本发明涉及生物质的预处理和酶水解技术，具体涉及一种利用添加β-葡萄糖苷酶提高乙酸双氧水预处理后杨木的酶水解效率的方法。
背景技术：
杨木是一种速生丰产树种，在中国有较大面积的种植，其生长速度快，资源丰富，纤维素含量高，因此，生物转化杨木制备生物能源与化学品具有较大潜力。预处理是提高杨木酶水解效率的重要步骤，杨木的预处理主要分为酸、碱、离子液体、蒸汽爆破等方法。
huang等人在2018，jwoodchemtechnol.38(5):371–384中用6.5％乙酸在172℃处理27分钟后，加入20fpu/g干物质纤维素酶，杨木的酶水解得率为51％。
kim等人在2017，biotechnolbiofuels.10:101中采用离子液体[c2c1im][oac]在160℃处理杨木3小时后，葡萄糖得率小于35％。
tiand等人在2017，biotechnolbiofuels.10:157中采用两步法预处理杨木，首先用0.7％硫酸在室温下浸泡过夜，然后在190℃下蒸汽爆破10分钟，在纤维素酶添加量高达32mg/g干物质下，杨木的葡萄糖得率仅为70％。
孟鑫论文中(《绿液预处理对杨木木质素及酶水解的影响》南京林业大学，2014)研究表明，绿液预处理杨木后，纤维素酶用量为40fpu/g时，葡萄糖只有89.9％。
由此可见，上述方法均存在着原料水解不彻底或者酶剂量大的问题。
乙酸双氧水预处理相对其他预处理方法而言，其对原料的木质素脱除效果显著，可减少木质素对酶的空间阻碍作用及对酶的无效吸附，在提高酶水解效率方面有一定应用前景。
wi等人在2015，biotechnolbiofuels.8:228中对稻杆、松木、橡木进行了乙酸双氧水预处理后发现原料的木质素含量均小于6％，原料经同步发酵其葡萄糖转化率为85.0％。
luo等人在2018，biomassconvbioref.(https://doi.org/10.1007/s13399-018-0364-0)中采用乙酸双氧水预处理杨木后，在纤维素酶剂量为20mg/g纤维素的条件下，葡萄糖得率小于80.0％。
这也就表明乙酸双氧水处理杨木后仍存在纤维素酶使用量大、酶水解效率低的问题，与预期杨木酶水解效果具有一定的差距，但其中原因目前尚不明确。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决现有杨木水解过程中所存在的纤维素酶使用量大和酶水解效率低的不足之处，而提供了一种提高乙酸双氧水预处理杨木酶水解效率的方法。
本发明的发明构思为：
基于现有技术，无法获知被看好应用前景的乙酸双氧水预处理杨木后为何仍存在纤维素酶使用量大、酶水解效率低的问题，发明人对此进行了深入的研究，最终发现乙酸双氧水预处理杨木后，在酶水解过程中会存在一定量纤维二糖的积累，从而抑制纤维素酶的水解能力，导致以上问题。因此，发明人考虑在酶水解过程中额外添加β-葡萄糖苷酶，利用其对纤维二糖较强的水解能力，可以有效的降解纤维二糖，缓解纤维二糖抑制效果，进而提高酶水解效率。
为实现上述目的，本发明所提供的技术解决方案是：
一种提高杨木酶水解效率的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
步骤1)预处理
采用乙酸双氧水对原料进行预处理；
步骤2)酶水解
采用纤维素酶对预处理后的原料进行酶水解反应；该酶水解反应体系中还额外添加了β-葡萄糖苷酶。
进一步地，为了使预处理的效果更好，步骤1)的具体步骤为：
1.1)将纯度为99％的乙酸和纯度为30％的双氧水混合，配制成体积浓度为80％～100％的乙酸双氧水溶液；
1.2)将原料与所述乙酸双氧水溶液按照料液比1:10进行混合，并在60℃～80℃下预处理2小时；
1.3)预处理后冷却，进行固液分离，收集滤渣，并水洗至中性。
进一步地，所述1.1)中，还加入了催化量的硫酸；所述硫酸的摩尔浓度为100mmol/l。
进一步地，步骤2)的具体步骤为：
2.1)将步骤1)预处理后的原料置于反应瓶中，向反应瓶内加入ph等于5.0的柠檬酸钠缓冲液，使原料的质量浓度为2％；
2.2)向步骤2.1)所得溶液中加入纤维素酶和β-葡萄糖苷酶进行酶水解反应；摇匀置于恒温摇床中，50℃下水解72小时；
其中，每克干物质添加的酶剂量为20fpu纤维素酶和500nkat～1000nkat的β-葡萄糖苷酶。
进一步地，所述纤维素酶为赛力二代酶(cellicctec2)，该酶市场购买方便，且产品性能较好。
进一步地，为了减少乙酸双氧水预处理过程中木聚糖的组分损失，所述步骤1)中使用的原料为经乙酸预处理后的杨木滤渣；所述乙酸预处理是指在杨木中加入纯度为5％的乙酸，并在170℃下处理30min，可以降解杨木中的木聚糖从而制备低聚木糖，提高原料的组分利用效率。
进一步地，步骤3)后处理
水解完成后，采用沸水浴加热步骤2)所得溶液约10分钟，使酶失活，冷却至室温后，离心得上清液。
本发明的优点是：
1.本发明工艺简单、绿色环保，首先利用乙酸双氧水预处理的优势对原料进行预处理，减少木质素对酶的空间阻碍作用及对酶的无效吸附；其次，在酶水解反应体系中额外添加了β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶水解能力稳定，可减少酶水解过程中纤维二糖的抑制，使得每克干物质在20fpu纤维素酶的作用下可以几乎完全水解，大大提高了杨木酶水解效率，同时也减少了纤维素酶的使用量，降低水解用料成本，具有较好的应用前景。
2.本发明乙酸双氧水预处理的原料为经乙酸预处理后的杨木滤渣，即在乙酸双氧水预处理之前先进行乙酸预处理，来制备低聚木糖，此种方式可提高原料中木聚糖组分的利用效率。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述：
实施例一
一种提高杨木酶水解效率的方法，包括以下步骤：
步骤1)预处理
1.1)量取60ml纯度99％的乙酸和60ml纯度30％的双氧水混合，加入催化量的100mmol/l的硫酸后，混匀制备成乙酸双氧水预处理溶液；
1.2)称取乙酸预处理后的绝干杨木残渣10克置于聚四氟乙烯内衬钢瓶中，按照料液比1:10的比例加入体积浓度100％的乙酸双氧水溶液，在60℃～80℃条件下预处理2小时；上述乙酸预处理是指在杨木中加入纯度为5％的乙酸，并在170℃下处理30min；
1.3)预处理结束后冷却，利用离心机进行固液分离，收集滤渣，并水洗至中性用于生物酶水解；
步骤2)酶水解
2.1)称取1克预处理后的原料至于锥形瓶中，向锥形瓶内加入ph等于5.0的柠檬酸钠缓冲液，使原料的质量浓度为2％；
2.2)向步骤2.1)所得溶液中加入20fpu纤维素酶和500nkatβ-葡萄糖苷酶，摇匀置于恒温摇床中，50℃下水解72小时；上述纤维素酶可采用赛力二代酶(cellicctec2)；
步骤3)后处理
水解完成后，采用沸水浴煮沸步骤2)所得溶液10分钟，使酶失活；冷却至室温后，离心得上清液；
采用高效液相色谱检测上清液中的单糖，根据下述公式计算预处理原料单糖水解率：
公式底物中的纤维素和木聚糖含量依据美国国家可再生能源实验室方法测定；
若水解时仅加入20fpu纤维素酶，计算得未经任何预处理杨木的葡萄糖得率11.4％，木糖得率8.8％；经乙酸预处理后，计算得葡萄糖得率20.0％，木糖得率27.7％；经乙酸和乙酸双氧水预处理后，计算得葡萄糖得率为79.2％，木糖得率为98.9％。而每克底物额外添加500nkat的β-葡萄糖苷酶后，经乙酸和乙酸双氧水预处理杨木的葡萄糖得率提高到91.9％，木糖得率为99.0％。
实施例二
预处理方法和反应条件与实施例一基本相同，区别之处在于乙酸双氧水预处理中乙酸双氧水溶液的体积浓度为80％；若水解时仅加入20fpu纤维素酶，计算得葡萄糖得率为67.2％，木糖得率为72.4％。而每克底物额外添加500nkat的β-葡萄糖苷酶后，酶水解的葡萄糖得率提高到91.1％，木糖得率提高到94.9％。
实施例三
预处理方法和反应条件与实施例一基本相同，区别之处在于酶水解过程中，每克底物添加1000nkat的β-葡萄糖苷酶，最终葡萄糖得率为97.5％，木糖得率为99.7％。
实施例四
预处理方法和反应条件与实施例二基本相同，区别之处在于酶水解过程中，每克底物添加1000nkat的β-葡萄糖苷酶，最终酶水解葡萄糖得率为99.4％，木糖得率为100.0％。
实施例五
反应条件与实施例一基本相同，区别之处在于使用乙酸双氧水进行预处理原料之前并未经过乙酸预处理，而是直接称取绝干的杨木10克置于聚四氟乙烯内衬钢瓶中，使用乙酸双氧水溶液进行预处理；最终葡萄糖得率为85.3％，木糖得率为82.4％。而每克底物额外添加500nkat的β-葡萄糖苷酶后，葡萄糖得率提高到87.9％，木糖得率为94.4％。
实施例六
预处理方法和反应条件与实施例五基本相同，区别之处在于酶水解过程中，每克底物添加1000nkat的β-葡萄糖苷酶，最终酶水解葡萄糖得率为98.8％，木糖得率为99.1％。
由此，可以看出针对杨木，在乙酸双氧水预处理前先进行乙酸预处理，且乙酸双氧水预处理中乙酸双氧水溶液的体积浓度为80％，每克底物添加20fpu的纤维素酶和1000nkat的β-葡萄糖苷酶时，水解效率更高。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。