一种鉴别冬虫夏草真伪的引物对、试剂盒、方法及其用途与流程

本发明属于中药材鉴别领域，具体涉及一种鉴别冬虫夏草真伪的coi特异性引物对、包含其的试剂盒、鉴别冬虫夏草真伪的pcr方法及其在鉴别冬虫夏草真伪中的用途。

背景技术：

冬虫夏草(ophiocordycepssinensissym.cordyceps)为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾幼虫上的子座(子实体)及幼虫尸体的复合体，主要分布于青藏高原3000以上的雪线以上的地区。早在《本草备要》中记载：“冬虫夏草，甘平，保肺益肾，止血化痰，止劳咳。”近几十年来，由于产区雪线上移和人们过度采挖，造成了冬虫夏草资源稀缺，逐年递减，市场供不应求，使其价格十分昂贵。在利益的驱使下，不法商贩采取掺假、造假的手段牟利，从而使市场上出现了各种各种的伪品，常见的伪品有新疆虫草、亚香棒虫草、地蚕、虫草菌丝体、蝉花等，部分伪品的外观与冬虫夏草比较相似，且粉粹后与冬虫夏草粉极为相似。这些伪品药用价值和营养价值与冬虫夏草相差甚远，对其用药安全造成极大的威胁。由此可见，作为中华医宝的魁宝之一的冬虫夏草，对其身份的真实性鉴别显得非常重要。

近年来，随着中药鉴定学的发展，中药鉴定的新技术和新方法不断被应用，其中分子生物学的引入，使得可以从基因层面解决中药品种混乱的问题。目前，冬虫夏草真伪鉴别较多采用基源(外观、性状、显微)以及理化鉴别等传统方法，而分子生物学方法应用较少。文献《冬虫夏草的分子鉴定方法》(华西药学杂志，2017,32(20):205-207)、《冬虫夏草特异性pcr鉴定方法研究》(中国医学科学，2015，5(9):55-57)、《基于pcr的冬虫夏草检测方法研究》(中药材，2018,41(3):554-558))是基于its区设计了冬虫夏草特异性引物，然后通过pcr鉴别冬虫夏草真伪；申请号为cn201810150240.8、发明名称为“一种冬虫夏草的真伪鉴别方法”是基于coi区设计了冬虫夏草特异性并用于冬虫夏草真伪鉴别。而现有的这些文献所鉴别的冬虫夏草伪品数量较少。

另外，冬虫夏草作为一种虫菌复合体，根据所处的不同阶段，分为有性型(子囊孢子阶段)和无性型(分生孢子阶段)。日常我们所指的冬虫夏草是指有性型，即由冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾成功后形成的冬虫夏草虫菌复合体。同一种真菌寄生在不同寄主上，或者不同真菌寄生在同一寄主上，产生的外形相似的复合体都有可能成为冬虫夏草正品的伪品或混淆品，如白僵菌、云南无钩蝠蛾等作为菌或寄主时都有产生虫草伪品。可见，仅针对真菌或者虫体进行鉴定来判断冬虫夏草真伪是不够的，不能真正反映冬虫夏草这个复合体的真实性。虽发明名称为“一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重pcr检测方法”、申请号为cn201710284515.2专利公开了一种使用虫和菌的二重引物来鉴别冬虫夏草的真伪，但是其虫的特异性引物扩增条带淡，扩增效果稳定性较差。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鉴别冬虫夏草真伪的coi特异性引物对，能够更广范围内鉴别冬虫夏草的真伪；另外提供包含其的试剂盒、鉴别冬虫夏草真伪的pcr鉴别方法及其在鉴别鉴别冬虫夏草真伪中的用途。本发明鉴别别冬虫夏草真伪的方法，在广范围内鉴别冬虫夏草的真伪的同时，该方法扩增效果更明显、鉴别方法稳定可靠。

一方面，本发明提供一种鉴别冬虫夏草真伪的引物对，所述引物对为cc-2f/cc-2r，其序列如下：

cc-2f：5′-attaagtcgtggaaatg-3′；

cc-2r：5′-gatcaggaatagtggga-3′。

另一方面，本发明提供一种试剂盒，包括本发明所述的鉴别冬虫夏草真伪的引物对。

另一方面，本发明提供一种使用本发明所述的鉴别冬虫夏草真伪的引物对或本发明所述的试剂盒进行冬虫夏草真伪鉴别的方法。

在一些实施方案中，本发明所述的方法包括以下步骤：

(1)供试品dna提取液的制备；

(2)以步骤(1)中提取的dna为模板，使用cc-2f/cc-2r引物对进行pcr扩增反应，其中反应体系包括以下组分：primestarmaxpremix；cc-2f、cc-2r引物；供试品dna溶液；

(3)琼脂糖凝胶电泳分析：若供试品电泳结果与冬虫夏草对照品电泳结果在相应位置有相同的dna条带分布，则该供试品为冬虫夏草。

在一些实施方案中，本发明所述的方法包括以下步骤：

(1)供试品dna提取液的制备：取供试品粉末按照植物基因组dna抽提方法或者使用商业植物基因组dna提取试剂盒提取dna；

(2)以步骤(1)中提取的dna为模板，使用cc-2f/cc-2r引物对进行pcr扩增反应：

其中，pcr反应体系为：primestarmaxpremix10μl，10μm的cc-2f、cc-2r引物各1μl，50ng/μl的模板dna量为2μl，无菌双蒸水补足至20μl；

pcr反应参数为：98℃预变性1min；98℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸15s，35轮；最后72℃延伸5min；

(3)琼脂糖凝胶电泳分析：若供试品电泳结果与冬虫夏草对照品电泳结果显示在200～300bp之间出现相同的单一dna条带，则该供试品为冬虫夏草。

在一些实施方案中，本发明所述的方法步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳分析方法为：配制胶浓度2％，胶中加入核酸凝胶染色剂gelred；往供试品和对照品的pcr扩增产物中分别加入2μl10xloadingbuffer，混匀，上样量分别为5μl，dna分子量标记上样量为5μl(0.5μg/μl)；电压120v，时间30min；电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。

另一方面，本发明提供一种试剂盒，包括cc-2f/cc-2r引物对和dcf4/dcr4引物对，其中cc-2f/cc-2r引物对和dcf4/dcr4引物对的序列如下：

cc-2f：5′-attaagtcgtggaaatg-3′；

cc-2r：5′-gatcaggaatagtggga-3′；

dcf4：5′-agttaccactcccaaacc-3′；

dcr4：5′-tgcttgcttcttgactga-3′。

另一方面，本发明提供了一种进行冬虫夏草真伪鉴别的方法，其使用cc-2f/cc-2r引物对和dcf4/dcr4引物对进行冬虫夏草真伪鉴别，其中cc-2f/cc-2r引物对和dcf4/dcr4引物对的序列如下：

cc-2f：5′-attaagtcgtggaaatg-3′；

cc-2r：5′-gatcaggaatagtggga-3′；

dcf4：5′-agttaccactcccaaacc-3′；

dcr4：5′-tgcttgcttcttgactga-3′。

在一些实施方案中，本发明所述的方法包括以下步骤：

(1)供试品dna提取液的制备；

(2)以步骤(1)中提取的dna为模板，使用cc-2f/cc-2r引物对和dcf4/dcr4引物对进行pcr扩增反应；

(3)琼脂糖凝胶电泳分析：若供试品电泳结果与虫夏草对照品电泳结果在相应位置有相同的dna条带分布，则该供试品为冬虫夏草。

在一些实施方案中，本发明所述的方法步骤(2)中pcr扩增反应的反应体系中的dcf4/dcr4引物对和cc-2f/cc-2r引物对的摩尔比例为1:2-1:4。

在一些实施方案中，本发明所述的方法步骤(2)中pcr扩增反应的反应体系中的dcf4/dcr4引物对和cc-2f/cc-2r引物对的摩尔比例为1:4。

在一些实施方案中，本发明所述的方法步骤(2)中pcr扩增反应中反应体系还包括：2xpfumix。

在一些实施方案中，本发明所述的方法包括以下步骤：

(1)供试品dna提取液的制备；

(2)以步骤(1)中提取的dna为模板，使用cc-2f/cc-2r引物对和dcf4/dcr4引物对进行pcr扩增反应，其中反应体系中的酶为2xpfumix，反应体系中dcf4/dcr4引物对和cc-2f/cc-2r引物对的摩尔比例为1:2-1:4；

优选地，反应体系中的dcf4/dcr4引物对和cc-2f/cc-2r引物对的摩尔比例为1:4；

(3)琼脂糖凝胶电泳分析：若供试品电泳结果与冬虫夏草对照品电泳结果在相应位置有相同的dna条带分布，则该供试品为冬虫夏草。

在一些实施方案中，本发明所述的方法步骤(2)中pcr扩增反应中反应参数为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，35轮；最后72℃延伸5min。

在一些实施方案中，本发明所述的方法包括以下步骤：

(1)供试品dna提取液的制备：取供试品粉末按照植物基因组dna抽提方法或者使用商业植物基因组dna提取试剂盒提取dna；

(2)以步骤(1)中提取的dna为模板，使用cc-2f/cc-2r引物对和dcf4/dcr4引物对进行pcr扩增反应：

其中，pcr反应体系为：2xpfumix10μl，10μm的真菌its特异性引物dcf4/r4各0.25μl，10μm的寄主coi特异性引物cc-2f/cc-2r各1μl，36ng/μl的dna模板2μl，无菌双蒸水补足至20μl；

pcr反应参数为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，35轮；最后72℃延伸5min；

(3)琼脂糖凝胶电泳分析：若供试品电泳结果与冬虫夏草对照品电泳结果显示在100-200bp和200-300bp之间出现相同的二重dna条带，则该供试品为冬虫夏草。

在一些实施方案中，本发明所述的方法步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳分析为：配制胶浓度2％，胶中加入核酸凝胶染色剂gelred；供试品与对照品pcr扩增产物的上样量分别为5μl，dna分子量标记上样量为5μl(0.5μg/μl)。电压120v，时间30min，电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。

另一方面，本发明提供本发明所述的鉴别冬虫夏草真伪的引物对、本发明所述的试剂盒、或本发明所述的方法在鉴别冬虫夏草真伪中的用途。

本发明的有益效果为：

(1)本发明使用coi引物对cc-2f/cc-2r能够将冬虫夏草与亚香棒虫草、新疆虫草、凉山虫草、蝉花、戴氏虫草、虫草花、蛹虫草、地蝉、白草、百令胶囊、金水宝胶囊、中华被毛孢菌粉、蝙蝠蛾科被毛孢虫草菌粉这13种伪品区分，鉴别范围更广，特异性更强，且鉴别方法稳定可靠。

(2)本发明使用二重引物对cc-2f/cc-2r和dcf4/dcr4鉴别冬虫夏草，其鉴别范围广、扩增效果更明显、鉴别方法稳定可靠。

下列简写词的使用贯穿整个说明书：

μmμm/l，μmol/l，微摩尔/升，微摩尔每升

μl微升

ml毫升

ng/μl纳克/微升，纳克每微升

μg/μl微克/微升，微克每微升

℃摄氏度

minminute,minutes,分钟

s秒

附图说明

图1为实施例1引物对cc-2f/cc-2r鉴别冬虫夏草及伪品的冬虫夏草dna凝胶电泳图，其中csc1、csc2、csc3、csc4和csc5对应5批冬虫夏草供试品，每批各重复3次的标记为1、2、3，共15份供试品溶液；其余标记名称为；p：阳性对照品溶液；n：阴性对照溶液；m：dna分子量标记。

图2为实施例1引物对cc-2f/cc-2r鉴别冬虫夏草及伪品的dna凝胶电泳图，对应的标记名称为1：ls；2：ds；3：yxb；4：xj；5：bc；6：dc；7：ch；8：ycc；9：cch；10：bl；11：jsb；12：zh-1；13：zh-2；14：bfe；15：csc2；p：阳性对照品溶液；n：阴性对照溶液；m：dna分子量标记。

图3为实施例2二重鉴别引物对cc-2f/cc-2r和dcf4/dcr4鉴别冬虫夏草及伪品的冬虫夏草二重pcr扩增凝胶电泳图，对应的标记名称为：1：sc-1；2：sc-2；3：sc-3；4：sc-4；5：xz-1；6：xz-2；7：xz-3；8：xz-4；9：qh-1；10：qh-2；11：qh-3；12：qh-4；13：csc1；14：csc2；15：csc3；16：csc5；p：阳性对照溶液；n：阴性对照溶液；m：dna分子量标记。

图4为实施例2二重鉴别引物对cc-2f/cc-2r和dcf4/dcr4鉴别冬虫夏草及伪品的冬虫夏草伪品二重pcr扩增凝胶电泳图，对应的标记名称为：1：ls；2：ds；3：yxb；4：xj；5：dc；6：ch；7：ycc；8：cch；9：jsb；10：bc；p：阳性对照溶液；n：阴性对照溶液；m：dna分子量标记。

具体实施方式

以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。若未特别说明，以下实施例均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，如可参考《中国药典》2015年版中药材dna条形码分子鉴定方法指导原则中所述的技术操作规程。所用试剂或仪器未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

仪器与试剂

仪器

vortexgenie2涡旋振荡器(scientificindustries)；xs205du电子天平(梅特勒-托利多)；hws-12电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；5425离心机(eppendorf)；proflex3*32wellpcr仪(abi)；biometratadvanced96sg基因扩增仪(biometra)；nd-2000核酸蛋白仪(thermoscientific)；xgldted脉动真空灭菌器(山东新华医疗器械)；aqbdcubee迷你离心机(gencreachbiotechnologycorporation)；tanon3500凝胶成像系统(上海天能科技)；pj210c-bf微波炉(美的)。

试剂

高效植物基因组dna提取试剂盒(plantgenomicdnakit)(天根生化科技有限公司)；血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；dl2,000dnamarker和primemaxdnapolymerase(宝日医生物技术有限公司)；pcrmix和pfumix(广州东盛生物科技有限公司)；gelred^tmnucleicacidgel(stainbiotium公司)。

冬虫夏草对照药材(批号为121201-201103)购于中国食品药品检定研究院。

coi鉴别引物对

cc-2f：5′-attaagtcgtggaaatg-3′；

cc-2r：5′-gatcaggaatagtggga-3′。

二重鉴别引物对

coi鉴别引物对：cc-2f：5′-attaagtcgtggaaatg-3′；

cc-2r：5′-gatcaggaatagtggga-3′。

its鉴别引物对：dcf4：5′-agttaccactcccaaacc-3′；

dcr4：5′-tgcttgcttcttgactga-3′。

coi鉴别引物对cc-2f/cc-2r的合成：基于coi基因设计特异性引物，取冬虫夏草dna提取物，利用coi通用引物对hco2198/lco1490(hco2198：taaactttcagggtgaccaaaaaatca；lco1490：ggtcaacaaatcataaagatattgg进行pcr扩增反应，pcr产物由测序公司(广州艾基生物技术有限公司)测序；将测序得到的冬虫夏草基因组序列，通过blast数据库比对，获得并下载同源性高的基因序列，应用dnaman软件将测得的序列与下载的序列一同进行比对，找到变异位点比较多的片段，将该片段导入引物设计软件primerpremier5.0，对设计出的的多条特异性引物对进行筛选分析，得到cc-2f/cc-2r引物对为最佳引物对。

its鉴别引物对dcf4/dcr4的合成：参考文献中的合成，参考文献为：detectionofophiocordycepsisitscommonadulteratesusingspecies-specificprimers.yangliu,xiao-yuewang,zi-tonggao,jian-pinghanandlixiang.originalresearch.vol8.

供试品

供试品共42批，其中冬虫夏草17批，伪虫草25批，具体供试品信息见表1：

表1供试品信息表

实施例

实施例1引物对cc-2f/cc-2r鉴别冬虫夏草及伪品

1.1溶液制备

(1)供试品dna提取液的制备

取供试品粉末约30mg至2ml离心管中，严格按照天根植物基因组dna提取试剂盒说明书提取dna，提取物分装5μl/管，放置-20℃备用。供试品为冬虫夏草csc1、csc2、csc3、csc4和csc5各3份，以及冬虫夏草伪品ls、ds、yxb、xj、bc、dc、ch、ycc、cch、bl、jsb、zh-1、zh-2、bfe各1份。

(2)阳性对照品溶液的制备

取冬虫夏草对照药材约30mg至2ml离心管中，严格按照天根植物基因组dna提取试剂盒说明书提取dna，提取物分装5μl/管，放置-20℃备用。

(3)阴性对照溶液的制备

配制20μlpcr体系时，将模板量换为等量的灭菌双蒸水即可。

1.2pcr扩增反应

(1)pcr反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体积为20μl，反应体系包括primestarmaxpremix10μl，cc-2f、cc-2r引物(10μm)各1μl，模板dna量(浓度：50ng/μl)为2μl，无菌双蒸水补足至20μl。

(2)离心管置pcr仪中，pcr反应参数：98℃预变性1min；98℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸15s，35轮；最后72℃延伸5min。

1.3琼脂糖凝胶电泳分析

按照琼脂糖凝胶电泳法，配制胶浓度2％，胶中加入核酸凝胶染色剂gelred；供试品与对照品pcr扩增产物加入2μl10xloadingbuffer，混匀，上样量分别为5μl，dna分子量标记上样量为5μl(0.5μg/μl)。电压120v，时间30min。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。

具体琼脂糖凝胶电泳分析测定结果参见图1、图2。图1结果显示5批共15份冬虫夏草供试品溶液和阳性对照品溶液均在200～300bp之间出现相同的单一dna条带，图2显示14个伪品供试品溶液和阴性对照溶液在200～300bp之间未出现与阳性对照品溶液相同的dna目标条带，仅样品冬虫夏草csc2溶液在200～300bp之间出现与阳性对照品溶液相同的dna目标条带，说明该方法特异性强，检测范围广泛，且鉴别方法稳定可靠。

实施例2二重鉴别引物对cc-2f/cc-2r和dcf4/dcr4鉴别冬虫夏草及伪品

2.1溶液制备

(1)供试品dna提取液的制备

取供试品粉末约30mg至2ml离心管中，严格按照天根植物基因组dna提取试剂盒说明书提取dna，提取物分装5μl/管，放置-20℃备用。供试品为冬虫夏草csc1、csc2、csc3、csc5，野生冬虫夏草sc-1、sc-2、sc-3、sc-4、xz-1、xz-2、xz-3、xz-4、qh-1、qh-2、qh-3、qh-4，冬虫夏草伪品ls、ds、yxb、xj、dc、ch、ycc、cch、jsb、bc。

(2)阳性对照品溶液的制备

取冬虫夏草对照药材约30mg至2ml离心管中，严格按照天根植物基因组dna提取试剂盒说明书提取dna，提取物分装5μl/管，放置-20℃备用。

(3)阴性对照溶液的制备

配制20μlpcr体系时，将模板量换为等量的灭菌双蒸水即可。

2.2pcr扩增反应

(1)pcr反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体积为20μl，2xpfumix10μl，10μm/l的真菌its特异性引物dcf4/r4各0.25μl，10μm/l的寄主coi特异性引物cc-2f/cc-2r各1μl，dna模板2μl(浓度：36ng/μl)，ddh2o补足至20μl。

(2)离心管置pcr仪中，pcr反应参数：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，35轮；最后72℃延伸5min。

2.3琼脂糖凝胶电泳分析

按照琼脂糖凝胶电泳法，配制胶浓度2％，胶中加入核酸凝胶染色剂gelred；供试品与对照品pcr扩增产物的上样量分别为5μl，dna分子量标记上样量为5μl(0.5μg/μl)。电压120v，时间30min，电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。

具体琼脂糖凝胶电泳分析测定结果参见图3、图4。图3结果显示：湖北、四川、青海、西藏4个产地的16批冬虫夏草样品及阳性药材经过二重pcr扩增，在100-200bp和200-300bp之间各有一个条带，即出现二重条带，阴性对照溶液在相应位置不出现条带；图4结果显示：10种冬虫夏草伪品经过二重pcr扩增，在100-200bp和200-300bp不出现二重条带，仅阳性对照溶液在100-200bp和200-300bp之间各有一个条带，阴性对照溶液不出现条带。图3、图4结果说明该二重引物经过pcr扩增仅在模板为冬虫夏草真品时在100-200bp和200-300bp之间各有一个条带，且该二重条带亮度高、扩增效果更明显、鉴别方法稳定可靠，鉴别范围广泛。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

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<110>宜昌山城水都冬虫夏草有限公司,广东东阳光药业有限公司

<120>一种鉴别冬虫夏草真伪的引物对、试剂盒、方法及其用途

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