一种基于RPA-侧流层析技术检测丁香疫霉的引物和探针组合及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及基于rpa-侧流层析技术检测丁香疫霉，专用于海关进出境大豆所带丁香疫霉(phytophthorasojae)的高灵敏度快速检测，同时可用于田间大豆疫病的早期诊断和病菌的监测。

背景技术：

丁香疫霉(phytophthorasyringae)是我国重要的植物检疫性病原菌，主要寄主包括柑桔、苹果、桃、梨、丁香、橡树等14个科29个属植物，可引起寄主根、茎、叶、果实多种病害。病菌可侵染柑橘引起果实褐腐、枝干流胶、根颈部脚腐和根腐，影响果实产量和品质，带来重大经济损失，严重威胁世界柑橘生产。其分布范围遍及世界各大柑橘产区，但尚未在我国发现。

传统的检测丁香疫霉的方法费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，基于pcr的方法已经成功用于检测丁香疫霉，虽然pcr法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h,同时pcr方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

重组酶介导等温扩增(recombinasepolymeraseamlification，rpa)技术被公认是可以替代pcr的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，rpa技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的pcr技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于rpa技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。rpa技术的最大特点是只需要1对引物即可在37℃左右的恒温条件下实现模板核酸的扩增，不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备。而且37℃的常规反应温度很容易满足，适合基层对病原菌的快速检测。目前，rpa技术已经广泛应用于人体、动物或植物上的病毒检测，但在植物病原卵菌的检测方面，尤其是对于检疫性丁香疫霉的rpa检测，未见相关应用报道。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于rpa-侧流层析技术检测丁香疫霉的方法，以建立丁香疫霉的快速检测新方法。提供适用于所述检测方法的检测专用引物，以及含有该专用引物的试剂盒，是本发明的另一发明目的。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一方面，本发明提供了一种基于rpa-侧流层析技术检测丁香疫霉的引物和探针组合，所述引物序列为：正向引物为rpa-psyypt-f：5'-tctgctagcagactgctgactgttctatct-3'(seqidno:1)；反向引物为rpa-psyypt-r：5’-aaatatgaatatcagcagcatgctctacag-3’(seqidno:2)；所述探针序列psyypt-p：5’-tgtacgtaccaggagcttattttttcaccctgtaagggtggattggt-3’(seqidno:3)。优选地，所述反向引物rpa-psyypt-r的5’端添加有biotin，所述探针psyypt-p的5’端添加有fam，3’端添加有c3-spacer。

另一方面，本发明提供了一种基于rpa-侧流层析技术检测丁香疫霉的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本dna；

2)以dna为模板，进行rpa扩增；其中，正向引物为rpa-psyypt-f：5'-tctgctagcagactgctgactgttctatct-3'(seqidno:1)；反向引物为rpa-psyypt-r：5’-aaatatgaatatcagcagcatgctctacag-3’(seqidno:2)；探针序列psyypt-p：5’-tgtacgtaccaggagcttattttttcaccctgtaagggtggattggt-3’(seqidno:3)；且所述反向引物rpa-psyypt-r的5’端添加有biotin，所述探针psyypt-p的5’端添加有fam，3’端添加有c3-spacer；

3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香疫霉。

进一步地，所述步骤2)中rpa扩增：向装有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应单元管(twistampbasickits，twist)中加入缓冲液buffer29.5μl，10μm的上游引物2.1μl，10μm的下游引物2.1μl，探针0.6μl，dna2.0μl，mgac2.5μl加在pcr管盖内部，去离子水补足至50μl；将rpa扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4分钟，将反应管再次混匀，离心3-5s，放入水浴锅39℃继续反应30min。

另一方面，本发明还提供了一种基于rpa-侧流层析技术检测丁香疫霉的试剂盒，至少包括1次用量以上的所述的引物和探针组合试剂。

进一步地，所述引物终浓度为0.42μmol/l，所述探针的终浓度为0.12μmol/l。

进一步地，所述试剂盒还还包括：标准阳性dna、缓冲液、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试剂。

进一步地，所述的基于rpa-侧流层析技术检测丁香疫霉的试剂盒，每50μl扩增体系中含有检测干粉的twistamp反应单元管、缓冲液29.5μl、丁香疫霉rpa相应的引物探针液4.7μl、无菌双蒸水11.2μl、待测样本dna为阳性对照分别为2μl或以无菌双蒸水为空白对照2μl、反应驱动液2.5μl。

进一步地，所述试剂盒，每50μl扩增体系中含有缓冲液buffer29.5μl，10μm的上游引物2.1μl，10μm的下游引物2.1μl，探针0.6μl，dna2.0μl，mgac2.5μl。

进一步地，所述rpa侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液(1×pbs+0.1％tween20)。所述无菌双蒸水可作为阴性对照或补足反应体系用，其制备方法为双蒸水经高压灭菌后，分装到灭菌的小管中。所述的缓冲液buffer、rpa核酸扩增试剂检测干粉的反应单元管、mgac于市场购买得到。

另一方面，本发明还提供了所述的引物和探针组合或权利要求5-6任一所述的试剂盒在检测丁香疫霉中的应用。

进一步地，所述引物组和探针可被用于生产实践中发病组织及土壤中丁香疫霉的快速可靠的检测鉴定。当用于发病组织中存在丁香疫霉时，采用naoh快速裂解法提取丁香疫霉的dna，具体过程如下：取一段发病的组织样品，每毫克组织加入10μl0.5mnaoh，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的ep管中，12000rpm离心5min，取5μl上清液加入495μl0.1mmtris(ph8.0)，混匀后取1μl直接用于rpa反应。每个反应至少重复三次。

ypt1基因是一个ras相关的基因，其在酵母中编码一个与ras相关的gtp结合蛋白。ypt1基因包含有多个内含子，其保守序列和进化区域相互间隔，适合作为疫霉菌分子检测的靶标。本发明首先针对丁香疫霉的ypt1基因作为靶标序列，采用primerpremier5.0软件设计了一系列的rpa引物，并通过实验对所设计的引物进行优化筛选，获得了一组用于rpa检测樱桃灰霉病菌的专用引物和探针。与常规pcr反应不同，rpa反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对rpa的结果至关重要。rpa技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)本发明系首次采用rpa-侧流层析技术建立快速检测丁香疫霉的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于实际样品的检测，为丁香疫霉的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。本发明选用的ypt1基因引物是经大量实验筛选获得的，特异性好，与其它病原菌无交叉反应。本发明所使用的引物探针扩增效果良好，条带特异性强，能够在检测区形成较高浓度的引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现强阳性反应，增加检测的灵敏度，本发明所建立检测方法可检测100pg的丁香疫霉基因组。

2)本发明的rpa技术并结合侧流层析技术检测丁香疫霉的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和检疫现场的丁香疫霉快速筛查检测。同时，本发明检测方法用于丁香疫霉的发病前期检测与病害的预测预报，对于确定防治适期、有效防治病害具有十分重要的意义。

3)本发明的检测方法与常规pcr相比，检测速度快，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，rpa反应的最适温度在37℃-40℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。实现了恒温扩增，不像pcr法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源rpa反应就可以发生，极大的扩展了rpa使用的范围，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

4)本发明可以用于带菌植株组织中丁香疫霉的快速检测，只需约2h即可完成检测过程，是一种检测丁香疫霉的有效手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是rpa灵敏性的侧流层析试纸条在不同疫霉种间的特异性检测结果图；图中，1：丁香疫霉(phytophthorasyringae)；2：冬生疫霉(p.hibernalis)；3：寄生疫霉(p.parasitica)；4：致病疫霉(p.infestans)；5：木香疫霉(p.tentaculata)；6：草莓疫霉(p.fragariae)；7：苎麻疫霉(p.boehmeriae)；8：阴性对照。

图2是rpa灵敏性的侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图；图中，1：丁香疫霉(phytophthorasyringae)；2：终极腐霉(pythiumultimum)；3：木贼镰孢菌(fusariumequiseti)；4：平头炭疽菌(colletotrichumtruncatum)；5：大丽轮枝菌(verticiliumdahliae)；6：立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)；7：稻瘟病菌(magnaporthegrisea)；8：阴性对照。

图3是rpa侧流层析试纸条检测方法的灵敏度试验结果图。

图4是常规pcr检测方法的灵敏度试验结果图。

图5是人工接种丁香疫霉进行样品检测结果图；其中1-5：人工接种丁香疫霉的柑橘样品rpa检测结果；6：健康柑橘rpa检测结果；7：阴性对照。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

提取供试病原菌菌株的基因组dna，具体提取过程如下：

取少量菌丝粉，加900μl2％ctab提取液和90μl10％sds，漩涡混匀，于60℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清液加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清液转移至新管中，加入等体积的氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。取上清液转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mnaac(ph5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm离心10min，倾去上清液，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或te(ph8.0)溶解沉淀(含20μgml^-1rnase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。对于土壤中dna的提取，首先将每个土样晾干碾碎，然后分别称取0.5g土样作为提取样品，采用spin试剂盒(q-biogeneltd，usa)进行dna的提取。土壤dna提取的具体步骤参见试剂盒说明书。

实施例2

rpa引物长度一般为30至35个核苷酸，引物过短会严重影响重组酶的活性，长引物并不一定能提高扩增性能，反而会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的噪音。此外，引物设计时应尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成，扩增产物大小不超过500bp。依据上述引物设计原则，本发明根据丁香疫霉的ypt1序列(kj755159.1)，使用primerpremier5.0设计了正向引物序列rpa-psyypt-f，反向引物序列rpa-psyypt-r，探针序列psyypt-p。

具体序列如下：正向引物为rpa-psyypt-f：5'-tctgctagcagactgctgactgttctatct-3'；反向引物为rpa-psyypt-r：5’-aaatatgaatatcagcagcatgctctacag-3’；探针序列psyypt-p：5’-tgtacgtaccaggagcttattttttcaccctgtaagggtggattggt-3’。所述反向引物rpa-psyypt-r的5’端添加有biotin，所述探针psyypt-p的5’端添加有fam，3’端添加有c3-spacer。

以提取的dna为模板，采用设计的rpa引物，在下述反应体系中进行rpa反应：向装有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应单元管(twistampbasickits，twist)中加入缓冲液buffer29.5μl，10μm的上游引物2.1μl，10μm的下游引物2.1μl，探针0.6μl，dna2.0μl，mgac2.5μl加在pcr管盖内部，去离子水补足至50μl；将rpa扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4分钟，将反应管再次混匀，离心3-5s，放入水浴锅39℃继续反应30min。同时，阴性对照：操作步骤同样品检测，将2.0μl模板dna改为加入2.0μl灭菌ddh2o。

rpa反应结束后，应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香疫霉。

实施例3

为了验证rpa侧流层析试纸条检测方法的特异性，以1株丁香疫霉菌株和其它卵菌以及病原真菌为供试材料(表1)，rpa侧流层析试纸条检测方法的结果显示1株丁香疫霉的试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，其余卵菌以及病原真菌的试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香疫霉。选择与丁香疫霉不同种(冬生疫霉；寄生疫霉；致病疫霉；木香疫霉；草莓疫霉；苎麻疫霉等)和不同属的菌(平头炭疽菌；茄镰刀菌；稻瘟病菌；立枯丝核菌；大丽轮枝菌；终极腐霉)的dna作为模板，进行rpa-侧流层析试纸条检测。

表1用于检测丁香疫霉特异性的真菌和卵菌菌株

按照实施例1-2的方法进行检测，结果如图1和图2所示。图1是rpa-侧流层析试纸条在不同疫霉种间的特异性检测结果，1：丁香疫霉(phytophthorasyringae)；2：冬生疫霉(p.hibernalis)；3：寄生疫霉(p.parasitica)；4：致病疫霉(p.infestans)；5：木香疫霉(p.tentaculata)；6：草莓疫霉(p.fragariae)；7：苎麻疫霉(p.boehmeriae)；8：阴性对照；试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香疫霉；图中显示第1条显2条带，呈阳性；其余1条带，呈阴性。

图2是rpa-侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图，图中，1：丁香疫霉(p.sojae)；2：终极腐霉(pythiumultimum)；3：木贼镰孢菌(fusariumequiseti)；4：平头炭疽菌(colletotrichumtruncatum)；5：大丽轮枝菌(verticiliumdahliae)；6：立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)；7：稻瘟病菌(magnaporthegrisea)；8：阴性对照；试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香疫霉；图中显示第9条显2条带，呈阳性；其余1条带，呈阴性。

可见，以本发明设计的引物进行rpa扩增反应后，侧流层析试纸条结果显示2条棕色条带(图1，图2)，目标条带清析，能有效检测出丁香疫霉。而其它真菌和卵菌只有在质控区出现一条棕色条带，阴性对照也只有在质控区出现一条棕色条带。

实施例4

使用nanodro2000微量分光光度计测定出实施例1提取dna的浓度为100ng·μl^-1，其依次稀释为100pg·μl^-1、10pg·μl^-1、1pg·μl^-1和100fg·μl^-1，根据实施例2采用的引物、反应体系和反应条件，对不同浓度的dna进行rpa和pcr检测。

结果如图3所示，25μl的反应体系中分别含有100ng·μl^-1、10ng·μl^-1、1ng·μl^-1、100pg·μl^-1丁香疫霉dna的试纸条出现两条棕色条带，呈阳性反应，25μl的反应体系中分别含有10pg·μl^-1、1pg·μl^-1、100fg·μl^-1丁香疫霉dna的纸条出现一条棕色条带，呈阴性反应；显色结果表明rpa-侧流层析试纸条的灵敏度达到100pg·μl^-1；用同样浓度的丁香疫霉菌的标准菌株的基因组dna作为扩增模板，进行pcr扩增反应，比较两种方法的灵敏度；重复实验3次，以确定pcr法检测丁香疫霉菌基因组dna的灵敏度；3次重复实验的结果一致。在基因组dna浓度为1ng·μl^-1时，pcr检测能够检测出特异性条带，证明发生特异性扩增，检测结果判为阳性。

利用常规pcr方法(引物为rpa-psyypt-f、rpa-psyypt-r)进行检测，结果如图4所示，在基因组dna浓度为100pg·μl^-1时，pcr产物经检测没有发现特异性条带，证明没有发生特异性扩增，检测结果判为阴性，即pcr法检测丁香疫霉菌基因组dna的灵敏度为1ng·μl^-1。由此可见，rpa侧流层析试纸条检测方法的灵敏度要比pcr方法高出10倍。

结果表明rpa检测浓度为10pg·μl^-1，而pcr检测浓度为1ng·μl^-1时仍能看到目标条带，说明rpa检测的灵敏度高于pcr。但pcr检测过程需要2.5h，而rpa检测时间仅需30min，且不需要pcr仪等昂贵的仪器设备，操作程序简便，更有利在生产中推广应用。

实施例5

本实施例从人工接种柑橘进行实际样品实验检测。首先采用上述实施例1的方法提取发病大豆和健康大豆中的病原菌dna。采用上述实施例2设计的引物对提取的病原菌dna进行rpa反应，并应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香疫霉。结果见图5所示，其中1-5：人工接种丁香疫霉的柑橘样品rpa检测结果；6：健康柑橘rpa检测结果；7：阴性对照。可见，健康没有扩增出条带，再次证明了rpa侧流层析试纸条检测方法检测结果准确可靠，有很强的实用性。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110>南京林业大学

<120>一种基于rpa-侧流层析技术检测丁香疫霉的引物和探针组合及其应用

<130>2019

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tctgctagcagactgctgactgttctatct30

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaatatgaatatcagcagcatgctctacag30

<210>3

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgtacgtaccaggagcttattttttcaccctgtaagggtggattggt47