一种检测巴西孢子丝菌的荧光PCR引物、探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于鉴别巴西孢子丝菌的荧光pcr引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行巴西孢子丝菌检测的方法和试剂盒。
背景技术：
：孢子丝菌病(sporotrichosis)是由双相真菌申克孢子丝菌复合体(sporothrixschenckiicomplex)侵犯皮肤及皮下组织引起的慢性感染性疾病。病程长，皮损可固定于局部，或延淋巴管走行，严重者可通过血行系统播散，引起内脏器官的感染，也有报道称吸入的孢子可直接引起肺部感染。早期人们对申克孢子丝菌认识有限，认为其为单一物种。随着基因组学以及分子检测手段的不断发展，发现申克孢子丝菌是由多个亲缘种构成的复合体，多数孢子丝菌为环境菌株，基本不致病，只有少数几种是临床致病菌。其中，巴西孢子丝菌(sporothrixbrasiliensis，sb)是重要的临床致病菌，也是一种重要的人兽共患病。其宿主除了人类之外，也可引起以猫等动物的感染，猫的口腔环境温度为37.7-39.1℃，ph值为7.5-8.0，十分有利于巴西孢子丝菌酵母细胞生长繁殖。通过搔抓和撕咬，巴西孢子丝菌不仅能够引起人类的感染，也可在动物之间传播，成为其主要的传播途径。作为重要的人畜共患病，由巴西孢子丝菌引起的孢子丝菌病，常具有较重的临床表现，并且能够引起内脏及邻近骨的感染，甚至侵犯中枢神经系统，导致宿主死亡。近些年，孢子丝菌病报道不断增多，尤其是临床表现严重的病例。有记载的巴西孢子丝菌感染病例就超过几千例，并且由于孢子丝菌病不是必须上报的病种，其真实感染情况要远高于记载数据。随着对孢子丝菌复合体研究的深入，发现不同种之间在致病力及药物敏感性方面存在明显差异，因此在孢子丝菌病的诊断及治疗过程中，对病原菌鉴定到种是十分必要的。目前，临床上常用的孢子丝菌诊断方法包括直接镜检、培养、组织病理检查等。除培养外，都不能对其鉴定到种水平。由于种内形态十分相似，常需要经验丰富的真菌学专家进行鉴定，并且孢子丝菌培养耗时较长，通常需2-4周，不适用于临床早期诊断。目前常用的分子鉴定手段主要包括对目的片段扩增及测序、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(pcr-rflp)以及特异性引物普通pcr检测等。由于局部皮损真菌含量少，直接镜检阳性率较低，早期孢子丝菌的诊断主要依赖于组织病理及真菌培养。病理组织切片特殊染色，如过碘酸雪夫染色，六胺银染色可检测到真菌孢子。组织真菌培养是检测的金标准，但耗时较长，至少需要1周时间，因此无法作为临床快速诊断的依据。随着分子生物学技术发展，核酸检测技术逐渐应用到孢子丝菌的分型和检测中，目前常用的孢子丝菌检测及分型的靶基因主要有内转录间隔区(internaltranscribedspacer,its)、钙调蛋白(calmodulin,cal)、延长因子(elongationfactors,ef)等，通过设计针对靶基因的特异性引物，扩增获得长度不同的目的片段，进一步运用琼脂糖凝胶电泳对其进行区分，从而对孢子丝菌进行种内鉴定。2015年，rodrigues(参考文献：messiasra,sybrendhg,piresdcz,etal.moleculardiagnosisofpathogenicsporothrixspecies.plosneglectedtropicaldiseases,2015,9(12):e0004190.)建立了普通单重pcr检测技术可检测并区分球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌，是目前最灵敏和特异的致病孢子丝菌核酸检测技术。该方法使用普通pcr技术，检测的灵敏度和特异性相对较低，对每种致病孢子丝菌均需单独扩增，并进行凝胶电泳对扩增产物进行鉴定和检测，总检测时间至少需要三个小时以上。因此，建立更加灵敏、特异、便捷的区分不同种致病性孢子丝菌的检测技术非常必要。实时荧光定量pcr方法在目标物检测灵敏度水平具有普通单重pcr不可逾越的优势，近年来在病原菌的鉴定中广泛应用。内转录间隔区(its，600-800bp)在进化过程中承受的自然选择压力非常小,因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性,即为种内相对一致,种间差异比较明显。由于its区具有高拷贝数的优点，在每个单倍染色体基因组中拷贝数超过200个，这能够极大的提高检测的灵敏度。然而，针对巴西孢子丝菌(sporothrixbrasiliensis)的实时荧光定量pcr至今尚未见报道。有研究推测，申克孢子丝菌作为孢子丝菌的祖先种，由于适应性进化，逐渐发展成属内其他的孢子丝菌，尤其是与临床致病相关的巴西孢子丝菌和球形孢子丝菌。由于相互之间序列差异很小，很难设计出适合的引物和探针。荧光定量pcr对于特异性引物和探针的设计具有较高的要求和需满足的原则，其要求目标核苷酸序列长度在100-150bp左右，在较小的片段中不仅要设计出适合的引物，也要设计出符合要求的特异性探针。将巴西孢子丝菌内转录间隔区序列目标序列输入软件中，无法找到符合荧光pcr要求特异性的引物及探针。只能根据经验，进行人工调整及较对。因此，对于sb实时荧光pcr鉴定巴西孢子丝菌来说，采用公知的引物设计软件并不能获得满足要求的引物和探针。技术实现要素：本发明的目的在于提供检测巴西孢子丝菌的荧光定量pcr方法以及用于该方法的特异性引物和探针。为实现上述目的，发明人首先对ncbi数据库中报道的孢子丝菌所有种属基因组进行比对，选取孢子丝菌种特异性its序列进一步进行分析，对ncbi数据库中具有代表性的孢子丝菌复合体的its序列使用vectorntisuite6软件序列比对，找出巴西孢子丝菌(以下简称sb)特异性碱基差异的序列(见图1)，将此段序列作为巴西孢子丝菌实时荧光pcr检测靶序列使用。该序列如seqidno.4所示。使用primerexpressversion软件设计巴西孢子丝菌(sb)特异性扩增引物和探针，并建立实时荧光pcr检测体系，适用于sb的快速核酸检测。本发明首先提供了一种用于检测巴西孢子丝菌(sporothrixbrasiliensis)的靶序列，其核苷酸序列如seqidno.4所示。本发明提供了上述靶序列在检测巴西孢子丝菌(sporothrixbrasiliensis)中的应用。本发明提供了用于检测所述靶序列的检测试剂在检测巴西孢子丝菌(sporothrixbrasiliensis)中的应用。本发明提供了一种用于检测巴西孢子丝菌(sporothrixbrasiliensis)的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.1-2所示。本发明还提供了与上述特异性引物对配合使用的探针，其核苷酸序列如seqidno.3所示。探针seqidno.3的5’分别标记荧光基团，3’标记淬灭基团。所示荧光基团选自但不限于fam、vic或cy5，所示淬灭基团选自但不限于bhq1、mgb。本发明提供一种寡核苷酸组合，含有所述的特异性引物对(seqidno.1-2)和所述的探针(seqidno.3)。本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒含有所述的特异性引物对(seqidno.1-2)和所述的探针(seqidno.3)。本发明提供的试剂盒是以待测样品总dna为模板，利用seqidno.1-2所示的特异性引物对和seqidno.3所示的探针进行实时荧光定量pcr，根据扩增曲线和荧光信号判定结果。具体地，实时荧光定量pcr的25μl反应体系为：所述实时荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性15s，58℃退火30s，45个循环。本发明提供了seqidno.1-2所示的特异性引物对和seqidno.3所示的探针在非疾病诊断目的的鉴别巴西孢子丝菌(sporothrixbrasiliensis)中的应用。本发明提供了上述试剂盒在非疾病诊断目的的鉴别巴西孢子丝菌(sporothrixbrasiliensis)中的应用。本发明每次检测标本时必须设立ntc对照(无模板对照)、neg(阴性对照)和pos对照(阳性对照)，三种对照对于结果判读起决定性作用：有效扩增：ntc(-)、neg(-)、pos(+)；无效扩增：ntc(-)、neg(-)、pos(-)提示试剂失效；无效扩增：ntc(-)、neg(+)、pos(+)提示加样污染；无效扩增：ntc(+)、neg(+)、pos(+)提示体系污染。只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。在检测中三种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：ct值小于等于38的标本为阳性结果；ct值大于40的标本为阴性结果；ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。本发明通过ncbi数据库已报道的具有代表性的孢子丝菌复合体的its序列比对，发现了sb中一段具有差异碱基的序列，针对该目标序列设计了多组特异性检测探针和引物，通过实验室条件优化和筛选，最终选定其中灵敏度高的引物和探针组合体体系。该体系可以对靶序列进行特异性的扩增，相比以往的分子检测手段，更加灵敏，操作简单，用时短。本发明是目前已知最灵敏的检测巴西孢子丝菌病原体的实时荧光pcr方法，对巴西孢子丝菌的检测限达到10fg。对巴西孢子丝菌、申克孢子丝菌、常见30种其他种属的真菌、3种细菌、人类基因组以及小鼠基因组均无非特异扩增，显示出良好的特异性。经浓度梯度质粒定量检测，本发明的检测灵敏度优于已报道其他分子检测体系，也优于相同荧光定量pcr方法下的其他引物探针组合对sb检测的灵敏度，具有良好的临床标本检测能力。附图说明图1为本发明巴西孢子丝菌its序列的特异性碱基差异序列，其中浅色框线区域为引物设计区，深色框线区域为探针设计区。图2为分别以球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌为模板，空白对照的扩增曲线。图3分别以球形孢子丝菌、巴西孢子丝菌、申克孢子丝菌为模板，引物探针组合1的扩增曲线。图4为分别以球形孢子丝菌、巴西孢子丝菌、申克孢子丝菌为模板，引物探针组合2的扩增曲线。图5为分别以球形孢子丝菌、巴西孢子丝菌、申克孢子丝菌为模板，引物探针组合3的扩增曲线。图6为引物探针组合2的实时荧光定量pcr扩增体系退火温度扩增曲线。图7为引物探针组合3的实时荧光定量pcr扩增体系退火温度扩增曲线。图8为引物探针组合2对sb实时荧光pcr体系检测限。图9为引物探针组合3对sb实时荧光pcr体系检测限。图10为引物探针组合2的荧光pcr体系对巴西孢子丝菌扩增的标准曲线图。图中1：1ng，2：100μg，3：10μg，4：1μg，5：100fg，6：10fg，7：1fg，8：ntc。图11a-图11b为引物探针组合3的荧光pcr体系对巴西孢子丝菌扩增的标准曲线图。图中1：1ng，2：100μg，3：10μg，4：1μg，5：100fg，6：10fg，7：1fg，8：ntc。图12为巴西孢子细菌干扰小鼠内脏组织培养结果。将内脏组织匀浆稀释100倍后，取100μl涂pda平板，从左至右依次为脑、肝、肺、脾、肾、淋巴结。图13为实时荧光pcr检测巴西孢子丝菌感染小鼠内脏组织匀浆ct值，ct值从小到大以此为脾30.55，肝30.82，淋巴结34.04，肾34.46，肺38.78，脑组织为阴性结果。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1巴西孢子丝菌内转录间隔区(its)基因序列比对与靶序列确定将ncbi数据库中具有代表性的孢子丝菌复合体的its序列使用vectorntisuite6软件序列比对，找出sb特异性碱基差异的序列(图1)，将此段序列作为巴西孢子丝菌实时荧光pcr检测靶序列使用。靶序列如seqidno.4所示的核苷酸序列。实施例2针对靶序列的引物和探针的设计针对实施例1确定的靶序列(seqidno.4)，发明人设计了多个引物与探针组合。表1引物及探针序列名称序列(5'to3')sb-f1gggccctgcgaacctcsb-f2cgaacctttgtatctcaaccactagaasb-rcaaccttgtataagaagagctgcgsb-paaccactagaaaaccgtctgagaaaaaacaaaacagsb-pmtctgagaaaaaacaaaacagtc组合1：f1-r-p组合2：f1-r-pm组合3：f2-r-pm反应体系及反应条件，遵循荧光pcr一般反应要求，探针标记fam荧光(sb-p：fam-aaccactagaaaaccgtctgaggaaaacaaaca-bhq1；sb-pm:fam-tctgaggaaaacaaac-mgb)，以下，对检测结果进行分析，扩增体系遵循实施例3的优化后的体系：1、ntc:阴性对照的三种荧光都是阴性，说明体系没有污染，且不会发生非特异性扩增，是合格的扩增体系。见图2。2、组合1与申克孢子丝菌出现非特异性扩增，弃用组合1，见图3。3、组合2及组合3均未发生孢子丝菌属内非特异性扩增，荧光信号值稳定，扩增效果良好，见图4及图5。因此将组合2与组合3同时优化反应体系。实施例3sb实时荧光pcr检测实验参数的优化与方法建立(1)体系退火温度优化：体系退火温度从57℃-65℃改变，结果显示组合2和组合3退火温度均58-60℃体系扩增效果最好(图6，图7)。(2)体系镁离子浓度优化：将体系中mgcl2从0.5μl依次递增为6μl，每次增幅0.5μl，每个浓度梯度做3个平行样。结果显示组合2及组合3，均在mgcl2添加量为2μl(mgcl2终浓度为4mm)时体系扩增效果最好。荧光定量pcr扩增体系及扩增条件的优化扩增条件：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性15s，58℃退火30s，45个循环。每次检测标本时必须设立ntc对照(无模板对照)、neg(阴性对照)和pos对照(阳性对照)，三种对照对于结果判读起决定性作用：有效扩增：ntc(-)、neg(-)、pos(+)；无效扩增：ntc(-)、neg(-)、pos(-)提示试剂失效；无效扩增：ntc(-)、neg(+)、pos(+)提示加样污染；无效扩增：ntc(+)、neg(+)、pos(+)提示体系污染。只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。在检测中三种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：ct值小于等于38的标本为阳性结果；ct值大于40的标本为阴性性结果；ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。实施例4sb实时荧光pcr检测体系的灵敏度、特异度及检出限评价1、灵敏度评价用本发明实施例3优化了的组合2及组合3sb实时荧光pcr方法，分别检测巴西孢子丝菌标准株(cbs120339t)和10例模拟组织感染样本。结果，除ntc对照外，11份阳性模板的检测结果均呈阳性，灵敏度均达100％。2、特异度评价用本发明实施例3优化了的组合2及组合3sb实时荧光pcr方法，分别检测常见30种其他真菌(包括球形孢子丝菌及申克孢子丝菌)、3种细菌、人类基因组以及小鼠基因组，均无非特异扩增(表2)，以sb为阳性对照。结果除阳性对照外，其余35种非sb模板均为阴性。表2用于检测sb实时荧光pcr体系特异性的病原模板bmu：北京大学第一医院真菌保藏库atcc：美国模式培养物集存库cbs:荷兰微生物菌种保藏中心3、检测限的评价检测下限即以已优化的检测方法从一系列倍比稀释的阳性核酸模板中检测，结果为阳性的能力。以梯度浓度2ng/μl到0.2fg/μl(共计7个梯度浓度)的sb基因组dna为模板，每个浓度梯度取5μl检测。按照优化的反应体系和反应条件进行荧光pcr，每个浓度梯度做3个平行样。结果显示，本发明建立的sb实时荧光pcr体系组合2检测限为100fg(图8)，组合3检测限均为10fg(图9)。实施例5sb实时荧光pcr体系标准曲线的制作以标准浓度模板的sb基因组dna(0.2ng/μl)依次进行10倍稀释共计7个浓度梯度，上样标准品各5μl扩增，模板量为1ng-1fg，绘制组合2及组合3sb实时荧光pcr体系的标准曲线(图10、图11a，图11b)。实施例6本发明sb实时荧光pcr组合3方法对小鼠感染模型检测能力的评估为评估本方法对组织中病原菌的检测能力，制备巴西孢子丝菌系统播散小鼠模型。将巴西孢子丝菌标准株(cbs120339t)转种至pda培养基活化培养，30℃，培养14天。生理盐水冲洗培养基表面，收集菌液，无菌纱布过滤，除去菌丝及培养基成份，3500rpm，离心收集孢子。弃上清，沉淀用少量无菌生理盐水重悬，孢子悬液在显微镜下用血球计数板计数，调整菌液孢子浓度至107cells/ml。使用一次性无菌注射器吸取0.2ml孢子悬液，腹腔注射感染balb/c小鼠。感染14天后脱颈处死，取脏器(脑、肝、肺、脾、肾、淋巴结)匀浆，分别取100μl匀浆液接种在含有氯霉素的pda培养基，100μl进行核酸提取，使用组合3进行实时荧光pcr检测。结果显示，感染小鼠脏器匀浆培养，除脑组织外，培养结果全部阳性。对生长的真菌进行形态学及分子鉴定，均为巴西孢子丝菌，证明感染模型建立成功，并且孢子由腹腔播散，引起多脏器感染(图12)。6种组织匀浆核酸荧光pcr检测结果，除脑组织阴性外，其余5种组织巴西孢子丝菌核酸检测结果均为阳性，ct值在30.55-38.78间(见图13)。综合上述实施例，组合2及组合3均能够特异性的检出巴西孢子丝菌，虽然对阳性核酸模板和模拟感染样本阳性检出率相同，但组合3得检测限(图9)明显优于组合2(图8)，并且组合3的检测效率(图11)也明显优于组合2(图10)，因此，选用组合3进行保护。即最终优选引物及探针序列：sb-f2:cgaacctttgtatctcaaccactagaasb-r:caaccttgtataagaagagctgcgsb-pm:tctgagaaaaaacaaaacagtc虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所吉林大学<120>一种检测巴西孢子丝菌的荧光pcr引物、探针及试剂盒<130>khp191110016.0<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgaacctttgtatctcaaccactagaa27<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2caaccttgtataagaagagctgcg24<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tctgagaaaaaacaaaacagtc22<210>4<211>531<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4actcccaacccttgcgaaccgtacccaatctcgttctcgttgcttctggcgggggggggg60agcgggggggcgcccgagagggccccctccgcccccgcccgccaggggcggcgggccctg120cgaacctcttgtatctcaaccactagaaaaccgtctgagaaaaaacaaaacagtcaaaac180tttcaacaacggatctcttggctctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgt240aatgtgaattgcagaattcagcgaaccatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccag300cattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcccccctcacgcgccccgttgcgcgc360tggtgttggggcgccctccgcctggcggggggcccccgaaagcgagtggcgggccctgtg420gatggctccgagcgcagtaccgaacgcatgttctcccctcgctccggacgcccccccagg480cgccctgccgtgaaaacgcgcatgacgcgcagctcttcttatacaaggttg531<210>5<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gggccctgcgaacctc16<210>6<211>36<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aaccactagaaaaccgtctgagaaaaaacaaaacag36当前第1页12