本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种在sf9细胞中表达非洲猪瘟cd2v蛋白的重组杆状病毒。
背景技术：
非洲猪瘟(africanswinefever，eastafricanswinefever,asf)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％，临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。本病自1909年在肯尼亚首次报道，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近。2018年，经中国动物卫生与流行病学中心诊断，在沈阳市沈北新区沈北街道(新城子)五五社区发生疑似非洲猪瘟疫情。非洲猪瘟的传入和疫情的出现，对我国养猪生产已构成严重威胁，高度重视非洲猪瘟的防控对于保障生猪产业的健康发展极其重要。
非洲猪瘟(asf)的病原是非洲猪瘟病毒(asfv)，该病毒主要的靶细胞是单核细胞和肺泡巨噬细胞。软蜱(钝缘蜱)是该病毒主要的传播媒介和贮藏宿主。asfv主要以家猪/猪、家猪/软蜱/野猪、家猪/软蜱三种方式循环传播。asfv是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。病毒粒子直径约为200nm，呈正20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。asfv基因组为线性双链dna分子，约为170～193kb。基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区。不同的毒株因基因组可变区长度不同而导致其基因组大小存在差异。基因组编码151～167种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白。科学家们根据p72和cd2v分别进行基因型和血清型分析。而cd2v是非洲猪瘟中蛋白中仅有糖基化蛋白之一，在病毒的逃逸机制中存在重要的意义。非洲猪瘟病毒编码的cd2v蛋白与宿主的cd2蛋白相似，cd2v蛋白在t细胞和nk细胞中表达，该蛋白能使病毒感染的细胞及细胞外病毒颗粒吸附红细胞，而病毒在家猪间传播也是由于cd2v蛋白的表达，同时该蛋白损坏了淋巴细胞的功能。
目前没有针对非洲猪瘟的疫苗，如能阻断病毒在家猪中的传播，防止病毒在机体内的逃逸，这样对防御非洲猪瘟具有重大意义。
技术实现要素：
本发明提供一种在sf9细胞中表达非洲猪瘟cd2v蛋白的重组杆状病毒，能够在sf9细胞中重组表达cd2v蛋白；从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种重组杆状病毒，其中包含有编码cd2v蛋白的核苷酸片段；所述的cd2v蛋白，其氨基酸序列为seqidno:4；所述的核苷酸片段，其序列为seqidno:3；
本发明所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备非洲猪瘟病毒的cd2v蛋白；
本发明再一个方面提供一种cd2v蛋白，是使用上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。
所述的昆虫细胞为昆虫细胞sf9；
本发明所制备的蛋白可用于制备鉴别诊断非洲猪瘟的制品，或用于制备亚单位疫苗。
本发明使用昆虫细胞sf9重组表达非洲猪瘟cd2v蛋白，蛋白表达量高，易于纯化，可用于制备鉴别诊断制品，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。
具体实施方式
申请人从2018年的沈阳毒株cd2v蛋白基因序列，经剪切优化，核苷酸片段序列进行优化后，用sf9细胞表达系统表达了重组cd2v蛋白，该蛋白为鉴别诊断以及后期的亚单位疫苗奠定基础。
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。
实施例1：表达cd2v基因的杆粒的构建
1.1cd2v基因的剪切、优化
将核苷酸序列为seqidno:1的cd2v基因(编码蛋白的氨基酸序列为seqidno:2)的结构域进行分析后，将cd2v基因的结构域进行剪切，将c端150aa的胞内结构剪切掉，帮助蛋白更好地折叠为三级结构，将其抗原位点更好地暴露出来。同时将其密码子进行优化；从而使蛋白在sf9细胞中表达效率更高。优化修饰后的氨基酸的序列为seqidno:3，能很好地表达出抗原位点。优化后的基因的核苷酸序列为seqidno:4。
1.2表达cd2v基因的杆粒的构建
1.2.1酶切反应
1.2.1.1标记好需要用到的1.5mlep管，在1.5mlep管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μl，加样如下表所示：
1.2.1.2将步骤2.2.1中的1.5mlep管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。
1.2.1.3双酶切产物胶回收
取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的dna片段。
(1)标记好样品收集ep管、吸附柱以及收集管。
(2)称取标记好的空的ep管重量，并记录数值。
(3)将单一的目的dna条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5ml离心管中。
(4)向步骤(3)中的1.5ml离心管中加入600μlpcbuffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(5)柱平衡：向吸附柱cb2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μl平衡液bl，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱cb2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱cb2放入收集管中。
(7)向吸附柱中加入600μl漂洗液pwbuffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2放入收集管中。
(8)重复步骤(7)。
(9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。
(10)将吸附柱cb2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlelutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm，2min。
(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱cb2，盖上离心管盖子，保留离心管中的dna样品。
(12)将步骤11中的dna样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收dna片段。
1.2.2连接反应
(1)标记需要用到的0.2ml离心管。
(2)在标记完整的0.2ml管中按照下表的20μl反应体系进行加样：
(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。
(4)将0.2ml离心管置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。
(5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
1.2.3转化反应
(1)将10μl连接反应液快速加入100μl感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min。
(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min。
(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μl液体lb培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养1h。
(4)制备转化平板，依据质粒抗性制备转化用lb抗性平板。
(5)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm，2min，去掉600μl上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。
(6)将步骤(5)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h。
(7)观察记录转化结果。
1.2.4质粒抽提
(1)用10μl移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的lb液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。
(2)吸取菌液至1.5mlep管中，室温离心，12,000rpm，2min，弃上清。
(3)向步骤(2)中的ep管中加入250μl质粒提取试剂p1buffer，彻底悬浮菌体。
(4)向步骤(3)溶液中加入250μlp2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。
(5)向步骤(4)溶液中加入350μlp3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。
(8)向吸附柱中心加入500μlbufferdw1，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。
(9)向吸附柱中心加入500μlwashsolution，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。重复一次。
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μlelutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min，4℃保存管中dna溶液。
1.2.5pcr鉴定
(1)标记好需要用到的pcr管，按照下表进行加样、混匀，反应体系为25μl：
(2)pcr扩增程序：
(3)测序：将pcr鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序。
1.2.6转化
将测序阳性的质粒转化dh10bac感受态细胞，方法同2.3.
1.2.7挑取杆粒与pcr鉴定
1.2.7.1挑取杆粒
(1)从2.5转化的平板中，用10μl移液枪头从转化平板中挑取白色单克隆菌落至5ml含卡那霉素抗性、四环素抗性、庆大霉素抗性的lb液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。
(2)吸取菌液至1.5mlep管中，室温离心，12,000rpm，2min，弃上清。
(3)向步骤(2)中的ep管中加入250μl质粒提取试剂p1buffer，彻底悬浮菌体。
(4)向步骤(3)溶液中加入250μlp2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。
(5)向步骤(4)溶液中加入350μlp3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。
(8)向吸附柱中心加入500μlbufferdw1，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。
(9)向吸附柱中心加入500μlwashsolution，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。重复一次。
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μlelutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min，4℃保存管中dna溶液。
1.2.7.2pcr鉴定将2.6.1中提取的dna，进行pcr鉴定，鉴定阳性的质粒送上海生物工程有限公司进行测序，测序阳性的用于sf9细胞转染。
实施例2sf9细胞转染
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；tnm-fh培养液置于27℃水浴锅预热至27℃。
(2)将2μg重组dna加入到100μl无血清和双抗的tnm-fh培养液中，混匀。将9μlcellfectinreagent加入到100μl无血清和双抗的tnm-fh培养液中，混匀。将脂质体与重组dna混合，室温静止40min。
(3)从27℃培养箱中取出6孔板细胞，弃去上清培养基，用预温的tnm-fh培养液洗细胞三次，并弃去tnm-fh培养液。
(4)每个细胞孔加入2ml10％胎牛血清的tnm-fh培养液。
(5)将重组dna与脂质体的混合物轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在27℃条件下静止培养5～6h。
(6)将孔中的液体弃掉，加入2ml完全tnm-fh培养液(含有双抗和10％血清)，27℃条件下静止培养5～6天。
(7)待细胞肿胀，体积变大，脱落后，收集上清液，标记为p1代重组杆状病毒，命名为cd2v-p1。
(8)用cd2v-p1感染新培养的sf9细胞，提高重组杆状病毒含量，反复接种2代后，收取细胞上清液，4℃或-80℃保存备用。
实施例3蛋白纯化与检测
4.1重组cd2v蛋白在昆虫细胞sf9内的表达与鉴定将重组杆状病毒cd2v-p1感染昆虫细胞sf9，27℃培养72h，同时以未感染病毒的正常昆虫细胞sf927℃培养48h作为对照，收获细胞，将培养上清冻存备用。细胞用ph7.4的pbs洗涤后，加入1×sds-page加样缓冲液[50mmtris-hcl(ph6.8)，100mmdithiothreitol(dtt),2％sds,0.05％bromophemolblue,10％glycerol]，煮沸5min，用12％分离胶、5％浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，100伏约2.5h，考马斯亮蓝r250染色，发现未优化的cd2v基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中没有表达，而优化的cd2v重组杆状病毒感染的昆虫细胞sf9裂解物中有cd2v蛋白表达，其蛋白含量为2-4mg/l。
4.2重组cd2v蛋白的层析纯化将重组杆状病毒cd2v-p2接种昆虫细胞sf9，27℃培养72小时后，离心收集细胞沉淀，细胞沉淀中加入适量生理盐水，重悬细胞沉淀，经超声波裂解细胞，以1000r/min4℃离心10min，收集上清液，用ni2+柱进行层析纯化。
4.3westernblot将4.2制备的蛋白进行sds-page，采用半干法20伏转印30min，将目的蛋白条带转移到pvdf膜，转印膜用封闭液封闭过夜，pbst洗涤3次，1∶500稀释的非洲猪瘟病毒阳性血清37℃作用1.5h，pbst洗3次，用1∶2000稀释的hrp标记的羊抗猪酶标抗体37℃作用1.5h，pbst洗涤3次，底物溶液作用5min，在chemidoc进行显色，结果优化后的核苷酸序列为seqidno:3的基因在昆虫细胞sf9内表达的cd2v蛋白条带很亮，说明表达的cd2v蛋白免疫原性好，能够用来制备亚单位疫苗。
序列表
<110>青岛易邦生物工程有限公司
<120>一种在sf9细胞中表达非洲猪瘟cd2v蛋白的重组杆状病毒
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