根瘤菌及其应用和菌剂以及修复稀土尾矿土壤或硅矿尾矿废料的方法与流程

本申请是申请日为2017年12月04日，申请号为201711261668.1的中国专利申请的分案申请。本公开涉及生物工程领域，具体地，涉及一种根瘤菌、包含该根瘤菌的菌剂、一种修复稀土尾矿土壤或硅矿尾矿废料的方法以及该根瘤菌的用途。
背景技术：
：稀土元素是指化学元素周期表中原子序数为57至71的镧(la)系元素以及与其性质相似的钪(sc)元素和钇(y)元素，共17种元素，被称为“工业维生素”，可广泛应用于工业、农业、电子等领域，主要以稀土氧化物或稀土离子的形态存在于稀土矿中，可通过池浸法、堆浸法、原位浸析法进行开采。矿石开采后被破坏的植被很难恢复，再加上浸矿后堆积如山的矿渣很难处理。相关资料表明，利用池浸工艺开采稀土，每获得1吨混合稀土，就要破坏地表植被200平方米，剥离的地表土达300立方米，形成尾砂2000立方米，每年造成水土流失为1200万方。稀土开采对矿山植被，土壤，地下水的破坏会严重影响当地的生态环境，开采过程中重金属、氟、氨氮和硫酸根及大量的尾矿、废石堆积，严重破坏了矿山的原有生态，导致水土流失。这些污染源的释放和迁移会对附近土壤，甚至下游江湖、地下水领域等生态环境产生严重的污染和引起生态环境恶化和威胁人体健康。作为极度严重退化的土壤，(废弃)稀土矿的生态修复受到了国内外的高度重视。这种土壤性状破坏，通常是沙化严重和极度贫瘠，保水保肥能力差，有机质和其他土壤必须元素缺乏，还有土壤微生物多样性受到严重破坏，植物在这样的恶劣土壤上生长极其困难。目前植被修复稀土矿山的成功案例较少，植物-微生物互作联合修复作为生态修复的主体，可广泛在受污染尾矿生态修复工程中得到运用。目前大部分通过铺垫较厚客土，并通过在客土上种植桉树和松树等，然而该修复方法无法改善土壤的土质，植物的成活率往往也不高。根瘤菌与豆科植物的共生固氮是自然界最强大的植物微生物互作体系，另外根瘤菌还可以起到促生菌的作用，可促进植物生长和改良土壤。豆科植物和根瘤菌固氮作为先锋植物能够在缺乏水分、养分的严苛土地上茁壮生存。利用根瘤菌-豆科植物互作共生体系的固氮作用来加速废弃稀土矿山土壤中氮素积累，进而促进其营养元素循环和积累，是实现废弃稀土矿山生态修复的首选策略。根瘤菌是指与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类革兰氏染色阴性需氧杆菌。根瘤菌的正常细胞以鞭毛运动，无芽孢，可利用多种碳水化合物，并产生相当量的胞外粘液。根瘤菌属和慢性根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的多态细胞，也就是形成类菌体。cn102936574a公开了一种根瘤菌w33，分类命名为rhizobiumsp.w33，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年9月18日，菌种保藏号为cctccno：m2012357。该根瘤菌在稀土尾砂废弃地上能够促进弯叶画眉草生长。具体地，菌株w33可以促进弯叶画眉草根长和株高显著增加，分别比对照提高19％和46％。植物干重增加不显著。菌株w33(cctccno：m2012357)的接种使得植物根系发达，固沙量显著增加98％，有利于稀土尾矿废弃地的水土保持。此外，菌株w33可以明显促进苜蓿在重金属污染土壤中的生长，与接灭菌菌剂的对照相比，接种以w33菌株为有效成分的生物修复菌剂使得苜蓿的株高显著增加1.7倍，根重和地上部干重分别增加2.7和2.4倍，然而，实际应用中发现，菌株w33(cctccno：m2012357)对植物促生长作用仍然非常有限而无法令人满意，并且在生长6个月以后无明显的促生长作用，因此在稀土尾矿土壤修复中难以达到高效且长效的实际应用效果。技术实现要素：本公开的目的是提供一种根瘤菌，该根瘤菌能够高效且长效地在稀土尾矿土壤中促进豆科植物生长，从而高效且长效地修复稀土尾矿土壤。为了实现上述目的，一方面，本公开提供了一种根瘤菌，该根瘤菌的分类命名为bradyrhizobiumsp.ktms0001或bradyrhizobiumsp.ktms0002，并且，该根瘤菌的保藏编号为cctccno.m2017580或cctccno.m2017581。另一方面，本公开还提供了一种根瘤菌菌剂，该根瘤菌菌剂包括培养基和如上所述的根瘤菌。另一方面，本公开还提供了一种修复稀土尾矿土壤或硅矿尾矿废料的方法，该方法包括：在稀土尾矿土壤上或硅矿尾矿废料上播种豆科植物，并且接种如上所述的根瘤菌。再一方面，本公开还提供了如上所述的根瘤菌在修复稀土尾矿土壤或硅矿尾矿废料中的用途。通过上述技术方案，本公开的根瘤菌能够大幅度地且长期地增加稀土尾矿土壤中生长的植物的鲜重和干重，例如能够将种植在稀土尾矿土壤中9个月的柱花草地下部分干重增加16.7倍，地上部分干重增加12.8倍，从而高效且长效地修复稀土尾矿土壤。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物材料保藏信息根瘤菌，分类命名为bradyrhizobiumsp.ktms0001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为2017年10月13日，菌种保藏号为cctccno：m2017580。根瘤菌，分类命名为bradyrhizobiumsp.ktms0002，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为2017年10月13日，菌种保藏号为cctccno：m2017581。附图说明附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：图1是保藏编号为cctccno.m2017581的根瘤菌(根瘤菌1)处理过的决明(左起第4-6盆)和灭菌的10mmmgso4水溶液处理的决明(左起第1-3盆)种植在稀土尾矿土壤中9个月后的生长情况对比图。具体实施方式以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。一方面，本公开提供了一种根瘤菌，该根瘤菌的分类命名为bradyrhizobiumsp.ktms0001或bradyrhizobiumsp.ktms0002，并且，该根瘤菌的保藏编号为cctccno.m2017580或cctccno.m2017581。保藏编号为cctccno.m2017580的根瘤菌是通过植物捕获法从广东的稀土尾矿样品中分离得到的15株根瘤菌中的其中一株。保藏编号为cctccno.m2017581的根瘤菌是通过植物捕获法从江西的稀土尾矿样品中分离得到的15株根瘤菌中的其中一株。另一方面，本公开还提供了一种根瘤菌菌剂，该根瘤菌菌剂包括培养基和如上所述的根瘤菌。其中，所述根瘤菌菌剂的剂型可以为种子浸泡液，也可以为干粉或泥状物。可选地，其中，所述根瘤菌菌剂中，根瘤菌数量为(2-20)×109cfu/每克菌剂。可选地，其中，所述培养基包括ymb培养基和/或mag培养基。可选地，其中，该根瘤菌菌剂还包括助剂，所述助剂包括表面活性剂和/或固态载体；所述表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠和烷基萘磺酸钠缩聚物中的至少一种；所述固态载体包括草炭、蛭石、糠粉、麦麸、高岭土、硅藻土、白炭黑、滑石粉和细沙中的至少一种。优选地，可以将保藏编号为cctccno.m2017580或cctccno.m2017581的根瘤菌在ymb培养基中培养至100×109cfu/ml的菌体浓度得到培养液，然后将培养液与助剂(十二烷基苯磺酸钠和高岭土)混合制备为菌剂，相对每升培养液，十二烷基苯磺酸钠的用量为50-200克，高岭土的用量为200-400克。另一方面，本公开还提供了一种修复稀土尾矿土壤或硅矿尾矿废料的方法，该方法包括：在稀土尾矿土壤上或硅矿尾矿废料上播种豆科植物，并且接种如上所述的根瘤菌。可选地，其中，相对于所述稀土尾矿土壤或所述硅矿尾矿废料的每平方米的裸露表面，所述根瘤菌的接种量为(1-10)×109cfu个。可选地，其中，所述豆科植物包括花生、决明、柱花草和苜蓿中的至少一种。再一方面，本公开还提供了如上所述的根瘤菌在修复稀土尾矿土壤或硅矿尾矿废料中的用途。可选地，在上述用途中，在稀土尾矿土壤上或硅矿尾矿废料土壤上播种豆科植物，并且接种如上所述的根瘤菌。以下，通过实施例进一步详细说明。以下实施例中，稀土尾矿污染土壤是取自广东清远的样品。实施例1本实施例使用保藏编号为cctccno.m2017580的根瘤菌对稀土尾矿土壤进行土壤修复盆栽实验。供试植物为豆科植物柱花草、花生、决明和苜蓿，每种植物分为10个接菌组和3个对照组，种子无菌化处理方法为乙醇消毒30分钟，无菌水冲洗5次。接菌组种子使用保藏编号为cctccno.m2017580的根瘤菌(根瘤菌1)以及与该菌一起分离的9株根瘤菌(根瘤菌2-10)菌液(100×109cfu/ml的菌体浓度)浸泡，对照组1是将根瘤菌菌液换成灭菌的10mmmgso4水溶液处理，其余相同；对照组2是将根瘤菌菌液替换为购自攀枝花市西宇生物科技有限公司的商业根瘤菌菌剂制成的根瘤菌菌液(100×109cfu/ml的菌体浓度)；对照组3是将根瘤菌菌液替换为购自宁都菌密码生物科技有限公司的商业em菌菌剂制成的菌液(100×109cfu/ml的菌体浓度)。撒进装载稀土尾矿污染土壤的花盆里，移至温室培养，浇灌同样的水量以保存湿润。9个月后分别测量每个花盆中地上和地下部分的干重，结果如表1所示。根据表1可见，保藏编号为cctccno.m2017580的根瘤菌(根瘤菌1)的处理与无菌水的处理相比，种植在稀土尾矿土壤中9个月的决明地下部分干重增加约11.6倍，地上部分干重增加13.2倍，图1代表性地展示了保藏编号为cctccno.m2017580的根瘤菌(根瘤菌1)处理过的决明(左起4-6)和灭菌的10mmmgso4水溶液处理的决明(左起1-3)种植在稀土尾矿土壤中9个月后的生长情况对比图。并且，相对于与该菌一起分离的9株根瘤菌(根瘤菌2-10)以及购自攀枝花市西宇生物科技有限公司的商业根瘤菌和购自宁都菌密码生物科技有限公司的商业em菌，保藏编号为cctccno.m2017580的根瘤菌(根瘤菌1)具有显著增强的促植物生长能力。表1实施例2本实施例使用保藏编号为cctccno.m2017581的根瘤菌对稀土尾矿土壤进行土壤修复盆栽实验。供试植物为豆科植物柱花草、花生、决明和苜蓿，每种植物分为10个接菌组和1个对照组，种子无菌化处理方法为乙醇消毒30分钟，无菌水冲洗5次。接菌组种子使用保藏编号为cctccno.m2017581的根瘤菌(根瘤菌11)以及与该菌一起分离的9株根瘤菌(根瘤菌12-20)菌液(100×109cfu/ml的菌体浓度)浸泡，对照组1是将根瘤菌菌液换成灭菌的10mmmgso4水溶液处理，其余相同；对照组2是将根瘤菌菌液替换为购自攀枝花市西宇生物科技有限公司的商业根瘤菌菌剂制成的根瘤菌菌液(100×109cfu/ml的菌体浓度)；对照组3是将根瘤菌菌液替换为购自宁都菌密码生物科技有限公司的商业em菌菌剂制成的菌液(100×109cfu/ml的菌体浓度)。撒进装载稀土尾矿土壤的花盆里，移至温室培养，浇灌同样的水量以保存湿润。9个月后分别测量每个花盆中地上和地下部分的干重，结果如表2所示。根据表2可见，保藏编号为cctccno.m2017581的根瘤菌(根瘤菌11)的处理与灭菌的10mmmgso4水溶液的处理相比，种植在稀土尾矿土壤中9个月的柱花草地下部分干重增加约14.8倍，地上部分干重增加12.9倍。并且，相对于与该菌一起分离的9株根瘤菌(根瘤菌12-20)以及购自攀枝花市西宇生物科技有限公司和购自宁都菌密码生物科技有限公司的商业em菌，保藏编号为cctccno.m2017581的根瘤菌(根瘤菌11)具有显著增强的促植物生长能力。表2实施例3本实施例用于说明使用保藏编号为cctccno.m2017580的根瘤菌(根瘤菌1)和保藏编号为cctccno.m2017581的根瘤菌(根瘤菌11)对稀土尾矿进行土壤修复和复绿。首先，将保藏编号为cctccno.m2017580的根瘤菌和保藏编号为cctccno.m2017581的根瘤菌分别在ymb培养基中培养至100×109cfu/ml的菌体浓度得到培养液，然后将培养液与助剂(十二烷基苯磺酸钠和高岭土)混合制备为菌剂，相对每升培养液，十二烷基苯磺酸钠的用量为100克，高岭土的用量为300克。按照整理场地、打穴、种植、接种、施肥的工序进行稀土尾矿进行土壤修复和复绿。其中，打穴是以40cm的间距挖10cm×10cm穴坑。种植是每个穴坑撒播3-20粒柱花草种子。接种是每个穴坑施用1g的菌剂。施肥是用土将穴填至土面，然后按每穴坑0.5公斤有机肥，撤施均匀，不成堆。实验组1是保藏编号为cctccno.m2017580的根瘤菌的培养液制备得到的菌剂，实验组2是保藏编号为cctccno.m2017581的根瘤菌的培养液制备得到的菌剂，对照组1是将培养液换成无菌水处理，其余相同；对照组2是将菌剂替换为购自西宇生物的商业根瘤菌菌剂；对照组3是将菌剂替换为购自菌密码生物有限公司的商业em菌菌剂。修复和复绿9个月后分别测量单位修复面积的稀土尾矿土壤上所有植被的鲜重。结果显示，实验组1每平方米稀土尾矿土壤上所有植被的鲜重为112.1kg，实验组2为109.3kg，而对照组1仅为65.3kg，对照组2仅为80.2kg，对照组3仅为70.5kg。由此说明，cctccno.2017580的根瘤菌和cctccno.2017581的根瘤菌能够高效且长效地修复稀土尾矿土壤。分别选取以上实验组1和2以及对照组1-3进行种植的柱花草的根际土壤，对土壤微生物进行16srdna文库构建及微生物多样性分析，方案如下：16srdna克隆文库的构建经过16srdna引物(包括引物27f和引物1483r，引物27f的序列为agagtttgatcctggctcag，如seqidno.1所示；引物1483r的序列为ggttaccttgttacgactt，如seqidno.2所示)对提取到的土壤微生物总dna进行扩增，回收16s条带，采用pmd19-tvector试剂盒将目的片段与载体连接，得到重组质粒dna。在感受态细胞(jm109大肠杆菌)悬液中加入重组质粒dna溶液，进行转化，然后进行amp抗性筛选，挑取筛选后的单菌落于lb液体培养基中振荡培养过夜。利用质粒提取试剂盒提取质粒。然后对所得克隆中阳性质粒进行测序，得到16srdna的序列。将获得的16srdna序列通过ncbiblast进行在线比对，找出各序列在genbank中最相似的序列。然后选择参照序列，与得到16srdna的序列一起用clustalx程序进行比对。用mega5.0软件，neighbor-joining法构建系统发育树，bootstrap检验系统树，重复数为1000。然后按照香农-威纳多样性指数(shannon-wienerdiversityindex)方法计算得到土壤微生物多样性指数。实验组1和2以及对照组1-3进行种植的柱花草的根际土壤的土壤微生物多样性指数如表3所示。根据表3的数据可见，实验组1和2的微生物多样性要显著高于对照组1-3。由此说明，cctccno.2017580的根瘤菌和cctccno.2017581的根瘤菌能够高效且长效地修复稀土尾矿土壤的微生物多样性。表3修复土壤土壤微生物多样性指数实验组16.12实验组26.08对照组12.27对照组24.21对照组33.82修复和复绿9个月后，对柱花草根际土壤的氮/磷以及重金属进行检测，并且对柱花草地上部分中的重金属进行检测，结果如表4和表5所示。表4表5根据表4和表5的数据可见，cctccno.2017580的根瘤菌和cctccno.2017581的根瘤菌能够有效地在根际土壤中富集氮和磷，但是重金属并不富集，并且柱花草地上部分的重金属也不富集，因此可以作为饲料使用，由此可见cctccno.2017580的根瘤菌和cctccno.2017581的根瘤菌还能够为土壤修复带来可观的经济效益。以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。当前第1页12