高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用。

背景技术：

山西老陈醋以优质高梁为主要原料，大曲为发酵剂，采用传统自然固体发酵并结合独特熏、淋、晒等工艺，形成老陈醋独特的酸、绵、香、甜风味与口感。老陈醋的独特风味得益于其天然发酵过程中微生物菌群的生长代谢及复杂的协同作用，这些微生物代谢产生丰富的酶类、风味、滋味及其他生理功能（抗氧化、降血压等）物质。除霉菌、酵母菌、乳酸菌、醋酸菌外，芽孢菌也是山西老陈醋发酵生产过程中的重要微生物种群，其在糖化酶和蛋白酶产生、风味贡献、功能活性物质生成（乙偶姻-川芎嗪重要前体物质，多酚等）、抑制杂菌等具有重要意义。

乙偶姻是山西老陈醋重要功能成分川芎嗪的前体物质。目前，关于微生物发酵体系中川芎嗪的生成机制主要存在两种观点，其一是由微生物经糖代谢产生乙偶姻，乙偶姻继续被微生物细胞中的酶催化生成川芎嗪；其二是微生物发酵体系中的乙偶姻和氨化学反应合成川芎嗪。为了提高陈醋中川芎嗪的含量，一些学者进行了产乙偶姻菌种的筛选工作，包括酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和芽孢菌，研究证明芽孢菌的乙偶姻产量及稳定性显著优于其他菌种。

研究表明，山西老陈醋酒精发酵过程中，芽孢菌可以生成具有水果香味的乙酸乙酯、具有菠萝香味的庚酸乙酯、带有花生香气的十二酸乙酯等特征风味物质；在醋酸发酵阶段，芽孢菌代谢产生的乳酸、苹果酸、酒石酸、丙酮酸等有机酸，一方面能缓冲乙酸带来的强烈刺激性酸味，另一方面可以与醇类物质酯化生成酯类物质，丰富老陈醋味感与口感。

关于产香和产四甲基吡嗪（川芎嗪）芽孢菌的应用，目前主要集中在酒类酿造中。2016年王婧等人将产四甲基吡嗪的功能芽孢杆菌fbkl1.0199和fbkl1.0201添加到粹沙酱香型白酒的生产中，结果发现，与未加入功能性芽孢杆菌的对照组进行对比，粹沙酱香型白酒中四甲基吡嗪含量明显提高，且酒质清亮透明，酒体协调，苦味较少，酱香风味突出。关于食醋酿造过程中芽孢菌的开发应用研究较少。本发明主要是从山西老陈醋发酵过程中分离筛选出一株高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌，并将其制备成直投式发酵剂应用在传统食醋生产中，对于提高山西老陈醋的营养生理功能和丰富风味具有重要意义。

技术实现要素：

本发明涉及一种高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用。

本发明的技术方案如下：

高产乙偶姻、多酚及增香芽孢菌的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离出的50株芽孢菌进行产乙偶姻能力的测定；再对产乙偶姻能力排在前3位的芽孢菌产多酚、产酯、有机酸及挥发性香气成分的种类和含量进行测定，从中筛选出一株高产乙偶姻及增香的山西老陈醋土著芽孢菌15，乙偶姻产量为45.63g/l，多酚产量为453.00μg/ml，在高粱汁培养基和醋醅模拟培养基中产酯量分别为8.53g/100ml、7.61g/100ml，有机酸总量分别为0.5177g/l、1.3406g/l。

高产乙偶姻、多酚及增香芽孢菌15的鉴定：对芽孢菌15进行形态学和16srdna测序鉴定，采用的引物为：上游：5′-cagatgggagcttgctccctg-3′下游：5′-cgacttcacccaatcatctg-3′，经鉴定为莫海威芽孢杆菌（bacillusmojavensis）。将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年12月10日，保藏编号：cgmcc16910。

莫海威芽孢杆菌cgmcc16910的菌落及细胞形态特征为：在mrs平板培养基上形成菌落直径4.80mm，菌落边缘不整齐、表面粗糙且褶皱明显、半透明、干燥、中间凸起呈脊状、有黏度、浅黄色；其细胞形态：革兰氏染色呈g⁺，呈杆状，中间有芽孢。

莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂的制备方法：将活化后的莫海威芽孢杆菌cgmcc16910按照3%的接种量接入到mrs液体培养基中，37℃，180r/min培养24h后，菌体浓度达到10⁸cfu/ml，采用中空纤维膜浓缩莫海威芽孢杆菌发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v）混合，低温喷雾干燥（进风温度为120℃，出风温度为55℃），至水分含量为≤5%时，真空包装即为莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂，其活菌数为10¹⁰cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。

将莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中的具体方法为：

高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水搅拌均匀，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的直投式发酵剂（1g直投式发酵剂溶解到10ml无菌水中，37℃活化30min后备用），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵；酒精度为6%时，加入200公斤麸皮和160公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（上一批发酵第2天的醋醅），再加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的直投式发酵剂，控制发酵罐内温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标，有机酸及挥发性香气成分。

采用增香莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，最终新淋醋中川芎嗪（266.47μg/ml）、多酚（514μg/ml）等生理功能成分显著提高，并且总酸、不挥发性酸及总酯的含量也显著提高，与对照相比分别提高了59.04%、77.89%、74.32%，另外，还丰富了挥发性香气谱图及含量。

附图说明

图1为莫海威芽孢杆菌cgmcc16910的菌落形态和细胞形态图，图中a为莫海威芽孢杆菌cgmcc16910的菌落形态图；b为莫海威芽孢杆菌cgmcc16910在1000×下的细胞形态图；

图2为莫海威芽孢杆菌cgmcc16910的16srdna系统发育树。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：高产乙偶姻、多酚及增香芽孢菌的筛选

（1）高产乙偶姻芽孢菌的筛选：分别采集山西老陈醋酒精发酵阶段的酒醪样品和醋酸发酵阶段的醋醅样品，采用mrs培养基进行稀释涂布，最终共分离出50株芽孢菌。采用voges-proskauer(v-p)反应和分光光度法对其产乙偶姻能力进行测定，其中芽孢菌15产乙偶姻最高，为45.63g/l；其次是芽孢菌297（40.52g/l）和芽孢菌2030（40.28g/l）。

上述的mrs固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，k2hpo42g，乙酸钠2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，吐温801ml，mgso40.2g，mnso40.05g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调ph6.2‒6.6，121℃灭菌20min备用。

上述测定乙偶姻的voges-proskauer(v-p)反应原理为：乙偶姻在碱性条件下可被氧化为2,3-丁二酮，2,3-丁二酮与带有胍基的肌酸反应，可产生粉红色复合物，该粉红色复合物在波长516nm处有最大吸收峰。

上述测定乙偶姻的voges-proskauer(v-p)反应具体方法为：

乙偶姻标准曲线制作：称取乙偶姻1g，溶于100ml蒸馏水中，即得1.0mg/ml乙偶姻溶液，吸取0.0，0.6，1.2，1.8，2.4ml于10ml试管中，编号，补加蒸馏水至3.0ml，加入3.0ml改良o’meara(含3%肌酸、0.5%蛋白胨的40%naoh水溶液)试剂，振荡2min，37℃条件下反应60min后，充分振荡均匀后测定516nm处的吸光值，并绘制标准曲线。

菌株产乙偶姻能力的测定：将从山西老陈醋发酵过程分离得到的50株芽孢菌按照2%的接种量接种于voges-proskauer(v-p)培养基，37℃，180r/min培养24h后，将发酵液8000r/min离心10min，取菌株发酵上清液3.0ml，加入3.0ml改良o’meara试剂，充分震荡均匀，于37℃条件下反应60min后，摇匀，用比色法测定各反应液在516nm处吸光值。

上述voges-proskauer(v-p)培养基的制备方法为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，kh2po45g，加水至1000ml，ph调至7.0，于121℃湿热灭菌20min。

（2）高产多酚芽孢菌的筛选：采用福林-酚比色法对产乙偶姻能力排在前3位的芽孢菌的产多酚能力进行测定。最终发现芽孢菌15的产多酚的能力最强，产量达453.00μg/ml。

上述福林-酚比色法测定多酚的具体方法为：

没食子酸标准曲线的绘制：称取105℃条件下干燥恒重没食子酸0.0100g，溶于100ml水中，即得0.10mg/ml没食子酸溶液，吸取0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ml于10ml比色管中，补加超纯水至1ml，加入2ml福林试剂，静置3min，加入10%碳酸钠2ml，静置1h后，于700nm处测得吸光值，并绘制标准曲线。

菌株产总酚能力的测定：将芽孢菌15按照2%的接种量接种于mrs培养基，37℃，180r/min培养24h后，将发酵液8000r/min离心10min，取菌株发酵上清液1.0ml，加入2ml福林试剂，静置3min，加入10%碳酸钠2ml，静置1h后，于700nm处测得吸光度值。

（3）产香芽孢菌的筛选：

芽孢菌产酯含量的测定：采用氢氧化钠皂化法对产乙偶姻能力排在前3位的芽孢菌在高粱汁培养基和醋醅模拟培养基的产酯能力进行测定。最终发现芽孢菌15在高粱汁培养基和醋醅模拟培养基产酯量分别为8.53g/100ml和7.61g/100ml。

上述氢氧化钠皂化法测定产酯的具体方法为：将活化后的芽孢菌按3%的接种量分别接入高粱汁培养基和醋醅模拟培养基中，接入高粱汁培养基的芽孢菌在37℃，180r/min培养6天后取样备用，接入醋醅模拟培养基的芽孢菌在37℃静置培养6天后取样10g，加90ml蒸馏水浸泡0.5h‒1h，间断搅拌，之后4000r/min离心10min取上清备用。并采用氢氧化钠皂化法测定其产酯量。所述的采用氢氧化钠皂化法测定其产酯量具体方法为：取上述备用样品10ml加入30ml蒸馏水于锥形瓶中，用0.05mol/l的naoh标准溶液滴定至ph为8.2时，再准确加入0.1mol/l氢氧化钠标准溶液20ml，摇匀，装上冷凝管，于沸水浴上回流0.5h，取下，冷却至室温，用盐酸标准溶液进行反滴定，以ph8.2为终点，记录消耗盐酸标准溶液的体积。

芽孢菌有机酸及挥发性香气成分的测定：对产乙偶姻能力排在前3位的芽孢菌进行有机酸和挥发性香气成分的测定，将活化后的菌株按3%的接种量分别接入高粱汁培养基和醋醅模拟培养基中，测定有机酸和挥发性香气的种类和含量。

上述高粱汁培养基的制备方法为：将高粱200g粉碎至四至六瓣，加4倍的水润料4h后在温度为85‒90℃下糊化1h，期间不断搅拌，加入0.5g高温淀粉酶（70000u）于100℃蒸煮60min至不粘手无生心停火，冷却至室温过滤的滤液于121℃灭菌20min备用。上述醋醅模拟固体培养基的制备方法为：取自山西老陈醋醋酸发酵第0天的醋醅。

上述hplc和gc-ms的具体测定方法如下：

hplc法测定有机酸含量：取上述培养6天的样品5g，用超纯水定容至50ml，12000r/min离心5min取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，上样。色谱测定条件为：液相系统uitimate3000；色谱柱c184.6×150mm，5μm；流动相20mmol/lnah2po4，ph=2.7；进样量20μl；流动速度0.8ml/min；检测器uv210nm；柱温：室温。

gc-ms法测定挥发性香气成分：采用顶空固相微萃取对上述培养6d的样品进行萃取，并采用直接内标法测定其挥发性香气的种类和含量。色谱条件：色谱柱为vf-5ms（30×0.25mm×0.25mm），载气：氦气，纯度99.999%，流量1ml/min，不分流。程序升温：起始温度40℃，保持3min，以4℃/min的速度升至160℃，保持1min。再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。质谱条件：接口温度280℃，离子源温度280℃，电子能量70ev，扫描质量范围41‒500amu。

芽孢菌15的有机酸和挥发性香气的种类和含量显著优于其他菌株，芽孢菌15的有机酸测定结果如表1所示，其在高粱汁培养基和醋醅模拟培养基的有机酸含量分别达到0.5177g/l、1.3406g/l，其中乳酸是主要的不挥发性有机酸，其在两种培养基的含量分别达到0.2452g/l、0.7144g/l。

表1：芽孢菌15在高粱汁和醋醅模拟培养基中有机酸的测定结果

芽孢菌15的挥发性香气成分测定结果如表2所示，在高粱汁培养基和醋醅模拟培养基中分别检测出25种、28种挥发性香气物质，其中高粱汁培养基中酯类总含量（6.5973g/100ml）明显高于醋醅模拟培养基（0.6125g/100ml），而醋醅模拟培养基中酸类总含量（13.2265g/100ml）、醇类总含量（4.1346g/100ml）明显高于高粱汁培养基（1.9357g/100ml、1.7985g/100ml）。

表2：芽孢菌15在高粱汁和醋醅模拟培养基中挥发性香气的测定结果

实施例2：高产乙偶姻、多酚及增香芽孢菌15的菌株鉴定

形态学鉴定：用接种环挑取芽孢菌15少许后在mrs平板培养基上进行划线，分离出单菌落，将培养基上生长的菌落拍照，进行记录，然后通过革兰氏染色镜检，观察其细胞形态特征。芽孢菌15在mrs平板培养基上形成菌落直径4.80mm，菌落边缘不整齐、表面粗糙且褶皱明显、半透明、干燥、中间凸起如脊状、稍有黏度、浅黄色；其细胞形态：革兰氏染色呈g⁺，呈杆状，中间有芽孢，如图1所示。

16srdna测序：用试剂盒提取芽孢菌15的基因组，进行16srdna测序及菌种鉴定，引物为：上游：5′-cagatgggagcttgctccctg-3′下游：5′-cgacttcacccaatc

atctg-3′，采用blast软件经同源性比较，结果表明孢菌15与已报道的bacillusmojavensisb103（kp659610.1）和bacillusmojavensisb1151（kp659608.1）等菌株的同源性在99.9%以上。确定其为莫海威芽孢杆菌，并构建系统进化树，见图2。并将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为莫海威芽孢杆菌cgmcc16910。

实施例3：莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂的制备

将活化后的莫海威芽孢杆菌cgmcc16910按3%的接种量接入到mrs培养基中，37℃，180r/min培养24h后，此时菌体浓度达10⁸cfu/ml，采用中空纤维膜浓缩莫海威芽孢杆菌发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v）混合，通过低温喷雾干燥对发酵液进行处理后，真空包装即得莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂。

上述的保护剂制备方法为：a：脱脂奶粉10g，蒸馏水100ml，115℃灭菌15min；b：海藻糖1.5g、甘油0.5g、山梨醇2g、麦芽糊精1g、蒸馏水100ml，121℃灭菌15min；a，b分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。

上述的低温喷雾干燥工艺参数为：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间6min，水分含量为≤5%。制备的莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂，活菌数为10¹⁰cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。

实施例4：利用莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂强化山西老陈醋

高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水搅拌均匀，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，输送到酒精发酵罐中，酒精发酵8‒10天（经测定温度变化为25‒33℃），拌入前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入200公斤麸皮和160公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（上一批发酵第2天的醋醅）进行醋酸发酵10‒12天（经测定温度变化为24‒47℃），酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标（ph、总酸、还原糖、总酯、不挥发酸、氨基氮、波美度、川芎嗪、多酚）（结果见表3），有机酸（结果见表4）及挥发性香气成分（结果见表5）。

实施例5：以实施例4为对照例，按照上述方法在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入高粱重量0.5%的莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂（1g发酵剂溶到10ml无菌水中，37℃活化30min），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，酒精发酵8‒10天。

实施例6：以实施例4为对照例，按照上述方法在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量0.5%的莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂（1g发酵剂溶到10ml无菌水中，37℃活化30min），进行醋酸发酵10‒12天。

实施例7：以实施例4为对照例，按照上述方法在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入高粱重量0.5%的莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，酒精发酵8‒10天；在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量0.5%的莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂，进行醋酸发酵10‒12天。

采用莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，提高了新淋醋的总酸、川芎嗪等理化含量以及有机酸含量（见表3、4），而实施例7显著优于实施例4（对照例）。实施例7得到的新淋醋川芎嗪（266.47μg/ml）、多酚（514μg/ml）等生理功能成分显著提高，并且总酸含量为5.98g/100ml，不挥发性酸含量为1.69g/100ml，总酯含量为5.16g/100ml，与对照相比分别提高了59.04%、77.89%、74.32%（表3）；有机酸总含量由29.8663g/l提高为46.3830g/l（表4）；挥发性香气成分共检测出38种（酯类18种、醇类3种、酸类3种、酮类4种、醛类7种、酚类1种、其他2种），酯类总含量为4.63g/100ml、醇类总含量为0.84g/100ml、酸类总含量为4.55g/100ml、醛类总含量为22.00g/100ml；其中具有水果香味的乙酸乙酯（1.39g/100ml）、具有白兰地香气的辛酸乙酯（0.42g/100ml）、呈蜂蜜香的苯乙酸乙酯（0.11g/100ml）、呈椰子香的癸酸乙酯（0.10g/100ml）、具有柔和甜润玫瑰香的苯乙醇（0.45g/100ml）构成了山西老陈醋的独特风味，使得陈醋酸不涩口，酸绵幽香（表5）。

表3：采用莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋理化指标的测定结果

表4：采用莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋有机酸的测定结果

表5：采用莫海威芽孢杆菌cgmcc16910直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋挥发性香气成分的测定结果

上述山西老陈醋的ph测定用ph计直接测定；山西老陈醋的总酸参照gbt5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的还原糖、总酯、川芎嗪参照gbt19777-2013《地理标志产品山西老陈醋》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的不挥发酸参照gb18187-2000《酿造食醋》中单沸式蒸馏法进行测定；山西老陈醋的氨基氮参照gbt5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的波美度测定用波美比重计直接测定。