一种杨梅菌种驯化方法与流程

本发明属于果酒酿造技术领域，尤其涉及一种杨梅菌种驯化方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：杨梅主要分布在我国长江以南各地，其中2016年赣州市杨梅的栽培面积达8000亩以上，总产量达2万吨，产生经济价值达10万元。杨梅果实营养价值高，富含纤维素、矿物质元素、维生素和一定量的蛋白质、脂肪、果胶以及8种对人体有益的氨基酸，其钙、磷、铁含量要高出其他水果10多倍；其次，杨梅主要生长在山区，因极少被污染、栽培管理粗放、病虫危害较少等，具有“绿色无公害水果”之美誉。《本草纲目》记载，杨梅有“生津、止渴、调五脏、涤肠胃、除烦愦恶气”的功效。但杨梅是一种极不耐储运的水果品种，果实成熟期集中在高温多雨的六七月份，有“一日味变、二日色变、三日质变”的说法。尤其在杨梅高产地区，时常出现由于未能及时对杨梅进行鲜销和加工，导致大量杨梅腐烂变质，不仅浪费资源，且严重影响果农的经济效益。其次，每年杨梅的落果率高达三分之一，这一部分落地果几乎没有被利用，因此，如何做好杨梅鲜果甚至是落地果的深加工一直是学者的研究热点，而将杨梅加工成杨梅酒就是对杨梅果实充分利用、提高其附加值最可行的办法。目前赣州乃至全国市场上，杨梅深加工产品较少，多以鲜果销售，市场上已有的较成熟的杨梅深加工产品为杨梅酒，但大部分在售杨梅酒都是浸泡型，鲜少发酵型杨梅酒。为开发出一款新型杨梅发酵饮品，本发明组已开始做了初步研究。

综上所述，现有技术存在的问题是：

传统杨梅酒对杨梅果实加以浸泡，即将采摘的新鲜杨梅浸泡于高浓度酒精的白酒中一段时间，杨梅汁渗透到酒液中，酒也进入到杨梅果肉中，得到的杨梅酒和杨梅果实可同时食用。近年来，我国杨梅酒的加工和研究逐渐从浸泡型杨梅酒转向酿造型杨梅酒，但常采用葡萄酒酵母发酵和空气和果皮中的酵母自然发酵。以上传统菌种发酵生产的酒均一定的弱点，葡萄酒酵母不耐酸，在杨梅汁中生长慢，生产的酒有较重双乙酰味，需存放长时间才会减轻；自然酵母发酵，酵母种类和杂菌多，细菌易生长，酒精度低，有发酵异味。

解决上述技术问题的难度和意义：

针对以上情况，本发明将葡萄酒酵母从斜面试管分别接种到不同浓度梯度杨梅汁的培养基当中，在30℃下培养2天，观察气泡产生情况，采用血球计数法测菌体浓度，取杨梅原汁浓度较高且菌体浓度大的稀释涂平板(杨梅汁中加2％营养琼脂，制成固体培养基)，30℃下培养，挑取最大尽量菌落，不断重复以上操作，直至出现酵母在较高浓度杨梅汁中起酵时间在24小时以内的，取发酵液稀释涂平板，挑取大菌落涂斜面保存。通过葡萄酒酵母的多次驯化，驯化出适合于杨梅酒生产的酵母菌株。驯化后的葡萄酒酵发酵速度快，且生产出来的杨梅酒呈红色、澄清透明,果香浓郁、与酒香协调,酒体丰满醇厚，纯净新鲜爽怡口感，味道纯正、完整，协调适口无异味。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种杨梅菌种驯化方法。

本发明是这样实现的，一种杨梅菌种驯化方法，所述杨梅菌种驯化方法包括以下步骤：

(1)配制杨梅汁质量比含量20％、4-6°bx麦汁质量比含量80％的培养液100ml，加入活化的酵母10ml，在30℃温度下培养，前12小时通氧3次，每4小时通一次；12小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×10⁸个/ml时，进行下一步操作；

(2)配制杨梅汁质量比含量40％、4-6°bx麦汁质量比含量60％，调整糖度至20°bx的培养液100ml，加入培养的酵母10ml，在30℃温度下培养，前16小时每4小时通氧一次；16小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×10⁸个/ml时，进行下一步操作；

(3)配制杨梅汁质量比含量60％、4-6°bx麦汁含量40％，调整糖度至20°bx的培养液100ml，加入培养的质量比酵母10ml，在30℃温度下培养，前20小时每4小时通氧一次；20小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×10⁸个/ml时，进行下一步操作；

(4)配制杨梅汁含质量比量80％、4-6°bx麦汁含质量比量80％，调整糖度至20°bx的培养液100ml，加入培养的酵母10ml，在30℃温度下培养，前24小时每4小时通氧一次；24小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×10⁸个/ml时，进行下一步操作；

(5)配制杨梅汁质量比含量100％，调整糖度至20°bx的培养液100ml，加入上一步骤培养的酵母10ml，在30℃温度下培养，前28小时每4小时通氧一次；28小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×10⁸个/ml时，进行下一步操作；

(6)将所得酵母培养液在无菌条件下1000r/min离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再离心得湿菌体，加入无菌水制成菌悬液；

(7)配制2％海藻酸钠和6％聚乙烯醇混合载体溶液灭菌冷却后，与菌悬液混合均匀，凝胶内包埋菌量大于4.7×10⁷cfu/ml，用注射器将其注入交联剂cacl2溶液中，形成小球，在交联剂中硬化4h，用无菌水洗涤；

(8)将步骤(7)中配制的包埋菌小球10个，置于100ml杨梅汁质量比含量100％糖度20°bx的培养液中，在30℃温度下培养，前12h每4小时通氧一次，12h后停止通氧，培养至出现大量气泡；

(9)破碎步骤(8)包埋菌小球，放置于杨梅汁质量比含量100％，调整糖度至20°bx的培养液100ml中，在30℃温度下培养，前28小时每4小时通氧一次；28小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×10⁸个/ml；

(10)重复步骤(6)、(7)、(8)、(9)，直至制作的包埋菌小球能在24h内起酵，产生酒精，即为驯化完成。

进一步，杨梅汁的制取包括：

⑴、原料的选择：以自然落地杨梅果为主，也可以是新鲜熟杨梅，去除腐败、过熟、变质的杨梅果；

⑵、浸泡：把清理好的新鲜杨梅放入3％的食盐水中浸泡约15至20分钟；

⑶、清洗：把浸泡过的杨梅放在纯水中清洗2－3分钟以去除食盐；

⑷、去核、取汁：利用杨梅取汁机对浸泡好的杨梅去核打浆；分两步对杨梅果浆进行过滤，即先利用滤孔大小约0.5mm的振动筛对杨梅果浆进行粗滤，再利用纱布对粗滤好的果浆进行精滤。

进一步，安琪葡萄酒酵母复水活化，选取安琪葡萄酒活性干酵母，加入高温消毒后4-6°bx浓度的麦汁中，麦汁用量为干酵母的5-10倍；在30℃培养，每隔10分钟摇瓶2分钟，活化2小时。

进一步，所述杨梅榨汁条件出汁率75％。

进一步，所述酵母菌株在ph值3.0以上环境下正常发酵；酒质的香味好；酵母凝集性强。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：(1)菌种驯化创新，传统杨梅酒对杨梅果实加以浸泡，即将采摘的新鲜杨梅浸泡于高浓度酒精的白酒中一段时间，杨梅汁渗透到酒液中，酒也进入到杨梅果肉中，得到的杨梅酒和杨梅果实可同时食用。近年来，我国杨梅酒的加工和研究逐渐从浸泡型杨梅酒转向酿造型杨梅酒，但常采用葡萄酒酵母发酵和空气和果皮中的酵母自然发酵。以上传统菌种发酵生产的酒均一定的弱点，葡萄酒酵母不耐酸，在杨梅汁中生长慢，生产的酒有较重双乙酰味，需存放长时间才会减轻；自然酵母发酵，酵母种类和杂菌多，细菌易生长，酒精度低，有发酵异味。针对以上情况，本发明选用葡萄酒酵母经过多次驯化，驯化出适合于杨梅酒生产的酵母菌株。

(2)固定化发酵创新，采用固定化酵母发酵生产杨梅酒，与游离细胞发酵相比，固定化发酵酒液残糖含量更低，有利于生产干型杨梅果酒。其果酒色泽呈现杨梅特有的暗红色，相比游离细胞发酵酒液的棕红色，更加浓郁诱人。酵母易于酒液分离，而且酒液澄清透明，易于进行下一步的澄清操作，耗能少。固定化细胞在25℃发酵不仅有利于增强酒液色泽，而且酒液残糖量低，口感柔和，果香怡人。

(3)采用自然落地杨梅次果为主要原料，合理的利用次果，增加杨梅的附加值，提高杨梅的种植和加工效益，促进发酵型杨梅酒的规模化生产经营，带动杨梅种植业的发展，提高杨梅的产业化水平，增强我国杨梅产业的国际竞争能力。

(4)护色创新，so2是国际上许可加入在果实、果汁和果酒中的抗氧化剂和防腐剂。so2在葡萄酒中除作抗氧化剂和防腐剂外，还有溶解红葡萄中的色素、增酸和增加葡萄酒风味的作用，由于萄萄酒都添加so2发酵，缺少so2萄萄酒就显淡泊。但so2对健康有一定的损害，二氧化硫及其衍生物不仅对呼吸器官有毒理作用，对脑、心、肝、胃、肠、脾、胸腺、肾、睾丸及骨髓细胞均有毒理作用，而且是一种具有多种毒性作用的有毒物质，干酒中so2量控制不当时，会有干喉的不良反应。绿色果酒，不应含有so2。本发明为生产绿色优质杨梅新型发酵饮品，必须使用天然抗氧化植物代替so2作防腐剂和抗氧化剂。项目选用了多种具有抗氧化和抗菌作用的植物，进入多次与杨梅汁混合发酵酿制杨梅酒试验，终于选出了药食两用植物代替so2作为抗氧化剂，不但效果显著，还增强了酒的风味。

(5)地域创新，目前赣南市场上没有成熟的发酵型杨梅酒及其饮品，本发明填补了赣南市场的空白。

附图说明

图1是本发明实施例提供的杨梅菌种驯化方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明旨在以自然落地杨梅果为主要原料，经榨汁、护色、灭菌，接入酵母菌发酵，经后续调配生产低酒精度的新型杨梅发酵饮品，既合理的利用次果以提高附加值，又开发一种色泽艳丽、果香浓郁、酸甜可口的深受广大消费者喜爱的新型杨梅发酵饮品。葡萄酒酵母(购自安琪酵母有限公司，葡萄酒酵母rv171)。

如图1所示，本发明实施例提供的杨梅菌种驯化方法包括以下步骤：

s101：优化杨梅榨汁条件，提高其出汁率；

s102：对落地杨梅榨汁后汁液糖度、酸度、理化指标、微生物指标研究，以达到每批次产品各项参数保持一致；

s103：采用杨梅果汁配制的培养基对葡萄酒酵母进行驯化，然后用三角瓶进行扩大培养，生长繁殖旺盛的菌种可直接供发酵使用，以适应杨梅果汁的强酸环境；

s104：筛选天然抗氧化剂，用以代替so2抗氧化剂，减少杨梅酒中花色苷的变色，增加产品品质和营养价值；

s105：筛选出合适浓度的固定化葡萄酒酵母材料，以保持最佳发酵活性；

s106：筛选出最佳的酵母添加量、发酵温度、发酵时间、加糖量，以达到最佳产品质量；

s107：筛选出合适的澄清剂，同时确定最佳的澄清剂浓度，以保证杨梅发酵新型饮品的透亮；

s108：对最终产品的颜色、香味、糖度、酸度进行标准化调配。

本发明实施例提供的杨梅菌种驯化方法具体包括以下步骤：

(一)杨梅汁的制取

⑴、原料的选择：以自然落地杨梅果为主，也可以是新鲜熟杨梅，去除腐败、过熟、变质的杨梅果。

⑵、浸泡：把清理好的新鲜杨梅放入3％的食盐水中浸泡约15至20分钟。

⑶、清洗：把浸泡过的杨梅放在纯水中清洗2－3分钟以去除食盐。

⑷、去核、取汁：利用杨梅取汁机对浸泡好的杨梅去核打浆。分两步对杨梅果浆进行过滤，即先利用滤孔大小约0.5mm的振动筛对杨梅果浆进行粗滤，再利用纱布对粗滤好的果浆进行精滤。

(二)安琪葡萄酒酵母复水活化

选取安琪葡萄酒活性干酵母，加入高温消毒后4-6°bx浓度的麦汁中，麦汁用量为干酵母的5-10倍。在30℃培养，每隔10分钟摇瓶2分钟，活化2小时。

(三)驯化

(1)、配制杨梅汁含量20％(质量比)、4-6°bx麦汁含量80％(质量比)的培养液100ml，加入步骤(二)活化的酵母10ml，在30℃温度下培养，前12小时通氧3次，每4小时通一次。12小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×10⁸个/ml时，进行下一步操作。

(2)配制杨梅汁含量40％(质量比)、4-6°bx麦汁含量60％(质量比)，调整糖度至20°bx的培养液100ml，加入上一步骤培养的酵母10ml，在30℃温度下培养，前16小时每4小时通氧一次。16小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×108个/ml时，进行下一步操作。

(3)配制杨梅汁含量60％(质量比)、4-6°bx麦汁含量40％(质量比)，调整糖度至20°bx的培养液100ml，加入上一步骤培养的酵母10ml，在30℃温度下培养，前20小时每4小时通氧一次。20小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×108个/ml时，进行下一步操作。

(4)配制杨梅汁含量80％(质量比)、4-6°bx麦汁含量80％(质量比)，调整糖度至20°bx的培养液100ml，加入上一步骤培养的酵母10ml，在30℃温度下培养，前24小时每4小时通氧一次。24小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×10⁸个/ml时，进行下一步操作。

(5)配制杨梅汁含量100％(质量比)，调整糖度至20°bx的培养液100ml，加入上一步骤培养的酵母10ml，在30℃温度下培养，前28小时每4小时通氧一次。28小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×10⁸个/ml时，进行下一步操作。

(6)将所得酵母培养液在无菌条件下1000r/min离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再离心得湿菌体，加入无菌水制成一定浓度的菌悬液。

(7)配制2％海藻酸钠和6％聚乙烯醇混合载体溶液灭菌冷却后，与菌悬液混合均匀，凝胶内包埋菌量大于4.7×10⁷cfu/ml，用注射器将其注入交联剂cacl2溶液中，形成小球，在交联剂中硬化4h。用无菌水洗涤。

(8)将步骤(7)中配制的包埋菌小球10个，置于100ml杨梅汁含量100％(质量比)糖度20°bx的培养液中，在30℃温度下培养，前12h每4小时通氧一次，12h后停止通氧，培养至出现大量气泡。

(9)破碎步骤(8)包埋菌小球，放置于杨梅汁含量100％(质量比)，调整糖度至20°bx的培养液100ml中，在30℃温度下培养，前28小时每4小时通氧一次。28小时后停止通氧，培养至出现大量气泡，检测酵母浓度大于2.5×10⁸个/ml。

(10)重复步骤(6)、(7)、(8)、(9)，直至制作的包埋菌小球能在24h内起酵，产生酒精，即为驯化完成。

本发明实施例提供的杨梅菌种驯化方法使杨梅新型发酵饮品专用酵母性能更加稳定，杨梅新型发酵饮品工艺技术更加完善、合理,产品质量更稳定，杨梅新型发酵饮品具有良好的色、香、味、形和营养，具体指标如下：

1技术指标

(1)杨梅榨汁条件其出汁率达75％。

(2)每批次落地杨梅榨汁后汁液糖度、酸度、理化指标、微生物指标均合格研究且基本保持一致。

(3)利用葡萄酒酵母训化出适合于杨梅酒生产的酵母菌株，使杨梅新型发酵饮品酵母菌具备如下性能：

a、生长繁长殖速度快，在杨梅新型发酵饮品发酵过程中可迅速成为优势菌群，缩短起酵时间；

b、有耐酸能力，可在ph值3.0以上环境下正常发酵；

c、有适当的高级醇和酯类生成能力，酒质的香味好；

d、酵母凝集性强，形成泡沫能力低。

(4)确定护色条件，使杨梅新型发酵饮品保持杨梅原有的色泽。

(5)确定固定化条件，使发酵饮品更澄清透明，易于后续的澄清工作。

(6)确定最佳发酵条件，生产出的杨梅新型发酵饮品酒口味新清，花色苷含量保持好，果香更浓郁，稳定产品质量并达到相应国家标准。

(7)确定最佳澄清条件，以保证杨梅发酵饮品的透明度。

2产品参数

(1)感官指标

呈红色、澄清透明,果香浓郁、与酒香协调,酒体丰满醇厚，纯净新鲜爽怡口感，味道纯正、完整，协调适口无异味。无正常视力可见杂质。

(2)理化指标

酒精度％(％(v/v),20℃),产品为3-6度的低度酒饮品；

总糖(以葡萄糖计,g/l)≤15；

总酸(以柠檬酸计,g/l)10～12；

总so2(mg/l)≤250；

(3)微生物指标

细菌总数(cfu/ml)≤50；

大肠杆菌(cfu/100ml)≤3；

致病菌不得检出。

本发明实施例提供的杨梅菌种驯化方法

(1)优化杨梅榨汁条件，提高其出汁率。

(2)杨梅果汁发酵前产品参数标准化，对落地杨梅榨汁后汁液糖度、酸度、理化指标、微生物指标研究，以达到每批次产品各项参数保持一致。

(3)发酵杨梅酵母菌菌种的驯化，采用杨梅果汁配制的培养基对葡萄酒酵母进行驯化，然后用三角瓶进行扩大培养，生长繁殖旺盛的菌种可直接供发酵使用，以适应杨梅果汁的强酸环境。

(4)杨梅汁的护色条件优化，筛选天然抗氧化剂，用以代替so2抗氧化剂，减少杨梅酒中花色苷的变色，增加产品品质和营养价值。

(5)固定化葡萄酒酵母条件的优化，筛选出合适浓度的固定化葡萄酒酵母材料，以保持最佳发酵活性。

(6)酵母菌发酵杨梅汁条件的优化，筛选出最佳的酵母添加量、发酵温度、发酵时间、加糖量，以达到最佳产品质量。

(7)澄清条件的筛选，筛选出合适的澄清剂，同时确定最佳的澄清剂浓度，以保证杨梅发酵新型饮品的透亮。

(8)产品调配，对最终产品的颜色、香味、糖度、酸度进行标准化调配。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。