本发明属于玉米黄曲霉穗腐病抗性鉴定
技术领域：
，具体涉及一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法。
背景技术：
：玉米穗腐病是一个与人类健康关系密切的玉米病害。全世界各地玉米生产地区都有发生。这个病害的真菌复合体可以产生几种真菌毒素(mycotoxin)，如黄曲霉毒素和伏马毒素等影响人和动物健康的化学物质。曲霉菌中的黄曲霉菌(aflavus)不仅为害玉米等多种粮食，还产生有毒代谢产物黄曲霉毒素，引起人和家畜、家禽中毒。医学研究表明，长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌，胃癌，肠癌等疾病的主要原因。玉米果穗及籽粒均可受害，症状为被害果穗或籽粒出现黄色、黄绿色、黄褐色霉层，即病原菌的菌丝体、分生孢子梗和分生孢子。病粒无光泽，不饱满，腐烂，内部空虚，常为交织的菌丝和孢子所充塞。果穗病部苞叶常被密集的菌丝贯穿，黏结在一起贴于果穗上不易剥离。玉米一旦感染该病害，引起的黄曲霉毒素积累问题，会导致食品污染、饲料污染，并且通过食物链进入人体，进而引起人体病变。玉米中的毒素超标使饲料生产厂家不愿收购本地玉米来作为饲料加工原料，致使本地玉米商品率和价格低下。目前，药剂防治对该病害基本无效。因此，种植抗病品种是解决该病害最经济有效的途径。抗病品种的筛选需要简单、易行、准确的抗性鉴定技术。然而，现有的玉米黄曲霉穗腐病抗性鉴定技术一般为大田人工接种技术，通过玉米品种在大田种植的条件下，在玉米果穗吐丝期用带菌针刺伤籽粒接种，待到果穗成熟收获时进行抗性水平调查进行鉴定；现有技术的缺陷为需要在田间种植玉米品种，工作量大、成本高、周期长，鉴定结果受气候条件影响大。技术实现要素：为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法。本发明所采用的技术方案为：一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。进一步的，所述步骤a包括：将黄曲霉菌种接种于pda平板上，恒温培养出黄曲霉孢子，用无菌水与所述黄曲霉孢子混合后得到黄曲霉菌孢子悬浮液。进一步的，所述步骤a中恒温的温度为20℃-25℃；所述黄曲霉菌孢子悬浮液中黄曲霉孢子的数量为1×105个/ml-1×107个/ml。进一步的，所述步骤b包括：对各供试玉米品种的每个籽粒进行消毒处理、无菌水清洗、灭菌滤纸沥干后得到多种消毒的供试玉米品种样品。进一步的，所述步骤b的消毒处理包括将各供试玉米品种的每个籽粒先后用酒精、次氯酸钠浸泡的步骤。进一步的，所述步骤b中酒精的质量分数为75％，次氯酸钠的质量分数为3％；各供试玉米品种的每个籽粒用酒精浸泡的时间为30s；各供试玉米品种的每个籽粒用次氯酸钠浸泡的时间为3min。进一步的，所述步骤c的具体步骤：吸取定量黄曲霉菌孢子悬浮液润湿灭菌滤纸，得到润湿滤纸；将供试玉米样品的每个籽粒放在润湿滤纸上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种。进一步的，所述步骤c中恒温培养的温度为20℃-25℃；所述步骤c润湿一张灭菌滤纸吸取的黄曲霉菌孢子悬浮液的体积为5ml；每张润湿滤纸放置的籽粒数量为10粒。本发明的有益效果为：本发明的一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法采用室内鉴定的方式，避免了大田鉴定需要种植在田间的用地费用、栽培管理费用的成本；本发明的鉴定方法的鉴定周期为1周，与大田鉴定一季需要4个月相比，大大减少了时间周期；本发明的鉴定方法在室内恒温培养箱中培养，避免了田间气候条件不稳定造成的发病不充分等导致的结果不准确的误差；本发明可大大减少田间鉴定产生的大量黄曲霉菌，减少对环境的污染。本发明节约了人力、物力成本，操作简单，鉴定结果更加稳定、可信。从而本发明具有鉴定周期短、鉴定成本低和结果准确的特点。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。进一步的，所述步骤a包括：将黄曲霉菌种接种于pda平板上，恒温培养出黄曲霉孢子，用无菌水与所述黄曲霉孢子混合后得到黄曲霉菌孢子悬浮液。进一步的，所述步骤a中恒温的温度为20℃-25℃；所述黄曲霉菌孢子悬浮液中黄曲霉孢子的数量为1×105个/ml-1×107个/ml。进一步的，所述步骤b包括：对各供试玉米品种的每个籽粒进行消毒处理、无菌水清洗、灭菌滤纸沥干后得到多种消毒的供试玉米品种样品。进一步的，所述步骤b的消毒处理包括将各供试玉米品种的每个籽粒先后用酒精、次氯酸钠浸泡的步骤。进一步的，所述步骤b中酒精的质量分数为75％，次氯酸钠的质量分数为3％；各供试玉米品种的每个籽粒用酒精浸泡的时间为30s；各供试玉米品种的每个籽粒用次氯酸钠浸泡的时间为3min。进一步的，所述步骤c的具体步骤：吸取定量黄曲霉菌孢子悬浮液润湿灭菌滤纸，得到润湿滤纸；将供试玉米样品的每个籽粒放在润湿滤纸上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种。进一步的，所述步骤c中恒温培养的温度为20℃-25℃；所述步骤c润湿一张灭菌滤纸吸取的黄曲霉菌孢子悬浮液的体积为5ml；每张润湿滤纸放置的籽粒数量为10粒。实施例1一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。实施例2一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。所述步骤a包括：将黄曲霉菌种接种于pda平板上，恒温培养出黄曲霉孢子，用无菌水与所述黄曲霉孢子混合后得到黄曲霉菌孢子悬浮液。本发明中的pda为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂粉18g，水1000ml)，通过pda平板接种黄曲霉菌种后培养出黄曲霉孢子作为后续接种步骤使用。实施例3一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。所述步骤a包括：将黄曲霉菌种接种于pda平板上，恒温培养出黄曲霉孢子，用无菌水与所述黄曲霉孢子混合后得到黄曲霉菌孢子悬浮液。本发明中的pda为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂粉18g，水1000ml)，通过pda平板接种黄曲霉菌种后培养出黄曲霉孢子作为后续接种步骤使用。所述步骤a中恒温的温度为20℃；所述黄曲霉菌孢子悬浮液中黄曲霉孢子的数量为1×105个/ml。实施例4一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。所述步骤a包括：将黄曲霉菌种接种于pda平板上，恒温培养出黄曲霉孢子，用无菌水与所述黄曲霉孢子混合后得到黄曲霉菌孢子悬浮液。本发明中的pda为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂粉18g，水1000ml)，通过pda平板接种黄曲霉菌种后培养出黄曲霉孢子作为后续接种步骤使用。所述步骤a中恒温的温度为23℃；所述黄曲霉菌孢子悬浮液中黄曲霉孢子的数量为1×107个/ml。实施例5一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。所述步骤a包括：将黄曲霉菌种接种于pda平板上，恒温培养出黄曲霉孢子，用无菌水与所述黄曲霉孢子混合后得到黄曲霉菌孢子悬浮液。本发明中的pda为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂粉18g，水1000ml)，通过pda平板接种黄曲霉菌种后培养出黄曲霉孢子作为后续接种步骤使用。所述步骤a中恒温的温度为25℃；所述黄曲霉菌孢子悬浮液中黄曲霉孢子的数量为1×106个/ml。实施例6一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。所述步骤a包括：将黄曲霉菌种接种于pda平板上，恒温培养出黄曲霉孢子，用无菌水与所述黄曲霉孢子混合后得到黄曲霉菌孢子悬浮液。本发明中的pda为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂粉18g，水1000ml)，通过pda平板接种黄曲霉菌种后培养出黄曲霉孢子作为后续接种步骤使用。所述步骤a中恒温的温度为25℃；所述黄曲霉菌孢子悬浮液中黄曲霉孢子的数量为1×106个/ml。所述步骤b包括：对各供试玉米品种的每个籽粒进行消毒处理、无菌水清洗、灭菌滤纸沥干后得到多种消毒的供试玉米品种样品；所述步骤b的消毒处理包括将各供试玉米品种的每个籽粒先后用酒精、次氯酸钠浸泡的步骤；所述步骤b中酒精的质量分数为75％，次氯酸钠的质量分数为3％；各供试玉米品种的每个籽粒用酒精浸泡的时间为30s；各供试玉米品种的每个籽粒用次氯酸钠浸泡的时间为3min。实施例7一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。所述步骤c的具体步骤：吸取定量黄曲霉菌孢子悬浮液润湿灭菌滤纸，得到润湿滤纸；将供试玉米样品的每个籽粒放在润湿滤纸上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种。所述步骤c中恒温培养的温度为20℃；所述步骤c润湿一张灭菌滤纸吸取的黄曲霉菌孢子悬浮液的体积为5ml；每张润湿滤纸放置的籽粒数量为10粒。实施例8一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。所述步骤c的具体步骤：吸取定量黄曲霉菌孢子悬浮液润湿灭菌滤纸，得到润湿滤纸；将供试玉米样品的每个籽粒放在润湿滤纸上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种。所述步骤c中恒温培养的温度为22℃；所述步骤c润湿一张灭菌滤纸吸取的黄曲霉菌孢子悬浮液的体积为5ml；每张润湿滤纸放置的籽粒数量为10粒。实施例9一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：a、制备黄曲霉菌孢子悬浮液；b、制备消毒的供试玉米品种样品；c、将黄曲霉菌孢子悬浮液分别接种在每种消毒的供试玉米样品的每个籽粒上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种；d、使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。所述步骤c的具体步骤：吸取定量黄曲霉菌孢子悬浮液润湿灭菌滤纸，得到润湿滤纸；将供试玉米样品的每个籽粒放在润湿滤纸上，恒温培养，得到感染病害的玉米品种。所述步骤c中恒温培养的温度为25℃；所述步骤c润湿一张灭菌滤纸吸取的黄曲霉菌孢子悬浮液的体积为5ml；每张润湿滤纸放置的籽粒数量为10粒。实施例10一种玉米病害抗性的室内快速鉴定方法，包括步骤：菌源制备方法：将保存的黄曲霉菌种接种于pda平板上，25℃下恒温培养5d，待黄曲霉菌长满平板后，用无菌水洗下黄曲霉孢子，用血球计数板在显微镜下计数，将菌液稀释成1×106个/ml待用。供试玉米样品处理：选取籽粒饱满、大小一致、外观健康的籽粒进行消毒处理，先用75％酒精浸泡一分钟，然后用3％次氯酸钠浸泡三分钟，最后用蒸馏水清洗三次，放在灭菌滤纸上沥干水分备用。接种方法：在培养皿底部放置一层灭菌滤纸，吸取5ml孢子悬浮液均匀润湿滤纸，将已消毒的籽粒放入培养皿中的湿润滤纸上，每皿均匀放置10粒，盖好盖子，放入恒温培养箱中25℃下培养。7天后观察拍照，记录发病情况。另外，本发明的步骤c还可以以下方式进行接种，采用接种了菌株的pda平板代替灭菌滤纸，或用供试玉米籽粒样品在黄曲霉菌液中浸湿后放在灭菌滤纸上，或者将玉米籽粒样品放在灭菌滤纸上后，将菌液喷雾到籽粒上进行接种，3种方法均能使籽粒发病。使用发病级别为9级的感病品种作为对照，确定每种感染病害的玉米品种的平均病级，按照所述平均病级划分抗性，实现玉米黄曲霉穗腐病抗性的鉴定。对比例对照设置：使用感病品种作为对照，待对照发病达到9级标准时，开始调查供试样品发病情况。病级判断标准：如下表1。表1玉米抗黄曲霉穗腐病鉴定病情级别划分病情分级描述1发病面积占籽粒总面积0％～1％3发病面积占籽粒总面积2％～10％5发病面积占籽粒总面积11％～25％7发病面积占籽粒总面积26％～50％9发病面积占籽粒总面积51％～100％将供试26个玉米品种的籽粒放在培养皿中，接种后7天，调查结果如下表2。通过下表2的结果可知，26个品种病级最低为3.9，最大为9.0，根据品种抗感划分标准，可将不同玉米品种的抗性充分表达。其中平均病级为每个品种的供试玉米样品的所有籽粒的病级之和与每个品种的所有籽粒的数量的比值。表226个玉米品种室内接种鉴定黄曲霉的平均病级结果具体的抗性水平划分见如下表3。表3玉米对穗腐病抗性的抗性水平划分平均病情级别抗性≤1.5高抗highlyresistant(hr)1.6～3.5抗resistant(r)3.6～5.5中抗moderatelyresistant(mr)5.6～7.5感susceptible(s)7.6～9.0高感highlysusceptible(hs)从而，本发明使用感病品种作为对照，采用上述室内快速鉴定方法，实现了室内鉴定，大大减少了时间周期；避免了气候条件不稳定造成的发病不充分等导致的结果不准确的误差；同时减少对环境的污染。本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。当前第1页12