一种用于评估II型糖尿病风险的微生物标志物及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，涉及一种微生物标志物及其应用，尤其涉及一种用于评估ii型糖尿病风险的微生物标志物及其应用。

背景技术：

ii型糖尿病是以胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足为病理生理基础的内分泌代谢性疾病，其发病机制复杂，可能与基因、年龄、超重或肥胖、不健康的生活方式等相关。ii型糖尿病在全球的发病率逐年增高，已经成为一个严重的公共卫生问题。《中国ii型糖尿病防治指南》(2017年版)中指出，中国成人ii型糖尿病患病率为10.9％，并且发病呈年轻化趋势：40岁以下患病率高达5.9％。糖尿病及其并发症，包括心脏疾病、肾脏衰竭、中风症等严重危害人类生命健康。虽然对ii型糖尿病及其并发症发病机制的研究已经取得很多的成果，但是其影响因素众多，发病的具体机制仍不明了。

在过去的几年内，复杂的肠道微生物生态系统已经被广泛的研究。我们认为，饮食结构会影响肠道菌群，反之，肠道菌群结构的改变也会影响人体代谢，而人体肠道菌群的改变已经被认为是ii型糖尿病的潜在发病原因之一。cn105378739a公开了一种利用宏基因组簇(mgcs)来鉴定患有或有风险发生ii型糖尿病的个体的模型，其中所述模型的特征在于对不同的人群组使用不同的宏基因组簇。但宏基因组测序过程繁杂且时间成本高，测序针对的菌属众多，标志物的特异性不高。

因此，提供一种特异性好、灵敏度高、能指示个体是否有风险发生ii型糖尿病、指导肠道菌群调节的微生物标志物具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种用于评估ii型糖尿病风险的微生物标志物及其应用，本发明的微生物标志物预测ii型糖尿病风险的灵敏性好，只需要获取微生物标志物的相对含量，通过模型计算给出风险预警，可作为协助诊断，指导肠道微生物环境的调整，降低患糖尿病的风险。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于评估ii型糖尿病风险的微生物标志物，所述微生物标志物包括双歧杆菌属(bifidobacterium)、普雷沃菌属(prevotella)、梭菌属(clostridium)、罗氏菌属(roseburia)、肠球菌属(enterococcus)或韦荣球菌属(veillonella)中任意两种以上的组合，例如可以是双歧杆菌属(bifidobacterium)和普雷沃菌属(prevotella)的组合，梭菌属(clostridium)和罗氏菌属(roseburia)的组合，肠球菌属(enterococcus)和韦荣球菌属(veillonella)的组合，普雷沃菌属(prevotella)和梭菌属(clostridium)的组合，双歧杆菌属(bifidobacterium)、普雷沃菌属(prevotella)和梭菌属(clostridium)的组合，罗氏菌属(roseburia)、肠球菌属(enterococcus)和韦荣球菌属(veillonella)的组合，普雷沃菌属(prevotella)、梭菌属(clostridium)、罗氏菌属(roseburia)和肠球菌属(enterococcus)的组合，或双歧杆菌属(bifidobacterium)、普雷沃菌属(prevotella)、梭菌属(clostridium)、罗氏菌属(roseburia)、肠球菌属(enterococcus)和韦荣球菌属(veillonella)的组合。

本发明的微生物标志物组合可以作为辅助手段鉴定ii型糖尿病，可以有效预测ii型糖尿病患病风险，特异性好，灵敏度高，通过微生物标志物相对含量判断个体内微生态状态，预警ii型糖尿病的潜在风险，进行早期干预，抑制ii型糖尿病的发生或发展。选择菌属作为检测标志物，可以更加全面评价肠道菌群平衡性，菌属中并非所有菌种都是有益或者有害，将菌属作为标志物的预测准确度更高，同时细菌属水平丰度大于>1％，可以较好的分析肠道菌群与疾病相关性。

本发明通过检测46例健康志愿者与20例糖尿病患者的粪便样本中与ii型糖尿病相关的肠道21种细菌相对含量，通过spss19.0软件进行数据组间分析，采用wilcox秩和检验分析两组人群肠道细菌相对含量差异是否显著，以p<0.05判定差异具有统计学意义。经统计检验分析筛选出8种在健康人与ii型糖尿病病人二者之间有显著差异的细菌。综合评估使用此8种细菌作为预测指标，联合使用8种或8种细菌间任一组合，通过logistic回归及roc曲线分析发现，采用6种、7种或是8种细菌菌属分别构建模型的auc差异不显著。auc值即为roc曲线下所覆盖的区域面积，auc值越大，分类器的分类效果越好。auc＝1是理想情况下的完美分类器，不管设定任何阈值都能得到准确预测，但实际上，auc的值介于0.5到1之间时，即具有预测价值，设定合适的阈值，可用于预测。研究表明，全部8种菌属roc曲线菌略高于6种菌属，7种菌属的roc曲线菌略低于6种菌属。此外，以6种菌属作为检测指标的情况中，以双歧杆菌属(bifidobacterium)、普雷沃菌属(prevotella)、梭菌属(clostridium)、罗氏菌属(roseburia)、肠球菌属(enterococcus)和韦荣球菌属(veillonella)的特定六种菌属作为检测指标的auc值最高，综合考虑检测的经济成本和时间成本，本发明使用上述6种细菌菌属作为检测指标用来构建预测ii型糖尿病风险的模型。

优选地，所述梭菌属包括普拉梭菌(faecalibateriumprausnitzii)。

本发明中，发明人经过不断验证，发现针对梭菌属而言，可选择普拉梭菌为代表菌种进行预测ii型糖尿病风险的模型构建，其含量在病例组合健康对照组之间具有显著的统计学差异。

优选地，所述微生物标志物包括双歧杆菌属(bifidobacterium)、普雷沃菌属(prevotella)、普拉梭菌(faecalibateriumprausnitzii)、罗氏菌属(roseburia)、肠球菌属(enterococcus)或韦荣球菌属(veillonella)中至少4种的组合，例如可以是双歧杆菌属(bifidobacterium)、普雷沃菌属(prevotella)、普拉梭菌(faecalibateriumprausnitzii)和罗氏菌属(roseburia)的组合，普雷沃菌属(prevotella)、普拉梭菌(faecalibateriumprausnitzii)、罗氏菌属(roseburia)、肠球菌属(enterococcus)的组合，普拉梭菌(faecalibateriumprausnitzii)、罗氏菌属(roseburia)、肠球菌属(enterococcus)和韦荣球菌属(veillonella)的组合，普雷沃菌属(prevotella)、普拉梭菌(faecalibateriumprausnitzii)、肠球菌属(enterococcus)和韦荣球菌属(veillonella)的组合，优选为6种的组合。

本发明中，优选双歧杆菌属(bifidobacterium)、普雷沃菌属(prevotella)、普拉梭菌(faecalibateriumprausnitzii)、罗氏菌属(roseburia)、肠球菌属(enterococcus)和韦荣球菌属(veillonella)的六种细菌组合作为ii型糖尿病风险评估的微生物标志物，特异性好，灵敏度高，可以用于后续辅助临床诊断，同时可以预警不同个体罹患ii型糖尿病的风险，进行早期干预，调整肠道菌群，降低发病概率。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的微生物标志物的用途，所述用途包括用于构建预测ii型糖尿病风险的模型，制备ii型糖尿病的肿瘤诊断或治疗药物，或制备ii型糖尿病诊断试剂盒中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供一种预测ii型糖尿病风险的模型，所述模型的输入变量为第一方面所述的微生物标志物的相对含量。

本发明中，以第一方面所述微生物标志物的相对含量作为输入变量，通过模型的运算，输出患病风险值，风险值介于0到1之间。通常情况下，本领域技术人员通过提高输入变量的数量提高模型的检测灵敏度，意味着要采集大量的不同菌种/属的相对含量，通常选择高通量测序的方式进行检测，增加整体检测的时间和经济成本，而本发明通过选择特定种属数量的微生物作为标志物，既可以保证检测灵敏度，同时可以兼容多种检测手段如实时荧光定量核酸扩增检测(real-timequantitativepcrdetectingsystem，qpcr)，操作简便，多数科研院所或医院均可进行操作，辅助临床诊断及预后。

优选地，所述微生物标志物相对含量的测定方法包括宏基因组测序、16srdna测序或qpcr检测中的任意一种或至少两种的组合，优选为qpcr检测。

本发明可以配合多种检测微生物相对含量的实验手段进行后续分析，优选地，以qpcr检测的肠道细菌总量，不同细菌相对表达量结果通过2^-△ct计算，最后计算出不同菌属的相对表达量。

第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)分别检测健康个体和ii型糖尿病患者粪便中的如第一方面所述微生物标志物的相对含量；

(2)将步骤(1)得到的数据输入机器学习模型，训练模型，存储训练后的模型得到用于预测ii型糖尿病风险的模型。

优选地，步骤(1)所述微生物标志物的相对含量的检测方法包括宏基因组测序、16srdna测序或qpcr检测中的任一种或至少两种的组合；

优选地，步骤(2)所述机器学习模型包括logistic回归模型。

本发明中，优选logistic回归模型，训练模型的方法为本领域常用的技术手段，无需特殊限定，通过训练模型得到预测效果最佳的模型，存储后可直接用于未知样本的预测分析。

第五方面，本发明提供一种鉴定患有或有风险发生ii型糖尿病的个体的系统，所述系统包括如第一方面所述微生物标志物的相对含量检测系统和模型分析系统。

优选地，所述微生物标志物的相对含量检测系统包括宏基因组测序、16srdna测序或qpcr检测中的任一种或至少两种的组合。

优选地，所述模型分析系统包括logistic回归模型。

logistic回归又称logistic回归分析，是一种广义的线性回归分析模型，本发明利用logistic回归分析进行数据挖掘，疾病自动诊断，探讨引发ii型糖尿病的危险因素，并根据危险因素预测疾病发生的概率。通过logistic回归分析，可以得到自变量的权重，从而可以大致了解到底哪些因素是疾病的危险因素。同时根据该权值可以根据危险因素预测一个人患病的可能性。对于本发明来说，最终采用的模型的auc＝0.819，是最优模型，故本发明选用logistic回归模型。

第六方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括检测如第一方面所述微生物标志物相对含量的试剂，如第三方面所述的模型，或如第五方面所述的系统。

第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括调节如第一方面所述微生物标志物的相对含量而实现降低ii型糖尿病患病风险的药物。

所述药物组合物可以调节微生物标志物，以平衡各个菌属之间的相对含量，降低ii型糖尿病的患病风险。

第八方面，本发明提供一种用于评估ii型糖尿病风险的肠道菌群评分装置，包括以下单元：

检测单元：检测样本中如第一方面所述的微生物标志物的相对含量；

分析单元：将检测得到的微生物标志物相对含量作为输入变量，输入如第二方面的步骤(2)所述预测ii型糖尿病风险的模型进行分析；

评估单元：输出样本对应的个体患ii型糖尿病的风险值p值；

所述p值大于0.1835，判读为ii型糖尿病阳性，p值小于0.1835判读为阴性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供一种用于评估ii型糖尿病风险的微生物标志物，检测特异性好，灵敏度高，可用于指导肠道菌群调节，降低患ii型糖尿病的风险；

(2)本发明的通过大量筛选得到包含6个特定细菌的微生物标志物，通过模型分析，协助ii型糖尿病早期筛查，指导肠道菌微环境的调整；

(3)本发明提供一种基于qpcr反应的肠道菌检测系统的试剂盒，通过特异性检测肠道微生物标志物的相对含量配合logistic回归模型分析系统，评估ii型糖尿病发生的风险，为ii型糖尿病的筛查和诊断提供新的检测手段，尽早进行临床干预，防止病情进展，改善患者预后。

附图说明

图1为实施例2-4的roc曲线分析结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实验材料

主要仪器：

涡旋振荡器、离心机、低温超速离心机、电热恒温金属加热器、天隆科技

np968核酸自动抽提仪。

主要试剂：

ex-dna细菌基因组核酸提取或纯化试剂(西安天隆科技有限公司)

2×multiplexpcrmix(含染料)(康为世纪)

sybrgreen(天根生化科技(北京)有限公司)

rnafreeh2o(西安天隆科技有限公司)。

以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术人员应当掌握使用常规材料及仪器的相关知识。

实施例1微生物标志物相对含量测定

1、肠道微生物标志物dna提取

提取方法：

(1)细菌富集步骤：

称取0.2克粪便样本，加入1mlpbs(或生理盐水)中，剧烈震荡均匀后500rpm离心5分钟，收集上清液；重复此步骤两次；将收集的全部上清液5000rpm离心10分钟，弃上清。

(2)提取前处理步骤(注意：若菌体消化液中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，并摇匀后使用)：

革兰氏阳性菌及未知细菌提取前处理步骤：向上述不同样本类型的处理产物中加入180μl溶菌酶溶液和20μl蛋白酶k溶液，充分涡旋混匀后50℃水浴30分钟以上(水浴时间与不同细菌菌种有关)，水浴结束后瞬时离心，想离心管中加入200μl菌体消化液，充分混匀后待用。

(3)预封装试剂准备

从试剂盒中取出真空包装的预封装试剂，颠倒混匀数次使磁珠重悬，去掉真空包装，轻甩孔板或试剂条，使试剂及磁珠均集中到孔板或试剂条底部，使用前小心撕去铝箔封口膜，避免振动，防止液体溅出。将上一步骤中的全部混合液加至预封装试剂的第1及第7列中进行自动化仪器提取(注意有效工作孔位)。

(4)自动化仪器提取步骤按表1程序运行

表1

(5)自动化程序结束后，将洗脱孔中的洗脱液转移至无核酸酶的离心管中-20℃保存待用。

2、qpcr定量检测

(1)特异扩增引物序列和长度见表2，由上海生工生物有限公司合成。

表2

(2)特异性扩增(pcr)：qpcr采用abi7500实时荧光定量扩增系统，扩增体系如下表3所示。将pcr反应管放入pcr仪中，abi7500仪器按照下述条件进行设置：

“setup”中“experimentproperties”依次选择7500(96wells)、quantitation-standardcurve、greenreagents和standard(～2hourstocompletearun)；“platesetup”中“targetname”中加入上述六种菌种和内参16s的名称，reporter全部选择“sybr”，quencher全部选择“none”；“assigntargetsandsamples”中左下角“selectthedyetouseasthepassivereference”下拉框中选择none。其中pcr扩增条件以及荧光通道选择如下表3、表4所示：

表3pcr扩增体系

表4pcr扩增程序

待检样本所含的6种ii型糖尿病相关细菌相对含量均根据其ct值与内参16srdna的ct值利用2^-δct法计算得出。

实施例2模型分析

选择双歧杆菌属(bifidobacterium)、普雷沃菌属(prevotella)、普拉梭菌(faecalibateriumprausnitzii)、罗氏菌属(roseburia)、肠球菌属(enterococcus)和韦荣球菌属(veillonella)作为检测标志物组合，将检测到的上述六种细菌的相对含量作为输入变量，利用logistic回归模型分析，对ii型糖尿病的发病风险进行预测，训练最佳回归模型。

实施例3

与实施例2相比，除了输入变量为普雷沃菌属(prevotella)、普拉梭菌(faecalibateriumprausnitzii)、罗氏菌属(roseburia)和肠球菌属(enterococcus)的相对含量外，其他条件同实施例2。

实施例4

与实施例2相比，除了输入变量为普雷沃菌属(prevotella)和普拉梭菌(faecalibateriumprausnitzii)的相对含量外，其他条件同实施例2。

roc曲线分析

对实施例2-4所得预测结果进行roc分析，结果如图1所示，roc曲线分析结果见表5。

表5roc曲线分析

a非参数假设；b零假设truearea＝0.5

如本文所用，术语“roc曲线”为受试者工作特征曲线，是以假阳性概率(1-特异性)为横轴，真阳性概率(敏感度)为纵轴所组成的坐标图，和受试者在特定刺激条件下由于采用不同的判断标准得出的不同结果画出的曲线。选择最佳的诊断界限值。roc曲线越靠近左上角，试验的准确性就越高。最靠近左上角的roc曲线的点是错误最少的最好阈值，其假阳性和假阴性的总数最少。两种或两种以上不同诊断试验对疾病识别能力的比较。在对同一种疾病的两种或两种以上诊断方法进行比较时，可将各试验的roc曲线绘制到同一坐标中，以直观地鉴别优劣，靠近左上角的roc曲线所代表的受试者工作最准确。亦可通过分别计算各个试验的roc曲线下的面积(auc)进行比较，哪一种试验的auc最大，则哪一种试验的诊断价值最佳。

由图1和表1可知，联合使用6种特异性肠道菌相对含量评估ii型糖尿病发病风险效果显著auc实施例2＝0.819，p＜0.01(表1)。预测效果优于使用联合两种和四种特异性肠道菌的预测。auc实施例4＝0.680，p>0.05；auc实施例3＝0.749，p>0.05(图1)。联合使用6种特异性肠道菌检测则能够将灵敏度提高到78.9％，特异性保持在在较高的水平，为68.7％。

根据最优组合使用6细菌指标联合检测的logistic回归方程，将双歧杆菌属相对含量(x1)、普雷沃菌属相对含量(x2)、普拉梭菌相对含量(x3)、罗氏菌属相对含量(x4)、肠球菌属相对含量(x5)、韦荣球菌属相对含量(x6)代入式i所示的方程，计算p值，其中“*”表示乘积；

logit[p/(1-p)]＝4.43*x1-1.488*x2-5.898*x3+2827.96*x4+142.335*x5-761.306*x6-0.574(式i)；

本发明对入组的46例健康人、20例ii型糖尿病患者联合诊断的诊断点进行验证，及双歧杆菌属相对含量(x1)、普雷沃菌属(x2)、普拉梭菌(x3)、罗氏菌属(x4)、肠球菌属(x5)、韦荣球菌属(x6)数值代入logistic回归方程，计算样本p值。联合6种细菌检测方法的roc分析测定表明：根据“尤登指数”即敏感性-(1-特异性)，该指数值取最大值处就是最佳的界值，可得到“尤登指数”最大值为r＝0.819，即上述6种细菌联合检测敏感度为81.9％；在此条件下，健康人与ii型糖尿病患者的最佳界值为p＝0.1835，即所述样本p值与诊断点(p＝0.1835)进行比较，p>0.1835，判读为ii型糖尿病阳性，p≤0.1835判读为阴性。

综上所述，本次发明首次发现了联合使用粪便中6种特异性肠道菌相对含量指标对ii型糖尿病发病风险的预测作用。较全基因组检测的方式相比，本发明利用所述6种特定细菌的相对含量进行模型运算，显著降低检测的时间和经济成本，同时可以有效预测ii型糖尿病患病风险，特异性好，灵敏度高，通过微生物标志物相对含量判断个体内微生态状态，预警ii型糖尿病的潜在风险，进行早期干预，抑制ii型糖尿病的发生或发展。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

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<110>上海宝藤生物医药科技股份有限公司

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