本发明涉及生物技术降解农药残留领域，特别是一种斯氏普罗威登斯菌固定化酶的制备方法及应用。
背景技术：
农药在农业病虫害综合治理中发挥着重要作用，但农药残留及其代谢产物已成为严重污染物，对人类健康和生态系统构成威胁。菌核净(dimetachlone)，又称纹枯利，分子式c10h7cl2no2，其相对分子质量244.07，化学名为：n-(3,5-二氯苯基)丁二酰亚胺。在我国广泛用于油菜、大白菜、紫菜苔、生菜、韭菜、黄瓜、番茄、辣椒、马铃薯、烟草等作物上菌核病、纹枯病、赤星病等真菌病害的防治。尽管菌核净的杀菌活力前景看好，但由于健康问题，目前在美国和欧洲被禁止使用，但在一些发展中国家仍然广泛使用(如中国)。此外，以往的研究表明0.4mmol/l的菌核净是大鼠急性肾毒性物质，且其对哺乳动物内分泌具有干扰作用，对人体肾脏也有毒害作用。综上所述，农业中菌核净的大量使用会产生菌核净的暴露，这对人体健康和环境安全构成潜在威胁，消除菌核净污染物的生态友好和低成本策略迫切需要建立。
在许多国家，包括立法、农业标准化、农民教育和修复技术等多种措施来解决菌核净残留问题，虽然这些措施有助于去除农药残留，但菌核净均不能有效地去除。生物修复(bioremediation)是一种利用活体微生物或来自微生物的酶对污染物进行解毒和降解，其具有操作简便、经济实用、环境友好等诸多优点的环境和经济有效的方法。然而，游离细胞和酶容易受到多种环境因素(如温度、酸碱度等)的影响，且其不稳定性、生产成本高和分离困难，这在很大程度上限制了实际应用。幸运的是，固定化技术提供了解决这些挑战的替代方案，并且已经成为提高微生物及酶稳定性、可操作性、耐久性和商业可行性的完美选择。迄今为止，尚无研究工作开展菌核净的生物降解。
技术实现要素：
本发明针对菌核净降解技术缺乏，旨在提供一种高效降解菌核净的持效性好、环境友好、效果显著和成本低廉的斯氏普罗威登斯菌固定化酶制备方法及其应用。
本发明的技术方案如下：
该斯氏普罗威登斯菌(providenciastuartii)菌株的保藏编号为cctccm2017738，为现有菌株。本发明的技术方案是以斯氏普罗威登斯菌providenciastuartii为菌种，以海藻酸钠和竹炭为固定化材料，将斯氏普罗威登斯菌有效地包埋而制成固定化酶。
其中，所述斯氏普罗威登斯菌固定化酶制备包括如下步骤：
1)菌悬液制备：无菌条件下加入2ml无菌磷酸盐缓冲液于培养48h的菌种培养皿中平行振荡，并用接种环轻轻刮落培养基表面的菌落，即成粗制菌悬液，将其转移到液体发酵培养基(牛肉膏8g/l、酵母膏14g/l、nacl5g/l)中在ph为7～8，35℃，150～200rpm条件下培养48h。将取出的发酵液立即在8000～10000r/min，3～4℃下离心10～15min，收集湿菌体，并用无菌磷酸盐缓冲液冲洗3次。然后将无菌磷酸盐缓冲液与湿菌体混匀，控制菌体数量为≥6×1010cfu/ml。制得的菌悬液3～4℃保存备用。
2)游离酶提取：对步骤1)制得的菌悬液进行超声破碎提取游离酶，超声破碎时间10～15min，功率320w，每10s一个周期(工作5s，间歇5s)。破碎液在8000～10000r/min，3～4℃下离心10～15min，得上清液即制得游离酶。上清液游离酶含量控制在大于等于2.80mg/ml。
3)固定化酶制备：将游离酶液按体积比为1:10(v/v)与3％海藻酸钠(sa)溶液充分混匀后，用注射器将混合液滴加入4％的氯化钙溶液中使用磁力搅拌器不断搅拌，在3～4℃凝胶化10～15h使之成为微球，微球直径大致为2～3mm，即为斯氏普罗威登斯菌固定化酶。
本发明制备的斯氏普罗威登斯菌固定化酶可应用于高效降解土壤、水体中的菌核净。固定化酶在土壤中推荐用量为100～200kg/ha，在水体中推荐用量为10～20mg/l。
进一步的，本发明制备的斯氏普罗威登斯菌固定化酶还可应用于高效降解土壤和水体中的烯菌酮和异菌脲。
本发明首次提供了一种高效降解菌核净的斯氏普罗威登斯菌固定化酶的制备方法及应用，具有持效性好、环境友好、效果显著和成本低廉等诸多优点。
附图说明
图1展示了不同固定材料对菌核净的降解效果；
图2展示了游离酶和固定化酶对菌核净的降解效果。
具体实施方式
下面通过实例对本发明进一步具体描述。下述方法中所涉及配料或材料，如无特殊说明，均为商业途径可获得。相关实验方法中如无特殊说明的均为本技术领域现有常规方法。其中的数值或数值比例，如无标注，均指质量数值或质量比例。
实施例1：
1.固定化载体的筛选：
前期试验表明，在1％、2％、3％、4％、5％的海藻酸钠(sa)固定悬浮游离酶中，3％sa表现出较好的效果；在1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％的聚乙二醇(pva)固定悬浮游离酶中，2.5％sa表现出较好的效果。进一步的，实验测定了游离酶、3％sa+游离酶、2.5％pva+游离酶、3％sa+2.5％pva+游离酶对50mg/l的菌核净的降解效果，结果见图1。
2.固定化酶制备：
1)菌悬液制备：无菌条件下加入2ml无菌磷酸盐缓冲液于培养48h的菌种培养皿中平行振荡，并用接种环轻轻刮落培养基表面的菌落，即成粗制菌悬液，将其转移到液体发酵培养基(牛肉膏8g/l、酵母膏14g/l、nacl5g/l)中在ph为7～8，35℃，150～200rpm条件下培养48h。将取出的发酵液立即在10000r/min，4℃下离心10min，收集湿菌体，并用无菌磷酸盐缓冲液冲洗3次。然后将无菌磷酸盐缓冲液与湿菌体混匀，控制菌体数量为≥6×1010cfu/ml。制得的菌悬液3～4℃保存备用。
2)游离酶提取：对步骤1)制得的菌悬液进行超声破碎提取游离酶，超声破碎时间15min，功率320w，每10s一个周期(工作5s，间歇5s)。破碎液在10000r/min，3～4℃下离心10min，得上清液即制得游离酶。上清液游离酶含量2.97mg/ml。
3)固定化酶制备：将游离酶液按体积比为1:10(v/v)与3％海藻酸钠(sa)溶液充分混匀后，用注射器将混合液滴加入4％的氯化钙溶液中使用磁力搅拌器不断搅拌，在3～4℃凝胶化15h使之成为微球，微球直径大致为2～3mm，即为斯氏普罗威登斯菌固定化酶。
3.田间试验：
试验区域喷洒有效成分为20.25kg/ha(比推荐高剂量高10倍)的40％菌核净可湿性粉剂，对照组用等量的水处理。在田间试验中，天气晴朗，有时多云，7d内无降雨。菌核净使用24h后，每个区域分别用游离酶20l/ha和固定化酶150kg/ha进行处理，对照组用等量的水处理，喷洒或撒施后进行土壤翻耕。每隔1、3、5、7、14和9d随机采集土壤样品(深0～15cm，1000g)。采用气相色谱法测定土壤中残留的菌核净。为了精确地显示降解趋势和效率，用校正的降解速率计算并显示这些值。
4.测定方法：
agilent6890n气相色谱仪，检测器：带μecd；色谱柱：hp-5石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；进样口温度：260℃；检测器温度：280℃；柱箱温度：程序升温方式，初始温度200℃，保持1min，以10℃/min升至270℃，载气为高纯氮气，流速1.2ml/min；分流比为10:1；进样量：1μl。在上述条件下，以菌核净标准溶液浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。线性方程为y＝991.37x+11.136，相关系数为：r2＝0.9998。
5.实施例效果：
图1所示，3％sa+游离酶对菌核净的降解效果比其它处理好，因此选用了3％sa作为菌株游离酶的固定化材料。
实验前，检测显示农药在土壤中的原始沉积量为16.24mg/kg。图2显示，游离酶在1d内对菌核净的降解效果较固定化酶好，这可能是游离酶快速接触菌核净的缘故。3d后，固定化酶对菌核净的降解效果均较游离酶好且降解率仍保持快速增长趋势，游离酶处理下降解率增长趋于平缓；表明固定化酶具有良好的持久性，解决了游离酶不稳定的缺陷。使用9天后，固定化酶对20.25kg/ha(比推荐高剂量高10倍)的40％菌核净可湿性粉剂降解率分别达98.56％，土壤菌核净残留量仅为0.126mg/kg，表明本发明提供的斯氏普罗威登斯菌固定化酶对菌核净具有高效的降解作用，且持效性较游离酶好。
当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。