenzymeinhibitors，acei)等，都存在由于个体遗传差异而导致的药物疗效的个体差异。
他汀类降脂药的疗效与个体遗传差异相关。他汀类药物是目前世界上应用最广泛的一类降血脂药物，可通过降低血脂降低心脑血管疾病的风险。但个体差异导致了一些患者降脂疗效不佳以及肌痛和肌无力等副作用。目前已有多个候选基因与降脂疗效、减少心血管性死亡和心肌梗死风险相关。专利cn107099602a公开了一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒，包括检测包括apoe、slco1b1、cetp、abcb1、mthfr基因位点的引物对和探针对，主要用于他汀类药物的个性化用药辅助诊断：辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀等。有研究表明slco1b1、abcb1等基因编码的蛋白质是他汀类药物转运和代谢通路的主要蛋白，这些基因的多态性会影响其蛋白质的功能，进而影响他汀类药物的疗效。有机阴离子转运多肽(organicanion-transportingpolypeptide，oatp)是摄入型转运体中的一大类，隶属于溶质转运体超家族(superfamilyofsolutecarriers，slc)，对于内、外源性物质，尤其是药物的吸收、分布、消除具有重要影响，其编码基因统称为slco基因。slco1b1基因存在20个以上的功能遗传多态性，其单碱基核苷酸多态性位点的变化可引起他汀类药物药效的改变。三磷酸腺苷结合盒b亚家族成员1转运蛋白(atp-bindingcassettesubfamiliybmember1transporter，abcb1)基因，其基因编码的产物是p-糖蛋白(p-gp)。p-gp的主要功能是水解消耗atp的情况下，逆浓度梯度转运药物或内源性物质，使得细胞内的浓度下降。abcb1主要分布在上皮细胞和内皮细胞的细胞膜上。生理状态下，abcb1转运体能够将机体的毒素和外源性物质转运出细胞，起到保护的作用。abcb1的基因多态性也会引起某些药物药效的改变，研究发现，abcb1的单体型潜在的影响了他汀类药物的疗效。
抗凝药物中的香豆素抗凝血剂类(如华法林)、抗血小板凝集药物(如阿司匹林、氯吡格雷等)，也都与相关药物代谢基因相关。阿司匹林抗血小板作用机制为直接并不可逆地抑制环氧化酶1和2(cox-1和cox-2)，减前列腺素的合成，抑制血小板合成血栓素a2(txa2)，从而抑制血小板聚集。目前研究的与阿司匹林代谢相关基因有ptgs1、gp1ba、ltc4s。专利cn107142307a也公开了用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组、试剂盒及方法，所述的引物组包括针对gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g)三个基因位点多态性检测的特异性引物及探针。专利cn106434943a公开了用于阿司匹林个体化用药相关基因snp检测的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括检测ptgs1基因、cyp2c9基因、cyp2d6基因和cyp2c19基因相应位点的两条正向引物和一条反向引物。专利cn104975016b公开了阿司匹林抵抗相关的p2y1基因多态性位点及应用。专利cn106947815a公开了一种用于检测阿司匹林和硝酸甘油精准用药的方法及专用引物。若这些位点突变为失功能等位基因可使阿司匹林的疗效降低，并增加患者心血管事件的发生率。
华法林通过拮抗维生素k使肝脏合成凝血酶原及因子ⅶ、ⅸ和ⅹ减少而抗凝，是临床上常用的抗凝药物。正常剂量的华法林能够抗凝，剂量不足，达不到防止血栓的治疗效果；过量则又容易导致各种出血。由于患者个体间药物代谢能力存在差异，不同个体由于基因多态性、bmi、年龄等因素，使用华法林的有效剂量是不同的。华法林的活性成分是由药物代谢酶细胞色素p4502c9亚族(cyp2c9)代谢的，cyp2c9基因某些位点的突变或缺失会导致cyp2c9酶活性的降低，从而使得华法林在体内的代谢速度减慢。vkorc1是维生素k氧化物还原酶复合体亚单位1，它可通过抑制维生素k的氧化，促进维生素k依赖型凝血因子的形成。vkorc1基因的变异会导致该类凝血因子的增加或减少，造成患者凝血能力的升高或降低。相关研究发现cyp2c9和vkorc1基因多态性解释了50％左右的华法林个体剂量。例如：专利cn101182573a公开了华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，包括提取患者基因组dna，然后将患者年龄、体重及cyp2c9和vkorc1的基因型方便的推导出患者个体的用药剂量。专利cn102719524a公开了用于华法林个体化用药相关基因(cyp2c9和vkorc1)snp位点检测的试剂盒及其pcr扩增方法。专利twi334886b公开了vkorc1基因启动子之序列或活性可用以预测受试对象的华法林应给药剂量。2007年8月，美国fda做出明确规定，要求在华法林的商品标签上注明cyp2c9和vkorc1基因的变异会使人对药物产生不同的反应等信息，这充分体现了对服用华法林的患者进行相关基因型检测的必要性。
氯吡格雷做为广泛应用的抗凝药物，属于血小板聚集抑制剂，也存在个体疗效差异明显的现象。氯吡格雷通过选择性地抑制adp与血小板受体的结合及抑制adp介导的糖蛋白gpⅱb/ⅲa复合物的活化，而抑制血小板聚集。氯吡格雷一种前体药物，即须经体内肝细胞色素p450(cyp450)代谢转化为活性代谢物而能发挥药效。研究表明，cyp2c19基因与氯吡格雷的代谢相关。携带cyp2c19*2缺失功能等位基因者的血小板对氯吡格雷的反应显著降低，血浆中可检测到的活性代谢产物及血小板抑制明显下降，心血管事件发生率明显增高。专利cn101978073b公开了用于评估药物反应的方法和组合物，所述的方法包括使用基因(cyp2c19)多态性分析确定受试者对血小板凝集相关疾病的治疗方案或介入的适合性。专利cn106048076a公开了用于氯吡格雷个体化用药相关基因(cyp2c19*2、cyp2c19*3)snp检测的试剂盒及其检测方法。
随着基因测序技术的发展，基因组序列测定的费用越来越低，收集个体样本遗传信息的速度也越来越快。第二代高通量测序技术(next-generationsequencingtechnology)具有快速、准确、低成本的优点，可同时对多个基因的各种类型突变进行检测，已经被广泛应用于遗传缺陷的病因检测和分子遗传学诊断，然而到目前为止，一直尚未有专门针对心血管系统用药的药物代谢基因检测的高通量探针、芯片或试剂盒，使得心血管用药的药物代谢基因筛查领域的进展严重滞后，因药物疗效失败和不良药物反应事件频繁发生，用药患者的相关药物代谢基因的筛查无法施行，本能及早评估合适剂量、预测是否存在不良药物反应，避免因用药问题导致病情加重、恶化，由于没有药物代谢基因的筛查而不能及早得到关注，不仅严重影响了患者的临床治疗，也给患者和其家庭带来的巨大的痛苦和沉重的经济负担。目前商售人类全基因组外显子测序的价格在6千到8千人民币之间，而本发明的探针组的基因测序成本只有2千到3千人民币，可以大大降低患者的经济负担，是一种非常实用的心血管系统用药的药物代谢基因的筛查工具。
综上所述，开发一种高效、准确、快速、低价的心血管系统用药的药物代谢基因的试剂盒，用于心血管系统用药的药物代谢基因筛查，辅助个体化服用药物，意义非常重大。
技术实现要素：
本发明人通过创造性劳动筛选出约66种与心血管系统用药的药物代谢相关的基因，优选为39种，根据这些基因的任意组合提供相应组合的探针组、芯片或试剂盒，可以用于药物代谢研究、药物筛选、药物疗效评估或确定服用药物的剂量，优选的，研究患者携带的先天遗传或后天获得的遗传变异对药物作用的影响。通过检测所述的心血管系统用药的药物代谢相关的基因，进行用药个体分子遗传学检测、影响药物疗效多态性位点的人群普查，以期减少用药失败、药物不良反应事件的发生率。
同时，本发明所述的探针组、芯片及试剂盒具有高效、检测位点多、准确、快速、实用性强且成本低的优势。
优选的，所述筛选药物代谢相关的基因的方法为结合大量数据库检索和/或对患者基因测序结果进行筛选。进一步优选的，所述的数据库为omim数据库，通过查询omim数据库及权威文献，确定与心血管系统用药的药物代谢相关的基因。
本发明的第一方面，涉及一种检测心血管系统用药的药物代谢相关基因的试剂在制备研究药物代谢的产品中的应用，所述的药物代谢相关基因为abcb1、ace、ace2、acy3、add1、adra1a、adra2a、adrb1、adrb2、agt、agtr1、aox1、apob、apoe、bdkrb2、c18orf21、cacna1c、camk1d、coq2、cyp11b2、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d6、cyp3a4、cyp3a5、dpys、galnt2、gnb3、gp1ba、hmgcr、kcne1、kcnh2、kcnj1、kif6、ldlr、ltc4s、mmp3、mthfr、mtr、mtrr、nat2、nedd4l、nos1ap、prkca、nos3、nr1h3、nr3c2、pear1、plcd3、ppara、prcp、yeats4、prox1、ptgs1、ptgs2、ptprd、scn1a、slc14a2、slco1b1、stk39、tcf7l2、tlr4、trib3、vkorc1、wnk1或cyp4f2中的两种或两种以上的组合。
优选的，所述的药物代谢相关基因为cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、slco1b1、apoe、nat2、cyp3a5、slc14a2、kcnh2、cacna1c、nos1ap、plcd3、gnb3、abcb1、agtr1、ace、bdkrb2、ptprd、cyp11b2、adrb2、adrb1、acy3、adra2a、stk39、yeats4、kcnj1、add1、ptgs1、ltc4s、cyp3a4、pear1、coq2、kcne1、scn1a、aox1、vkorc1、cyp4f2、tlr4或mthfr中的两种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的试剂能同时特异性捕获66/39个心血管系统用药的药物代谢基因，所述的药物代谢相关基因为abcb1、ace、ace2、acy3、add1、adra1a、adra2a、adrb1、adrb2、agt、agtr1、aox1、apob、apoe、bdkrb2、c18orf21、cacna1c、camk1d、coq2、cyp11b2、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d6、cyp3a4、cyp3a5、dpys、galnt2、gnb3、gp1ba、hmgcr、kcne1、kcnh2、kcnj1、kif6、ldlr、ltc4s、mmp3、mthfr、mtr、mtrr、nat2、nedd4l、nos1ap、prkca、nos3、nr1h3、nr3c2、pear1、plcd3、ppara、prcp、yeats4、prox1、ptgs1、ptgs2、ptprd、scn1a、slc14a2、slco1b1、stk39、tcf7l2、tlr4、trib3、vkorc1、wnk1和cyp4f2的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的药物代谢相关基因为cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、slco1b1、apoe、nat2、cyp3a5、slc14a2、kcnh2、cacna1c、nos1ap、plcd3、gnb3、abcb1、agtr1、ace、bdkrb2、ptprd、cyp11b2、adrb2、adrb1、acy3、adra2a、stk39、yeats4、kcnj1、add1、ptgs1、ltc4s、cyp3a4、pear1、coq2、kcne1、scn1a、aox1、vkorc1、cyp4f2、tlr4和mthfr的组合。
优选的，所述的药物代谢相关基因为心血管系统用药的药物代谢基因。
优选的，根据上述各基因通过公知、通用的方法设计并合成探针序列，对目的片段进行特异性捕获、扩增、测序，以达到检测样本的目的。
本发明所述的研究药物代谢包括心血管系统用药的药物代谢研究、药物筛选、药物疗效评估或剂量确定。
优选的，所述的研究药物代谢为研究患者携带的先天遗传或是后天获得的遗传变异对药物作用的影响。
优选的，所述的药物代谢为药物的吸收、分布、代谢、排泄(adme)过程以及药物受体靶标。
本发明所述的药物代谢相关基因单独或其组合作为心血管系统用药的药物代谢研究的靶点。
优选的，本发明所述的各药物代谢相关基因发生突变可以指示该药物的代谢情况及个体耐受、抗药情况。
优选的，通过基因测序的方法进行各基因或其基因组合的突变检测。
优选的，所述的试剂选自检测心血管系统用药的药物代谢相关基因的探针组、引物组或基因芯片；所述的产品包括所述的试剂，或者，所述的产品为试剂盒。
本发明的第二方面，涉及一种应用本发明所述的试剂进行基因检测的方法，包括将待检dna与所述的试剂混合。
优选的，所述的试剂为探针组、引物组或基因芯片。
优选的，所述的基因检测包括检测所述基因的有或无，或者，突变的有或无。进一步优选的，所述的突变选自剪切位点突变、无义突变或移码突变。
优选的，所述的基因检测包括检测所述基因的水平。
本发明所述的基因检测的方法可以为非诊断目的或诊断目的。
本发明所述的非诊断目的为应用所述的探针组检测上述基因组合中各基因的突变有或无以及检测上述基因组合中各基因的水平。
本发明所述的诊断目的为应用所述的探针组检测上述基因后诊断或预测患者是否适合服用该药物、服用药物的副作用或服用药物的剂量确定。
本发明的第三方面，涉及一种含有本发明所述的检测心血管系统用药的药物代谢相关基因的探针组的基因芯片。
优选的，所述的基因芯片还包括固相载体。进一步优选的，所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片或聚丙烯膜中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述的基因芯片还包括相应的引物组。
优选的，所述探针固定在固相载体上的方法选自原位合成法、点样法或其他固定方法。
其中，将基因芯片中的探针固定在所述的固相载体上。优选的，将探针序列密集有序地排列固定在固相载体预先设置的区域内，形成微型检测器件。
本发明的第四方面，涉及一种含有本发明所述的检测心血管系统用药的药物代谢相关基因的探针组或本发明所述的基因芯片的试剂盒。
优选的，所述的试剂盒还包括杂交液和/或缓冲液和/或洗涤液。
进一步优选的，所述试剂盒还包括富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液、naoh溶液、tris-hcl缓冲液、pcr反应液、te缓冲液。
本发明的第五方面，提供了一种所述的含有探针组的试剂盒的制备方法，包括：
1)根据上述心血管系统用药的药物代谢基因制备相应的探针序列；
2)为步骤1)获得的探针序列加上生物素标记；
3)配制所需杂交液和/或缓冲液和/或洗涤液。
本发明的第六方面，涉及一种检测心血管系统用药的药物代谢相关基因的试剂，所述的药物代谢相关基因为abcb1、ace、ace2、acy3、add1、adra1a、adra2a、adrb1、adrb2、agt、agtr1、aox1、apob、apoe、bdkrb2、c18orf21、cacna1c、camk1d、coq2、cyp11b2、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d6、cyp3a4、cyp3a5、dpys、galnt2、gnb3、gp1ba、hmgcr、kcne1、kcnh2、kcnj1、kif6、ldlr、ltc4s、mmp3、mthfr、mtr、mtrr、nat2、nedd4l、nos1ap、prkca、nos3、nr1h3、nr3c2、pear1、plcd3、ppara、prcp、yeats4、prox1、ptgs1、ptgs2、ptprd、scn1a、slc14a2、slco1b1、stk39、tcf7l2、tlr4、trib3、vkorc1、wnk1或cyp4f2中的两种或两种以上的组合。
优选的，所述的药物代谢相关基因为cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、slco1b1、apoe、nat2、cyp3a5、slc14a2、kcnh2、cacna1c、nos1ap、plcd3、gnb3、abcb1、agtr1、ace、bdkrb2、ptprd、cyp11b2、adrb2、adrb1、acy3、adra2a、stk39、yeats4、kcnj1、add1、ptgs1、ltc4s、cyp3a4、pear1、coq2、kcne1、scn1a、aox1、vkorc1、cyp4f2、tlr4或mthfr中的两种或两种以上的组合。
其中，所述的试剂选自探针组、引物组或基因芯片。
本发明的第七方面，涉及一种心血管系统用药的药物代谢相关基因的检测方法，包括：
(1)提取待检测的dna，制备全基因组文库；
(2)将步骤(1)获得的全基因组文库与所述检测心血管系统用药的药物代谢相关基因的试剂混合，进行pcr；
(3)纯化步骤(2)所述的pcr产物；
(4)对步骤(3)纯化后的pcr产物进行测序；
(5)对步骤(4)的测序结果进行分析；
其中，所述的试剂选自探针组、引物组或基因芯。
优选的，所述的分析包括snp分析和/或indel分析。
本发明的第八方面，涉及一种研究药物代谢的标志物，所述的标志物选自基因abcb1、ace、ace2、acy3、add1、adra1a、adra2a、adrb1、adrb2、agt、agtr1、aox1、apob、apoe、bdkrb2、c18orf21、cacna1c、camk1d、coq2、cyp11b2、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d6、cyp3a4、cyp3a5、dpys、galnt2、gnb3、gp1ba、hmgcr、kcne1、kcnh2、kcnj1、kif6、ldlr、ltc4s、mmp3、mthfr、mtr、mtrr、nat2、nedd4l、nos1ap、prkca、nos3、nr1h3、nr3c2、pear1、plcd3、ppara、prcp、yeats4、prox1、ptgs1、ptgs2、ptprd、scn1a、slc14a2、slco1b1、stk39、tcf7l2、tlr4、trib3、vkorc1、wnk1或cyp4f2中的两种或两种以上的组合。
优选的，所述的标志物选自基因为cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、slco1b1、apoe、nat2、cyp3a5、slc14a2、kcnh2、cacna1c、nos1ap、plcd3、gnb3、abcb1、agtr1、ace、bdkrb2、ptprd、cyp11b2、adrb2、adrb1、acy3、adra2a、stk39、yeats4、kcnj1、add1、ptgs1、ltc4s、cyp3a4、pear1、coq2、kcne1、scn1a、aox1、vkorc1、cyp4f2、tlr4或mthfr中的两种或两种以上的组合。
本发明的第九方面，涉及心血管系统用药的药物代谢相关基因在制备研究药物代谢的产品中的应用，所述的药物代谢相关基因为abcb1、ace、ace2、acy3、add1、adra1a、adra2a、adrb1、adrb2、agt、agtr1、aox1、apob、apoe、bdkrb2、c18orf21、cacna1c、camk1d、coq2、cyp11b2、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d6、cyp3a4、cyp3a5、dpys、galnt2、gnb3、gp1ba、hmgcr、kcne1、kcnh2、kcnj1、kif6、ldlr、ltc4s、mmp3、mthfr、mtr、mtrr、nat2、nedd4l、nos1ap、prkca、nos3、nr1h3、nr3c2、pear1、plcd3、ppara、prcp、yeats4、prox1、ptgs1、ptgs2、ptprd、scn1a、slc14a2、slco1b1、stk39、tcf7l2、tlr4、trib3、vkorc1、wnk1或cyp4f2中的两种或两种以上的组合。
优选的，所述的药物代谢相关基因为cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、slco1b1、apoe、nat2、cyp3a5、slc14a2、kcnh2、cacna1c、nos1ap、plcd3、gnb3、abcb1、agtr1、ace、bdkrb2、ptprd、cyp11b2、adrb2、adrb1、acy3、adra2a、stk39、yeats4、kcnj1、add1、ptgs1、ltc4s、cyp3a4、pear1、coq2、kcne1、scn1a、aox1、vkorc1、cyp4f2、tlr4或mthfr中的两种或两种以上的组合。
本发明的第十方面，涉及一种检测心血管系统用药的药物代谢相关基因的试剂在制备产品中的应用，所述的产品为心血管系统用药的药物代谢研究、药物筛选、药物疗效评估或剂量确定的产品，或者，研究患者携带的先天遗传或后天获得的遗传变异对心血管药物作用的影响，或者，心血管系统患者预后评估、孕前预警指示后代对心血管系统用药的药物代谢的风险度评估的产品。优选的，所述的产品选自探针组、试剂盒、基因芯片或药物。
本发明的第十一方面，涉及一种心血管系统用药的剂量确定方法，所述的方法包括检测心血管系统用药的药物代谢相关基因的试剂检测心血管系统用药的药物代谢相关基因的突变或水平。
本发明所述的心血管系统用药选自他汀类降脂药、抗血小板药、抗心绞痛药、抗心律失常药、抗高血压药、抗心功能不全药、周围血管扩张药、钙拮抗药、服抗凝药、β受体阻断剂或血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensinconvertingenzymeinhibitors，acei)；所述的抗心绞痛药选自硝酸酯类、硝酸甘油类、硝苯地平类或地尔硫卓类。优选的，所述的心血管系统用药选自阿司匹林、硝酸甘油、华法林、氯吡格雷、辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀、硝酸甘油。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1本发明探针组的设计和制备
一、心血管系统用药的药物代谢基因的筛选
本实施例中的检测心血管系统用药的药物代谢相关基因为：abcb1、ace、ace2、acy3、add1、adra1a、adra2a、adrb1、adrb2、agt、agtr1、aox1、apob、apoe、bdkrb2、c18orf21、cacna1c、camk1d、coq2、cyp11b2、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d6、cyp3a4、cyp3a5、dpys、galnt2、gnb3、gp1ba、hmgcr、kcne1、kcnh2、kcnj1、kif6、ldlr、ltc4s、mmp3、mthfr、mtr、mtrr、nat2、nedd4l、nos1ap、prkca、nos3、nr1h3、nr3c2、pear1、plcd3、ppara、prcp、yeats4、prox1、ptgs1、ptgs2、ptprd、scn1a、slc14a2、slco1b1、stk39、tcf7l2、tlr4、trib3、vkorc1、wnk1及cyp4f2。
对35位确诊为心血管系统疾病(5位确诊为嗜铬细胞瘤，4位确诊为原发性肺动脉高压，3位确诊为家族性高胆固醇血症，2位确诊为家族性高甘油三脂血症，8位确诊为遗传性主动脉疾病，13位确诊为心律失常)的患者(患者位医院临床确诊的心血管系统疾病，且各患者均签署知情及自愿协议，并经医院医学伦理委员会批准)，并服用心血管药物(氨氯地平、氯沙坦、洛沙坦、卡托普利、氯吡格雷、华法林、辛伐他汀、阿托伐他汀、苯妥英)3个月以上的患者进行全外显子组测序，覆盖、检测范围为人类基因组已知的全部3万余个基因的所有外显子，其中，突变基因高度集中，基因组的其余基因(占绝大多数)虽然也有累及，但突变频率非常低，很多甚至只在单一患者有发现，其与疾病的相关性难以确定。因此在设计本发明探针组时，纳入在本病患者发生突变概率最高的上述66个基因，其突变累及频率均大于5，这样能够在最大限度地增加检出药物代谢相关基因的同时合理控制检测成本。
从上述66种药物代谢相关基因中优选39种基因为：cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、slco1b1、apoe、nat2、cyp3a5、slc14a2、kcnh2、cacna1c、nos1ap、plcd3、gnb3、abcb1、agtr1、ace、bdkrb2、ptprd、cyp11b2、adrb2、adrb1、acy3、adra2a、stk39、yeats4、kcnj1、add1、ptgs1、ltc4s、cyp3a4、pear1、coq2、kcne1、scn1a、aox1、vkorc1、cyp4f2、tlr4及mthfr。
二、探针的制备
根据上述药物代谢基因(66种/39种)的基因组序列，本领域技术人员可以通过公知、通用的方法设计并合成探针序列(例如专利wo2013/003585)，本实施例中对合成的探针序列进行生物素标记，具体操作为：采用本领域公知方法合成探针序列，均匀混合在总体积1.2ml的dh2o中，取其中15μl利用通用的pcr引物(5’端序列为gactacatgggacat(seqidno：1)、3’端的序列为ggaacctacgacgta(seqidno：2))，分三管进行pcr扩增，其中引物gactacatgggacat(seqidno：1)为带有生物素标记的引物。
pcr扩增体系：上述探针溶液，5μl；正向引物(25μm)，2μl；反向引物(25μm)，2μl；mgcl2(50mm)，4μl；10xplatinumtaq聚合酶缓冲液(购自lifetechnologies)，5μl；dntps(每种10mm)，4μl；platinumtaq聚合酶(5u/μl，购自lifetechnologies)，1μl；h2o，27μl；总体积50μl。
扩增条件：98℃，30s；(98℃，30s，60℃，25s，72℃，45s)35个循环；72℃，5min。
将pcr产物用minelutepcr纯化试剂盒(购自lifetechnologies)纯化后，取500ng，用myone链酶亲和素磁珠(购自invitrogen)将pcr产物结合下来。然后加入碱性naoh将没有生物素的互补链变性、洗脱下来；然后将整个磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤，使探针从磁珠上分离下来。用乙醇沉淀后即得到生物素标记的本实施例的探针组。
实施例2：本发明试剂盒组成、制备及使用
本实施例所述的用于检测心血管系统用药的药物代谢基因的试剂盒，是通过检测上述66/39个药物代谢基因的突变来辅助用药者的个性化用药或疗效不足、用药不良反应风险预测的试剂盒。
一、试剂盒的组成
所述试剂盒包含的成分为：实施例1所获得的探针组(160μl，150ng/μl)、富集缓冲液(208μl)、杂交缓冲液(800μl)、结合缓冲液(3.2ml)、漂洗液1(9ml)、漂洗液2(45ml)、naoh溶液(0.1m，1ml)、tris-hcl缓冲液(1m，ph7.5，1.2ml)、pcr反应液(580μl)、te缓冲液(800μl，10mmtris-hcl，1mmedta，调ph至8.0，水定容至500ml)。其中各缓冲液组成如下：
(1)富集缓冲液(每20μl)：
人cot-1dna(购自invitrogen)，7μl；鲑鱼精dna(购自invitrogen)，3μl；
特异性封闭引物，共10μl，每种引物浓度为1nmol/μl：
引物1：
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctct(seqidno：3)；
引物2：
caagcagaagacggcatacgagatcggtctcggcattcctgctgaaccgc(seqidno：4)；
(2)杂交缓冲液：5倍浓度的sspe(购自amresco公司)，5倍浓度的denhardt溶液(购自usb公司)，5mmedta(0.5m，ph8.0，购自mediatech公司)，0.1％sds；
(3)结合缓冲液：1mnacl，10mmtris-hcl(ph7.5)，1mmedta
(4)漂洗液1：1倍浓度的ssc溶液(nacl175g，柠檬酸三钠88g，调ph至7.4，dh2o定容至1升)，0.1％sds
(5)漂洗液2：0.1倍浓度的ssc溶液(nacl175g，柠檬酸三钠88g，调ph至7.4，dh2o定容至1升)，0.1％sds
(6)pcr反应液：2μldntps(每种10mm)，
0.5μl引物1(aatgatacggcgaccaccga*g(seqidno：5)，50pmol)，
0.5μl引物2(caagcagaagacggcatacg*a(seqidno：6)，50pmol)，20μl5倍浓度的phusion缓冲液(newenglandbiolab公司)，1μlhotstartphusion酶(购自newenglandbiolabs)，5μldmso，51μldh2o；*表示中间有硫代修饰；
二、试剂盒的应用
1、dna提取及全基因组文库制备
使用qiagendnaminikit(250)(购自qiagen)试剂盒提取外周血中的dna。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳检测样本质量，完整的基因组dna电泳条带通常应不小于20kb。质检合格的dna将浓度调整到75ng/μl，总量3-5μgdna随机打断、扩增，从而建立全基因组文库。
2、目标药物代谢基因片段的特异性捕获及测序
1)制备以下混合体系：取1μg步骤1的构建好的全基因组文库，13μl富集缓冲液，5μl实施例1的本发明探针组；置于pcr仪上：95℃，7min，之后65℃，2min；
2)取65℃预热的杂交缓冲液23μl加入到上述步骤1)得到的混合液中，然后于pcr仪上65℃杂交22小时，得到富集体系混合物。
3)将myonec1链霉亲和素磁珠(购自invitrogen)漩涡震荡使磁珠充分悬浮，短暂离心，使磁珠离心至管底部，取50μlmyonec1链霉亲和素磁珠到新的1.5ml的离心管。
4)将装有50μlmyonec1链霉亲和素磁珠的1.5ml离心管漩涡震荡至少5s，使磁珠充分悬浮，短暂离心后放入磁力架上保持静止一分钟(不要旋转离心管)，小心吸弃上清。
5)取下离心管，加入50μl的1倍浓度的结合缓冲液，旋窝震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，小心吸弃上清，重复三次。
6)取下离心管，加入100μl的2倍浓度的结合缓冲液，旋窝震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟。
7)将步骤2)得到的富集体系混合物加入到骤6)的离心管中，旋窝震荡至少5s(不用离心)，置于旋转仪上室温旋转1小时(60转/分钟)。
8)然后，利用漂洗液1室温清洗步骤7)的磁珠一次，15分钟，然后再用漂洗液2清洗3次，65℃，每次15分钟。
9)将步骤8)的磁珠用0.1mnaoh室温下洗脱10分钟，然后将洗脱液漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，然后将上清液转移到含有70μltris-hcl缓冲液(1m，ph7.5)的干净离心管中。
10)采用qiagenminelutecolumn(购自qiagen)对步骤9)得到的dna溶液进行纯化，其纯化步骤参照qiagenminelutekit的实验操作手册。
11)纯化的dna通过pcr最终扩增15个循环：
pcr反应液：2μldntps(每种10mm)，
0.5μl引物1(aatgatacggcgaccaccga*g(seqidno：5)，50pmol)，
0.5μl引物2(caagcagaagacggcatacg*a(seqidno：6)，50pmol)，20μl5倍浓度的phusion缓冲液(购自newenglandbiolabs)，1μlhotstartphusion酶(购自newenglandbiolabs)，5μldmso，51μldh2o；*表示中间有硫代修饰。pcr程序:98℃，30s(1cycle)；98℃，25s；65℃，30s；72℃，30s(15cycles)；72℃，5min(1cycle)。
12)利用agencourtampurexp核酸纯化试剂盒(购自beckmancoulter)，根据使用手册纯化步骤11)的pcr产物。
13)将步骤12)得到的dna产物在illuminanexseq500测序仪上进行测序。
3、生物信息学分析流程及结果输出：
(1)snp分析流程
①获取原始短序列；
②去除测序数据中的接头和低质量数据等；
③把短序列用soapaligner软件定位到人mhc3.6m基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20-a-b-t-v3-l42-s63-m100-x400，其中序列错配数为3，具体参数含义参考：http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html；
④统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；
⑤soapsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：soapsnp-i-d-o-r0.00005-e0.0001-m-t-u-l-s-2–t，具体参数含义参考：http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；
⑥过滤低质量值(质量值>＝20)和低覆盖度(深度>＝10)的snp；
⑦利用ccds、人基因组数据库(ncbi37.2)、dbsnp(v138)信息对snp进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mrna位点、氨基酸改变、snp功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、sift预测snp影响蛋白功能预测等；
⑧根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的snp作为候选的snps，在候选的snps中去除掉在dbsnp、hapmap、1000人mhc3.6m基因组、其他外显子测序项目中出现的snp。同时，过滤掉sift预测对蛋白功能无影响的snps作为最后疾病相关的候选snps；
(2)indel分析流程
①把去除接头序列和低质量的测序数据用burrows-wheeleraligner(bwa)比对到人mhc3.6m基因组上，所用到参数：bwaaln-l-l31-i10-k2-t7-e40，具体参数含义参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；
②用gatk软件找出序列中所含有的插入/缺失(indel)的信息；
③利用ccds、人基因组数据库(ncbi37.2)、dbsnp(v138)信息对indel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mrna位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、indel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)。
实施例3：本发明试剂盒的使用效果验证
利用本发明所述试剂盒检测(实施例2制备获得的包含66种基因的检测探针)50例样本，结果证实目的药物代谢基因的捕获率满意，目标区域的平均有效测序数据量达到221.97mb，目标区域的平均测序深度为512.3x(见表1)，远远高于一般的遗传疾病诊断要求(一般为20x)。
表1目的药物代谢基因测序数据质量
综上所述，本发明提供的用于检测心血管系统用药的药物代谢基因的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点，可以同时最多检测、明确66/39个心血管系统用药的药物代谢基因的各种类型突变，因此本发明的探针组和试剂盒可应用于用药个体的分子遗传学诊断，同时还可用筛查用药者家属中的药物不良反应高危人群，以及进行相应的遗传咨询或产前干预提供参考。由于心血管疾病用药一般长期服用，故其可能发生的用药失败和药物不良反应的后果是非常严重的，如发生急性心脑血管事件、严重器官功能损害等，检测用药患者的药物代谢基因，可准确指导患者的个体化用药，保证心血管药物的使用疗效，保证用药患者的健康。本发明的使用可以为对患者采取正确、合理、个体化的用药指导提供依据，符合精准医疗的发展趋势。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110>中国人民解放军总医院
北京迈基诺基因科技股份有限公司
<120>一种检测心血管系统用药的标志物
<130>1
<160>6
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>15
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gactacatgggacat15
<210>2
<211>15
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ggaacctacgacgta15
<210>3
<211>50
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctct50
<210>4
<211>50
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
caagcagaagacggcatacgagatcggtctcggcattcctgctgaaccgc50
<210>5
<211>21
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
aatgatacggcgaccaccgag21
<210>6
<211>21
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
caagcagaagacggcatacga21