本发明涉及畜牧兽医技术领域，尤其涉及一种抗羊f17大肠杆菌感染的基因筛选方法。
背景技术：
在现代化的集约化养羊生产过程中，羔羊的饲养已成为最重要的环节之一。羊大肠杆菌病是规模化羊场最为常见高发的细菌性疾病之一，传统沿用的抗生素治疗方案存在诸多缺陷，此外，药物残留还严重影响畜产品的品质。因此需要寻找和探究优质、安全的抗生素替代方法。羊大肠杆菌病，是由大肠杆菌引起的一种以剧烈腹泻和败血症为特征的急性传染病，特别是产肠毒素大肠杆菌(etec)感染引起的初生羔羊腹泻，又叫羔羊白痢。该病主要通过消化道感染，临床主要表现为腹泻、虚脱，卧地不起，如不及时治疗，常在24～36h死亡。致死率15％～75％，给养殖户带来严重的经济损失。建立一种抗羊f17大肠杆菌感染的基因筛选方法，有利于筛选出高效的基因，对防治羊f17大肠杆菌感染具有重要意义。
传统的基因筛选技术主要包括差减杂交技术、基因芯片技术。尽管目前我国已开展了大量的疾病抗性基因的筛选工作，并且广泛应用于生产实践，但是这些技术存在着盲目性、效率低以及针对性不强等缺点。
技术实现要素：
本发明的主要目的是提供一种抗羊f17大肠杆菌感染的基因的筛选方法，旨在解决传统的基因筛选技术存在的盲目性、效率低以及针对性不强等缺点。
为实现上述目的，本发明提出了一种抗羊f17大肠杆菌感染的基因的筛选方法，包括以下步骤：
步骤s1、挑选f17大肠杆菌感染的发病羔羊和抗病羔羊，对应采集发病羔羊和抗病羔羊的脾脏和肠道内容物的样品；统计羔羊腹泻率，观察肠道组织形态结构，计算肠道细菌数量；
步骤s2、提取发病羔羊和抗病羔羊的脾脏样品中基因组，进行高通量测序；
步骤s3、对高通量测序的测序数据进行转录组学对比分析；
步骤s4、根据转录组学对比分析的结果，比较发病羔羊和抗病羔羊脾脏中的差异基因，根据分析结果和基因的功能确定筛选基因，即筛选出抗羊f17大肠杆菌感染的基因。
所述的步骤s1包括：
将试验动物分为攻毒试验组和健康对照组，两组之间严格隔离饲养，组内羔羊分栏单独饲养；攻毒试验开始前先饲喂不含抗生素的代乳料，并观察出生羔羊的生理状态，若连续2天无羔羊出现腹泻现象，可排除由代乳料导致羔羊消化不良而引起的腹泻，此时可进行攻毒试验；攻毒试验中，通过向羔羊灌喂f17大肠杆菌菌液进行攻毒试验，每只羔羊每天接受f17大肠杆菌菌株的平均剂量是4.6×108cfu·ml-1，每6小时观察一次羔羊状态，连续灌喂3d或直至羔羊出现腹泻症状，攻毒试验中，每天观察羔羊粪便，以四种粪便黏稠度为标准进行记录，挑选具有典型临床症状及明显病理损伤的发病羔羊和无典型临床症状及明显病理损伤的抗病羔羊；
对应采集发病羔羊和抗病羔羊的肠道内容物的样品，于-80℃保存备用；
其中，临床症状包括羔羊痢疾、水样腹泻、精神不振，病理损伤包括羔羊肠内充满黄色液体，肠系膜充血、小肠绒毛缩短；
在采集发病羔羊和抗病羔羊的脾脏和肠道内容物的样品过程中，至少要采集3个重复作为样品。
所述的步骤s2包括：用试剂盒提取脾脏样品总rna，构建文库，用测序仪进行测序。
所述的步骤s3包括：对高通量测序的测序数据进行reads比对结果统计、circrna鉴定、circrna基因结构分析及序列预测、circrna表达量计算、样品间相关性检验、差异表达circrna分析，分析发病羔羊和抗病羔羊的差异基因。
所述的步骤s4包括：根据转录组学对比分析的结果，比较发病羔羊和抗病羔羊脾脏中的差异基因，根据分析结果和基因的功能确定筛选基因，即筛选出抗羊f17大肠杆菌感染的基因。
在步骤s1中，对试验羔羊进行大肠杆菌攻毒试验，统计试验羔羊的腹泻率，并检测试验羔羊肠道组织形态结构，根据腹泻率的统计结果、肠道组织形态结构，来分析f17大肠杆菌感染的效果；其中，所述试验羔羊为没有进行大肠杆菌免疫的新生羔羊。
步骤s1中，将没有进行大肠杆菌免疫的3日龄羔羊作为试验羔羊；提取肠道黏膜组织样品，观测肠道组织形态结构及细菌数量；根据腹泻率的统计结果，肠道组织形态结构、及细菌数量，来评判试验羔羊抗大肠杆菌感染的能力。
相对于现有技术，本发明提供的抗羊f17大肠杆菌感染的基因的筛选方法，采用从发病羔羊和抗病羔羊的脾脏转录组学大数据分析入手，有针对性地从抗病羔羊道庞大的微生物基因中筛选具有抗大肠杆菌感染的基因，所筛选的基因来源于本体动物，针对性强，准确性高，节省了大量的人力、物力及时间；根据饲喂代乳料之后的情况，排除由代乳料引起的腹泻，且提供粪便形态的鉴定标准，有针对性地提高了绵羊大肠杆菌的攻毒成功率。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种抗羊f17大肠杆菌感染的基因的筛选方法，所述抗羊f17大肠杆菌感染的基因的筛选方法包括以下步骤：
步骤s1、挑选大肠杆菌感染的发病羔羊和抗病羔羊，对应采集发病羔羊和抗病羔羊的脾脏和肠道内容物样品；统计羔羊腹泻率，观察肠道组织形态结构，计算肠道细菌数量；
在本实施例中，步骤s1包括：
将试验羔羊分为攻毒试验组和健康对照组，攻毒试验组服用f17大肠杆菌，两组之间严格隔离饲养，组内羔羊分栏单独饲养。攻毒试验开始前先饲喂代乳料(不含抗生素)，并观察出生羔羊的生理状态，若连续2天无羔羊出现腹泻现象，可排除由代乳料导致羔羊消化不良而引起的腹泻，此时可进行攻毒试验。攻毒试验采用灌喂进行f17大肠杆菌攻毒试验，每只羔羊每天接受f17大肠杆菌菌株的平均剂量是4.6×108cfu·ml-1，每6小时观察一次羔羊状态，并逐渐增加攻毒剂量，连续灌喂3d或直至羔羊出现腹泻症状，在攻毒后，每天观察羔羊粪便，以四种粪便黏稠度为标准进行记录，挑选具有典型临床症状及明显病理损伤的发病羔羊和无典型临床症状及明显病理损伤的抗病羔羊；
表1粪便分类表
对应采集发病羔羊和抗病羔羊的肠道内容物样品，于-80℃保存备用；
其中，临床症状观察包括羔羊痢疾、水样腹泻、精神不振等典型临床症状的观察，病理损伤检测包括羔羊肠内充满黄色液体，肠系膜充血，小肠绒毛缩短等病理损伤的剖检。
在采集发病羔羊和抗病羔羊的脾脏和肠道内容物样品的过程中，至少要采集3个重复作为样品。如此，提高了样品采集的严谨性，避免了由于所采集样品具有偶然性而导致最终的筛选结果不准确的问题。
步骤s2、提取发病羔羊和抗病羔羊的脾脏基因组，并进行高通量测序；
在本实施例中，步骤s2包括：
提取脾脏(脾脏是机体最大免疫器官)样品总rna并使用试剂盒ribo-zero消化核糖体rna后；加入打断试剂将rna打断成短片段，以打断后的rna为模板,用六碱基随机引物合成一链cdna，然后配制二链合成反应体系合成二链cdna，在cdna二链合成时以dutp代替dttp,然后连接不同接头，再利用ung酶法将含有dutp的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cdna一链；使用试剂盒纯化cdna一链；纯化的cdna一链再进行末端修复、加a尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行pcr扩增；构建好的文库用测序仪进行测序；
步骤s3、对高通量测序的测序数据进行转录组学对比分析；
在本实施例中，步骤s3包括：
reads比对结果统计(参考基因组)；
利用tophat2(http://tophat.cbcb.umd.edu/)将cleanreads与指定的参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息。tophat2是以比对软件bowtie2为基础，将转录组测序reads比对到基因组上，通过分析比对结果识别外显子之间的剪接点(splicingjunction)。这不仅为可变剪接分析提供了数据基础，还能够使更多的reads比对到参考基因组，提高了测序数据的利用率；
circrna鉴定；
circbase数据库中收录了人、小鼠、线虫、矛尾鱼和腔棘鱼五个物种的circrna序列。如果待分析的物种属于上述物种之一，首先测序序列使用ciri软件进行circrna预测，将预测结果与上述数据库比对，得到已知cricrna和新预测的cricrna。如果物种不属于上述物种，则使用ciri软件从头预测circrna。ciri软件使用bwa软件与参考基因序列比对，生成sam文件，并对sam文件中的cigar值进行分析，从sam文件中扫描pcc信号(pairedchiasticclippingsignals)。cigar值在junctionread的特征是xs/hym或者xmys/h，其中x、y代表碱基数目，m是mapping上的，s是softclipping，h是hardclipping。对于双端reads，ciri算法会考虑一对reads，其中一条可以mapping到circrna上，另一条也需要mapping到circrna的区间内。对于单外显子成环，或者“长外显子1-短外显子-长外显子2”形成的环形结构，cigar值应该是xs/hymzs/h以及(x+y)s/hzm或者xm(y+z)s/h，ciri软件可以很好的将这两种情况分开。对于splicing信号(gt-ag)，ciri也会考虑其他弱splicing信息例如(at-ac)，算法会从gtf/gff文件中抽取外显子边界位置，并用已知的边界来过滤假阳性；
circrna基因结构分析及序列预测；
将circrna与基因元件进行比较，从而探索circrna在基因组上的分布。根据circrna在基因组上的位置，可以将circrna分为以下五类：exoniccircrna、introniccircrna、antisensecircrna、senseoverlappingcircrna、intergeniccircrna；基于数据库中释放的蛋白编码基因及转录本的注释信息，通过位置信息比对，获取与circrna在位置上有着最大重叠的转录本，基于该转录本信息，对circrna的序列进行预测；
circrna表达量计算；
统计比对到每一个基因上readcount值，作为基因的原始表达量，利用rpm(splicedreadspermillionmapping)对circrna进行定量；
样品间相关性检验；
相关系数：样品间circrna表达水平相关性可以用来检验实验可靠性和样本选择合理性。相关系数越接近1，表明样品之间表达模式的相似度越高；
pca分析：当样本数目较多时(≥3)，可以利用circrna的表达量进行主成分分析(pca分析)，考察样品分布情况，对样本间关系进行探究或者对实验设计进行验证。pca可以从不同维度展现样品间的关系。样本聚类距离或者pca距离越近，说明样本越相似。各组样本分布在二维空间的不同区域，同组的样品在空间分布比较集中；
利用聚类方法计算样本和样本的距离，从而对样本之间的相似性进行考察。该分析结果能准确反映实验设计情况，属于同一设计的样本距离相近，优先聚在一起；
差异表达circrna分析；
差异表达分析旨在找出不同样本间存在差异表达的circrna，得到差异表达circrna之后，我们对其来源基因做go功能显著性和keggpathway显著性分析。deseq适用于有生物学重复的实验，可以进行样品组间的差异表达分析，获得两个生物学条件之间的差异表达circrna列表；对于没有生物学重复的实验，则使用edger[5]进行差异表达分析，获得两个样品之间的差异表达circrna列表；
根据转录组学对比分析的结果，比较发病羔羊和抗病羔羊脾脏中的差异基因并从只出现在抗病羔羊肠道中的差异基因中分析出其中的优势基因；
本发明提供的抗羊f17大肠杆菌感染的基因的筛选方法，通过对大肠杆菌感染的发病羔羊和抗病羔羊脾脏的转录组学大数据分析入手，有针对性地从抗病羔羊脾脏庞大的基因组中筛选出具有抗f17大肠杆菌感染的基因，所筛选的基因来源于本体动物，针对性强，避免了筛选的盲目性，提高了筛选效率，节省了大量的人力、物力及时间。
以上所述仅为本发明的优选方案，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。