比率型端粒酶活性定量检测方法与流程

本发明涉及端粒酶活性检测技术领域，特别涉及一种比率型端粒酶活性定量检测方法。

背景技术：

端粒酶是一种具有内源性rna模板的核糖核蛋白复合体，它催化dna重复序列的延伸。在大多数人类癌症(如肺癌、肝癌、结直肠癌和胃癌)中，端粒酶的表达量往往被上调，导致癌细胞的无限增殖。端粒酶可以作为一种肿瘤标志物，用作癌症的早期筛查，因此发展快速、高灵敏的端粒酶活性检测新方法对癌症的早期诊断和治疗具有重要的价值。传统的端粒酶检测方法包括端粒重复序列扩增法、端粒重复序列延伸法、荧光素标记的端粒酶重复序列扩增法等，这些方法存在样本需要量大、检测时间长、操作复杂、假阳性、价格昂贵等缺点。随着技术的发展，dna电化学传感器由于其操作简单、检测灵敏、花费少、设备要求低等优点被越来越多地应用于肿瘤标志物的检测。所以，现在需要一种能将电化学方法应用于端粒酶活性检测的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种比率型端粒酶活性定量检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种比率型端粒酶活性定量检测方法，该方法为：首先，在发夹dna探针5’末端标记亚甲基蓝、在3’末端标记巯基，再通过金-巯键自组装在金电极表面；然后将5’端标记有二茂铁的ts引物与金电极表面的发夹dna探针杂交，将得到的修饰有发夹dna探针的金电极用于端粒酶检测；在端粒酶存在时，其催化ts引物延伸反应并产生重复序列(ttaggg)n，与发卡dna探针杂交，发卡结构被打开，亚甲基蓝信号远离电极表面，获得的电化学信号会发生明显的变化，ts引物上的二茂铁信号依然保持在电极表面，作为内参；通过比较亚甲基蓝氧化电流峰和二茂铁电流峰的比率，实现端粒酶活性的检测。

优选的是，该方法具体包括以下步骤：

1)提取端粒酶；

2)制备用于端粒酶活性检测的发夹dna探针；

3)对工作电极进行预处理，并将所述步骤2)制得的发夹dna探针修饰在所述工作电极上；

4)使用所述步骤3)制得的工作电极对提取的端粒酶进行活性检测；

5)进行电化学分析，得到端粒酶活性检测结果。

优选的是，所述步骤1)具体包括：提取hela细胞并使用含有10％胎牛血清的dmem培养基，在含有5％co2的培养箱中，37℃下培养；使用血球计数板计算细胞的数量，在指数生长阶段收集细胞，将10⁶个细胞收集在1.5ml微量离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，并重悬于200μl冰冷的chaps裂解缓冲液中；将混合物在冰上孵育30分钟，并用移液枪吹打数次以彻底裂解细胞；然后将其在12000rpm、4℃下离心30分钟，以沉淀不溶物质；收集上清液并分装入新的无rna酶的试管中，提取得到端粒酶。

优选的是，所述步骤1)中，chaps裂解缓冲液ph为7.5，其包括：10mmtris-hcl、1mmmgcl2、1mmegta、0.1mmpmsf、质量分数0.5％的chaps和体积分数10％的甘油。

优选的是，所述步骤2)中通过在发夹dna探针5’末端标记亚甲基蓝、在3’末端标记巯基，该探针序列为：5’-(mb)-cgcccctaaccctaaccctaaccctaaaactctgctgggttaggggcgttt-(hs-sh)-3’，然后将发夹dna探针3’端二硫键打开，通过二硫苏糖醇还原得到巯基。

优选的是，所述步骤2)具体包括：在100μl超纯水中溶解5’末端标记有亚甲基蓝、3’末端标记有巯基的发夹dna探针，将3.5mg的二硫苏糖醇溶解在300μl的ph值为7.45的0.1mtris-hcl缓冲液中；然后将上述两种溶液在室温下充分混合1小时；在将混合溶液与50μl3m醋酸钠和1.5ml的100％乙醇混合；然后，在14000rpm下离心30min，丢弃上层清液，沉淀物用10mmtris-hcl缓冲溶液重悬，使其最终浓度为2μm，得到用于端粒酶活性检测的发夹dna探针。

优选的是，所述步骤2)中，重悬过程中的tris-hcl缓冲溶液的ph值为7.4，其包括1mmedta、10mmtcep和0.1mnacl。

优选的是，所述步骤3)具体包括：

3-1)工作电极预处理：首先分别用p3000、p5000碳化硅纸和多种粒度的氧化铝粉末对工作电极进行机械抛光；再用乙醇和超纯水超声处理以除去残留的氧化铝；然后将电极完全浸入水虎鱼溶液10分钟，接着用纯水冲洗；最后通过在新鲜的0.5mh2so4溶液中的循环电势来进行电化学清洁，直到获得稳定的循环伏安图；

3-2)工作电极修饰：工作电极用超纯水洗净，滴加30μl的由所述步骤2)得到的2μm发卡dna反应16小时进行修饰。

优选的是，所述步骤4)具体包括：将所述步骤3)得到的经修饰的工作电极与含有200μl3μm的ts引物溶液在37℃反应2小时，所述ts引物序列为：5’-fc-tttttaatccgtcgagcagagtt-3’，再次修饰后的工作电极与由所述步骤1)提取出的端粒酶在37℃共同孵育1小时，使用电化学检测方法并分析端粒酶活性。

优选的是，所述步骤4)中使用传统的三电极系统，其包含作为工作电极的金电极、铂丝对电极和饱和甘汞参比电极；其中，在具有1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-缓冲液中，进行电化学阻抗谱和循环伏安法分析，在20mmtris-hcl中进行方波伏安法实验，其中tris-hclph为7.4，其包括140mmnacl、5mmmgcl2。

本发明的有益效果是：本发明是同时利用两个电化学探针进行端粒酶活性检测，构建出一种新型的比率型电化学生物传感器，显著提高了检测灵敏度，并克服了现有技术重复性差、稳定性差等存在的问题；本发明通过端粒酶催化产生的重复序列与探针序列互补，增强了检测特异性；同时本发明采用双信号比值作为检测基础，基本消除了背景干扰，本发明的方法简便易行，具有灵敏度高、快速准确、成本低的特点，具有很好的推广应用价值。

附图说明

图1为本发明的比率型端粒酶活性定量检测方法的检测原理示意图；

图2为本发明的实施例中的不同修饰电极的阻抗图谱；

图3为本发明的实施例中的不同修饰电极的循环伏安图；

图4为本发明的实施例中端粒酶反应前后得到的方波伏安图；

图5为本发明的实施例中的用于检测端粒酶的方波伏安图；

图6为本发明的实施例中的imb/ifc对端粒酶浓度的线性关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明以发夹dna探针和端粒酶底物(ts)引物为基础，设计了比率型电化学传感器。

本实施例的一种比率型端粒酶活性定量检测方法，该方法为：首先，在发夹dna探针5’末端标记亚甲基蓝(mb)、在3’末端标记巯基，再通过金-巯键自组装在金电极表面；然后将5’端标记有二茂铁(fc)的端粒酶底物(ts)引物与金电极表面的发夹dna探针杂交，将得到的修饰有发夹dna探针的金电极用于端粒酶检测；从hela细胞中提取端粒酶，在端粒酶存在时，其催化ts引物延伸反应并产生重复序列(ttaggg)n，与发卡dna探针杂交，发卡结构被打开，亚甲基蓝信号远离电极表面，获得的电化学信号会发生明显的变化，ts引物上的二茂铁信号依然保持在电极表面，作为内参，避免了单信号输出策略的限制。通过比较mb氧化电流峰(imb)和fc电流峰(ifc)的比率，可以灵敏地检测端粒酶的活性。通过数据分析，其比值与端粒酶活性在0.2到200个细胞/μl范围内存在线性关系，检测限为0.02个细胞/μl。本发明通过端粒酶催化产生的重复序列与探针序列互补，增强了检测特异性；同时本方法采用双信号比值作为检测基础，基本消除了背景干扰。

参照图1，为本发明的比率型端粒酶活性定量检测方法的检测原理示意图，其中的标示，hairpindna：发夹dna，tsprimer：ts引物，telomerase：端粒酶，fc：二茂铁，mb：亚甲基蓝，mch:疏基乙醇，helacell：海拉细胞。

图2为不同修饰电极的阻抗图谱；图3为不同修饰电极的循环伏安图。图2和3中(a)：裸金电极，(b)：发夹dna修饰电极，(c)：ts引物杂交后的电极，(d)：端粒酶延伸反应后的电极。

图2和3中的电极表征图用于验证端粒酶检测体系的可行性。图2为不同修饰的金电极的电化学阻抗谱结果。裸金电极呈现出非常小的半圆区域(曲线a)，表明电荷的快速转移过程。而修饰有发夹dna的金电极表面会排斥[fe(cn)6]^3-/4-阴离子，从而导致电极表面阻抗的增加(曲线b)。孵育ts引物后的电极会进一步产生一个明显增强的阻抗值(曲线c)。当端粒酶存在时，修饰有探针的电极和引物会发生反应，产生了大量重复序列，对应的电荷转移电阻值发生明显的增加(曲线d)。为了进一步验证电极逐步改性过程，运用循环伏安法(cv)来进一步电化学表征。如图3所示，裸金电极的cv图中可以观察到一对明显的峰(曲线a)。发夹dna修饰电极后，峰值电流减小(曲线b)。用ts引物修饰后，峰值电流相应减少(曲线c)。端粒酶的进一步处理导致产生更多带负电的序列，因此，峰值电流持续降低(曲线d)。这些结果与阻抗结果完全一致。

图4为在端粒酶反应前后得到的方波伏安图，其中1为发夹dna修饰电极；2为与ts引物杂交后的曲线；3为与端粒酶进一步孵育后的曲线。

为了进一步验证所提出的比率法检测端粒酶的可行性，本发明进行方波伏安法(swv)测量。如图4所示，在不存在ts引物和端粒酶的情况下，发夹dna修饰电极的swv显示出mb的信号，而没有fc的信号。在fc标记的ts引物的存在下，可以分别在0.256和-0.267v观察到mb和fc的两个峰，表明发卡dna和ts引物成功的杂交，证明mb和fc信号保持在电极表面附近。然而，在引入端粒酶后，通过延伸反应产生重复序列，发卡结构被打开。实验中，fc的峰值电流几乎没有变化，而mb的峰值电流急剧下降，这证实了端粒酶诱导的构象变化。通过比较电化学信号，可以实现端粒酶活性的灵敏测定。

图5和6为端粒酶的电化学检测结果图：图5为用于检测端粒酶的方波伏安图。浓度为0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200个细胞/μl(从上到下，1-10)。图6为imb/ifc对端粒酶浓度的线性关系。内嵌图显示线性范围。

本发明通过监测mb和fc(imb和ifc)的swv峰值电流来研究设计的传感系统的分析性能。如图5所示，可以清楚地观察到imb随着端粒酶浓度的增加在0.2～200个细胞/μl的范围内降低。图6显示了使用imb和ifc比率值的端粒酶测定的校准曲线。结果显示信号比率值与细胞对数呈线性关系，回归方程为y＝0.8079-0.1329x(r²＝0.992)。检测限度计算为0.02个细胞/μl(s/n＝3)。

以下提供本发明的比率型端粒酶活性定量检测方法的一种具体实施例，其具体包括以下步骤：

1)提取端粒酶：

提取hela细胞并使用含有10％胎牛血清的dmem培养基，在含有5％co2的培养箱中，37℃下培养；使用血球计数板计算细胞的数量，在指数生长阶段收集细胞，将10⁶个细胞收集在1.5ml微量离心管中，用磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)洗涤两次，并重悬于200μl冰冷的chaps裂解缓冲液(10mmtris-hcl，ph7.5，1mmmgcl2，1mmegta，0.1mmpmsf，0.5％(w/v)chaps和10％(v/v)甘油)中；将混合物在冰上孵育30分钟，并用移液枪吹打数次以彻底裂解细胞；然后将其在12000rpm、4℃下离心30分钟，以沉淀不溶物质；收集上清液并分装入新的无rna酶的试管中，提取得到端粒酶。

2)制备用于端粒酶活性检测的发夹dna探针：

其中，dna探针二硫键的还原是通过在发夹dna探针5’末端标记亚甲基蓝、在3’末端标记巯基，然后将发夹dna探针3’端二硫键打开，通过二硫苏糖醇还原得到巯基。

具体包括：在100μl超纯水中溶解5’末端标记有亚甲基蓝、3’末端标记有巯基的发夹dna探针，将3.5mg的二硫苏糖醇溶解在300μl的ph值为7.45的0.1mtris-hcl缓冲液中；然后将上述两种溶液在室温下充分混合1小时；在将混合溶液与50μl3m醋酸钠和1.5ml的100％乙醇混合；然后，在14000rpm下离心30min，丢弃上层清液，沉淀物用10mmtris-hcl缓冲溶液(1mmedta,10mmtcep和0.1m氯化钠，ph值7.4)重悬，使其最终浓度为2μm，得到用于端粒酶活性检测的发夹dna探针。该发夹dna探针序列为：

5’-(mb)-cgcccctaaccctaaccctaaccctaaaactctgctgggttaggggcgttt-(hs-sh)-3’。

3)工作电极预处理与修饰：

工作电极预处理：首先分别用p3000、p5000碳化硅纸和多种粒度(1，0.3和0.05μm)的氧化铝粉末对工作电极进行机械抛光；再用乙醇和超纯水超声处理以除去残留的氧化铝；然后将电极完全浸入水虎鱼溶液(h2so4：h2o2＝3：1，注意：高度腐蚀性)10分钟，接着用纯水冲洗；最后通过在新鲜的0.5mh2so4溶液中的循环电势来进行电化学清洁，直到获得稳定的循环伏安图；

工作电极修饰：工作电极用超纯水洗净，滴加30μl的由所述步骤2)得到的2μm发卡dna反应16小时进行修饰。

4)端粒酶活性检测：

将所述步骤3)得到的经修饰的工作电极与含有200μl3μm的ts引物溶液在37℃反应2小时，所述ts引物序列为：5’-fc-tttttaatccgtcgagcagagtt-3’，再次修饰后的工作电极与由所述步骤1)提取出的端粒酶在37℃共同孵育1小时，使用电化学检测方法并分析端粒酶活性。

5)进行电化学分析，得到端粒酶活性检测结果：

所有电化学实验均由计算机控制的电化学工作站(chi660d，chinstruments)进行。其中，使用传统的三电极系统，其包含作为工作电极的金电极(2mm直径)、辅助铂电极和饱和甘汞参比电极；其中，在具有1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-缓冲液中，行电化学阻抗谱(eis)和循环伏安法(cv)分析，在20mmtris-hcl(140mmnacl，5mmmgcl2，ph7.4)中进行方波伏安法实验。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

发明名称：比率型端粒酶活性定量检测方法

发夹dna探针：5’-(mb)-cgcccctaaccctaaccctaaccctaaaactctgctgggttaggggcgttt-(hs-sh)-3’

ts引物：5’-fc-tttttaatccgtcgagcagagtt-3’