一种基于RPA-侧流层析技术检测茄腐镰孢菌的引物和探针组合及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于rpa-侧流层析技术检测茄腐镰孢菌的方法，以及专用引物及探针组合。

背景技术：

茄腐镰孢菌(fusariumsolani)侵染苗木引起的松苗立枯病是一种危害苗木的重要病害，严重时能够导致80％幼苗死亡，严重影响了苗木种植户的经济效益。茄腐镰孢菌(f.solani)在pda培养基上25℃培养4d菌落直径为25-46mm，7d菌落直径65-70mm。气生菌丝羊绒状，白色至浅灰色，大多数菌株不产生色素而呈奶油色，少数菌株菌落背面可产生紫色色素。产生大量假头生的小型分生孢子，椭圆形、卵形或肾形，比较宽，0-1分隔，8-15μm×2.5-4.5μm。大型孢子最宽处在中线上部，两端较钝，顶细胞稍弯，基细胞足跟明显或钝圆形，整个孢形态较短较胖，称为马特型。2-6分隔，多为3隔，25-55μm×4-6μm。在气生菌丝上长出的产孢细胞为长筒形的单瓶梗。易产生蓝绿色粘孢团型分生孢子座。易产生球形，单生、对生或串生，直径5-10μm的厚垣孢子。

为了阻止茄腐镰孢菌传播范围的不断扩大，使茄腐镰孢菌根腐病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。茄腐镰孢菌的传统检测方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和初发期作出诊断；从土壤中分离病原菌可能会同时得到多种病原菌和非病原菌，鉴定病原菌难度较大，而且采用传统检测方法难以估测病原菌量，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制，所以传统的检测方法逐步被分子检测技术所取代。近年来，已经开发了许多检测致病真菌的分子方法。dna探针检测技术很早就被用于研究和开发的植物病原真菌检测。在中国，这项技术也被用于真菌病原体的检测。然而，在实际应用方面，因为核酸探针的制备相对困难，这种技术操作复杂，杂交和标本处理成本昂贵并且耗时。此外，可重复性差，以及可能造成的假阳性或假阴性，都是这项技术可能存在的一些问题。在pcr技术出现以来，已经被证明是一种快速、准确、灵敏、操作简单的检测技术，且被广泛应用于检测植物病原真菌，真菌识别，和系统发育研究等领域。实时定量pcr是美国应用生物系统公司1996年开发的，就有快速、灵敏、准确、定量、可重复性强等优点。这项技术已经成为分子生物学的一个重要工具。然而，考虑到实用性，检测致病真菌需要快速，操作简单，尽可能降低成本，尽量不依赖于昂贵的设备。需要可以在农场或基层这些设备相对落后的单位推广使用。重组酶介导等温扩增(recombinasepolymeraseamlification，rpa)技术被公认是可以替代pcr的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，rpa技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的pcr技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于rpa技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。rpa技术的最大特点是只需要1对引物即可在37℃左右的恒温条件下实现模板核酸的扩增，不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备。而且37℃的常规反应温度很容易满足，适合基层对病原菌的快速检测。目前，rpa技术已经广泛应用于人体、动物或植物上的病毒检测，但在植物病原卵菌的检测方面，尤其是对于茄腐镰孢菌的rpa检测，未见相关应用报道。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于rpa-侧流层析试纸条技术检测茄腐镰孢菌的方法，以建立茄腐镰孢菌的快速检测新方法。提供适用于所述检测方法的检测专用引物，以及含有该专用引物的试剂盒，是本发明的另一发明目的。本发明系首次采用rpa-侧流层析技术建立快速检测茄腐镰孢菌的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于实际样品的检测，为茄腐镰孢菌的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一方面，本发明提供了一种基于rpa-侧流层析技术检测茄腐镰孢菌(f.solani)的引物和探针组合，所述引物序列为：正向引物rpa-fsrpa-f:5’-acaaagccctgatccctgcacacaaaaaacacca-3’(seqidno:1)；反向引物rpa-fsrpa-r:5’-catagtagcggggagtctcgaacttccagagggc-3’(seqidno:2)；所述探针序列为：fsrpa-p:5’-cgactcaacaataggaagccgctgagctcgcaagggttccttcaa-3’(seqidno:3)。优选地，所述反向引物rpa-psyypt-r的5’端添加有biotin，所述探针psyypt-p的5’端添加有fam，3’端添加有c3-spacer。

另一方面，本发明提供了一种基于rpa-侧流层析技术检测茄腐镰孢菌(fusariumsolani)的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本dna；

2)以dna为模板，进行rpa扩增；其中，正向引物为rpa-fsrpa-f：5'-acaaagccctgatccctgcacacaaaaaacacca-3'(seqidno:1)；反向引物为rpa-fsrpa-r：5'-catagtagcggggagtctcgaacttccagagggc-3’(seqidno:2)；探针为fsrpa-p：5’-cgactcaacaataggaagccgctgagctcgcaagggttccttcaa-3’(seqidno:3)；同时，所述反向引物rpa-psyypt-r的5’端添加有biotin，所述探针psyypt-p的5’端添加有fam，3’端添加有c3-spacer；

3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有茄腐镰孢菌(f.solani)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有茄腐镰孢菌(f.solani)。

进一步地，所述步骤2)中rpa扩增：向装有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应单元管(twistampbasickits，twist)中加入缓冲液buffer29.5μl，10μm的上游引物2.1μl，10μm的下游引物2.1μl，探针0.6μl，dna2.0μl，mgac2.5μl加在pcr管盖内部，去离子水补足至50μl；将rpa扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4分钟，将反应管再次混匀，离心3-5s，放入水浴锅39℃继续反应30min。

另一方面，本发明还提供了一种基于rpa-侧流层析技术检测茄腐镰孢菌(f.solani)的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量以上的权利要求1所述的引物和探针组合。

进一步地，所述引物的终浓度为0.42μmol/l，所述探针的终浓度为0.12μmol/l。

进一步地，所示试剂盒还包括：标准阳性dna、缓冲液、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试剂。

进一步地，其中所述rpa侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液(1×pbs+0.1％tween20)。所述无菌双蒸水可作为阴性对照或补足反应体系用，其制备方法为双蒸水经高压灭菌后，分装到灭菌的小管中。

进一步地，所述的缓冲液buffer、rpa核酸扩增试剂检测干粉的反应单元管、mgac于市场购买得到。

另一方面，本发明还提供了所述的引物和探针组合在检测茄腐镰孢菌(f.solani)中的应用。

进一步地，该引物组和探针可被用于生产实践中发病组织及土壤中茄腐镰孢菌的快速可靠的检测鉴定。当发病组织中存在茄腐镰孢菌时，采用naoh快速裂解法提取茄腐镰孢菌的dna，具体过程如下：取一段发病的组织样品，每毫克组织加入10μl0.5mnaoh，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的ep管中，12000rpm离心5min，取5μl上清液加入495μl0.1mmtris(ph8.0)，混匀后取1μl直接用于rpa反应。每个反应至少重复三次。

本发明检测目的序列为茄腐镰孢菌的翻译延伸因子(tef-1α)序列，该序列在茄腐镰孢菌孢中的基因组中非常保守，利用bioedit软件将茄腐镰孢菌的tef-1α序列和其他镰孢菌的tef-1α序列进行比较，选取茄腐镰孢菌特有的一段tef-1α序列设计特异性引物，并通过实验对所设计的引物进行优化筛选，获得了一对用于rpa检测茄腐镰孢菌菌的专用引物和探针。与常规pcr反应不同，rpa反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对rpa的结果至关重要。rpa技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)本发明选用的tef-1α基因引物是经大量实验筛选获得的，特异性好，与其它病原菌无交叉反应。本发明所使用的引物探针扩增效果良好，条带特异性强，能够在检测区形成较高浓度的引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现强阳性反应，增加检测的灵敏度，本发明所建立检测方法可检测100pg的茄腐镰孢菌基因组。

2)本发明的rpa技术并结合侧流层析技术检测茄腐镰孢菌的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和检疫现场的茄腐镰孢菌快速筛查检测。

3)本发明的方法与常规pcr相比，检测速度快，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，rpa反应的最适温度在37℃-40℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测。实现了恒温扩增，不像pcr法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源rpa反应就可以发生，极大的扩展了rpa使用的范围，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

4)本发明可以用于带菌植株组织中茄腐镰孢菌的快速检测，只需约2h即可完成检测过程，是一种检测茄腐镰孢菌的有效手段。本发明检测方法还可用于茄腐镰孢菌的发病前期检测与病害的预测预报，对于确定防治适期、有效防治病害具有十分重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为rpa灵敏性的侧流层析试纸条特异性检测结果图；图中，1：茄腐镰孢菌株(分离自松苗根部)；2：茄腐镰孢菌株(分离自大豆根部)；3：尖镰孢菌；4：禾谷镰孢菌；5：串珠镰孢菌；6：木贼镰孢菌；7：燕麦镰孢菌；8：阴性对照。

图2为rpa灵敏性的侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果图；1：茄腐镰孢菌株；2：终极腐霉；3：平头炭疽菌；4：大豆疫霉菌；5：大丽轮枝菌；6：立枯丝核菌；7：稻瘟病菌；8：阴性对照。

图3为rpa侧流层析试纸条检测方法的灵敏度试验结果图。

图4为人工接种茄腐镰刀菌进行样品检测。1-5：人工接种茄腐镰刀菌引起的立枯病的植株样品rpa检测结果；6：健康植株rpa检测结果；7：阴性对照。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

提取供试病原菌菌株的基因组dna，具体提取过程如下：

取少量菌丝粉，加900μl2％ctab提取液和90μl10％sds，漩涡混匀，于60℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清液加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清液转移至新管中，加入等体积的氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。取上清液转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mnaac(ph5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm离心10min，倾去上清液，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或te(ph8.0)溶解沉淀(含20μgml^-1rnase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。对于土壤中dna的提取，首先将每个土样晾干碾碎，然后分别称取0.5g土样作为提取样品，采用spin试剂盒(q-biogeneltd，usa)进行dna的提取。土壤dna提取的具体步骤参见试剂盒说明书。

实施例2

以提取的dna为模板，采用设计的rpa引物，在下述反应体系中进行rpa反应：

样品检测：向装有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应单元管(twistampbasickits，twist)中加入缓冲液buffer29.5μl，10μm的上游引物2.1μl，10μm的下游引物2.1μl，探针0.6μl，dna2.0μl，mgac2.5μl加在pcr管盖内部，去离子水补足至50μl；将rpa扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4分钟，将反应管再次混匀，离心3-5s，放入水浴锅39℃继续反应30min。

其中，所述rpa引物长度一般为30至35个核苷酸。引物过短会严重影响重组酶的活性，长引物并不一定能提高扩增性能，反而会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的噪音。此外，引物设计时应尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。扩增产物大小不超过500bp。

根据茄腐镰孢菌的tef-1α序列(af178356.1)，使用primerpremier5.0设计了正向引物序列rpa-fsrpa-f，反向引物序列rpa-fsrpa-r，探针序列fsrpa-p。具体序列如下：rpa-fsrpa-f:acaaagccctgatccctgcacacaaaaaacacca；rpa-fsrpa-r:biotin-catagtagcggggagtctcgaacttccagagggc；fsrpa-p:fam-cgactcaacaataggaagccgctgagctcg-thf-caagggttccttcaa-c3space。

阴性对照：操作步骤同样品检测，将2.0μl模板dna改为加入2.0μl灭菌ddh2o。rpa反应结束后，应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有茄腐镰孢菌；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有茄腐镰孢菌。

实施例3

为了验证rpa侧流层析试纸条检测方法的特异性，以茄腐镰孢菌菌株和其它镰孢菌以及病原菌为供试材料(表1)，rpa侧流层析试纸条检测方法的结果显示茄腐镰孢菌的试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，其它镰孢菌以及病原菌的试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有茄腐镰孢菌。

选择与茄腐镰孢菌不同种(茄腐镰孢菌；尖镰孢菌；禾谷镰孢菌；串珠镰孢菌；木贼镰孢菌；燕麦镰孢菌等)和不同属的菌(终极腐霉；平头炭疽菌；大豆疫霉菌；大丽轮枝菌；立枯丝核菌；稻瘟病菌等)的dna作为模板，进行rpa-侧流层析试纸条检测。

表1用于检测茄腐镰孢菌特异性的真菌和卵菌菌株

按照实施例1-2的方法进行检测，检测结果如图1和图2所示。

图1是rpa-侧流层析试纸条在特异性检测结果图，1：茄腐镰孢菌株(分离自松苗根部)；2：苗木茄腐镰孢菌株(分离自大豆根部)；3：尖镰孢菌；4：禾谷镰孢菌；5：串珠镰孢菌；6：木贼镰孢菌；7：燕麦镰孢菌；8：阴性对照；试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有茄腐镰孢菌；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有茄腐镰孢菌；图中显示第1条和第2条都显示2条带，呈阳性，表明样本中含有茄腐镰孢菌；其余呈阴性。

图2是rpa-侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果图；1：茄腐镰孢菌株；2：终极腐霉；3：平头炭疽菌；4：大豆疫霉菌；5：大丽轮枝菌；6：立枯丝核菌；7：稻瘟病菌；8：阴性对照；试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有茄腐镰孢菌；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有茄腐镰孢菌；图中显示第1条显2条带，呈阳性，表明样本中含有茄腐镰孢菌；其余呈阴性。

可见，以实施例1设计的引物进行rpa扩增反应后，侧流层析试纸条检测结果显示2条棕色条带(图1，图2)，目标条带清析，能有效检测出茄腐镰孢菌。而其它真菌和卵菌只有在质控区出现一条棕色条带，阴性对照也只有在质控区出现一条棕色条带。

实施例4

使用nanodro2000微量分光光度计测出实施例1提取dna的浓度为100ng·μl^-1。将其依次稀释为100pg·μl^-1、10pg·μl^-1、1pg·μl^-1和100fg·μl^-1，根据实施例1-2采用的引物、反应体系和反应条件，对不同浓度的dna进行rpa和pcr检测。

结果如图3所示，25μl的反应体系中分别含有100ng·μl^-1、10ng·μl^-1、1ng·μl^-1、100pg·μl^-1茄腐镰孢菌dna的试纸条出现两条棕色条带，呈阳性反应，25μl的反应体系中分别含有10pg·μl^-1、1pg·μl^-1、100fg·μl^-1茄腐镰孢菌dna的纸条出现一条棕色条带，呈阴性反应；显色结果表明rpa-侧流层析试纸条技术的灵敏度达到100pg·μl^-1；rpa检测时间仅需30min，且不需要pcr仪等昂贵的仪器设备，操作程序简便，更有利在生产中推广应用。

实施例5

本实施例从人工接种苗圃地进行实际样品实验检测。

首先采用实施例1的方法快速提取发病苗圃地中的病原菌dna。然后，采用实施例2的方法对提取的病原菌dna进行rpa反应并应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。结果如图4所示，当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明接种样品1-5号中含有茄腐镰孢菌；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明阴性对照样本6号中不含有茄腐镰孢菌。而健康植株7号没有扩增出条带，再次证明了rpa-侧流层析试纸条检测方法检测结果准确可靠，有很强的实用性。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110>南京林业大学

<120>一种基于rpa-侧流层析技术检测茄腐镰孢菌的引物和探针组合及其应用

<130>2019

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acaaagccctgatccctgcacacaaaaaacacca34

<210>2

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

catagtagcggggagtctcgaacttccagagggc34

<210>3

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgactcaacaataggaagccgctgagctcgcaagggttccttcaa45