一种具有抑菌活性的β-二氢沉香呋喃型倍半萜新化合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于农业和植物化学领域，具体涉及一种具有抑菌活性的β-二氢沉香呋喃型倍半萜新化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：永瓣藤（monimopetalumchinenserehd.）为卫矛科（celastraceae）永瓣藤属单种属药用植物，在江西民间被用来治疗风湿性关节炎。该植物最早在1926年被中国植物学家秦仁昌在安徽省祁门县棕里村潘坑发现，目前由于生态环境破坏等原因，该植物已被列为首批国家二级稀有濒危保护植物。卫矛科植物种类众多，被我国中医、少数民族医用及民间药用的有61种，其中研究较多的有南蛇藤属、雷公藤属和美登木属植物，从这些植物中获得了大量具有良好杀虫、抑菌活性的化合物，而永瓣藤属于中国特有植物，目前仅作为民间草药使用，对它的化学成分研究较少，其化学成分组成尚不清楚。山核桃疮痂病和炭疽病是山核桃最严重的病害之一，给山核桃的产量和品质造成了严重的危害。长期使用化学农药防治这两种病害容易造成环境污染、农药残留、病原菌抗药性等一系列严重的生态问题，从天然植物来源中寻找高效低毒的植物源农药是一种较好的替代方法。技术实现要素：针对本领域的不足之处，本发明的目的是提供一种具有抑菌活性的β-二氢沉香呋喃型倍半萜新化合物及其制备方法和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：1.一种具有抑菌活性的β-二氢沉香呋喃型倍半萜新化合物，其特征在于，其结构式如下：。2.根据权利要求1所述的具有抑菌活性的β-二氢沉香呋喃型倍半萜新化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取：取永瓣藤茎叶，按料液比1:10-1:30加入50-90%甲醇回流提取3次，合并提取液，浓缩成流浸膏；(2)硅胶柱层析粗分：将流浸膏拌样，上100-200目硅胶柱层析，依次以100:1、50:1、20:1、10:1、5:1（v/v）的二氯甲烷-甲醇溶剂系统梯度洗脱，薄层色谱检测将所得相同流分合并，获得8个流分（fr.1-fr.8）；(3)硅胶柱层析细分：流分2（fr.2）拌样，上200-300目硅胶柱层析，依次以5:1、4:1、3:1、2:1、1:1（v/v）的石油醚-四氢呋喃溶剂系统梯度洗脱，薄层色谱检测将所得相同流分合并，进一步获得5个流分（fr.2-1-fr.2-5）；(4)制备液相纯化：流分2-4（fr.2-4）上制备液相纯化，得到权利要求1所述化合物。3.根据权利要求2所述的具有抑菌活性的β-二氢沉香呋喃型倍半萜新化合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)制备液相纯化的色谱条件：shim-packrp-c18柱，规格为20×200mm，10μm，流动相a相为水和b相为甲醇，采用等度洗脱程序：0-40min，80%b，流速为5ml/min，柱温为25℃，检测波长为210nm和270nm。4.根据权利要求1所述的具有抑菌活性的β-二氢沉香呋喃型倍半萜新化合物可用于防治山核桃疮痂病和炭疽病。本发明的有益效果在于：本发明通过对永瓣藤化学成分进行系统深入研究，经过谱学数据分析表明从永瓣藤茎叶中分离得到β-二氢沉香呋喃型倍半萜化合物，该化合物为首次报道的新化合物。经过抑菌试验研究表明，本发明提供的β-二氢沉香呋喃型倍半萜新化合物对山核桃疮痂病菌和炭疽病菌具有较好的抑菌活性，为植物源农药开发提供了新的来源。附图说明图1永瓣藤素g的结构式图2永瓣藤素g的1h-nmr谱图3永瓣藤素g的13c-nmr谱图4永瓣藤素g的hmbc谱图5永瓣藤素g的hsqc谱具体实施方式以下将结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但不用来限制本发明的范围。实施例1化合物的制备具有抑菌活性的β-二氢沉香呋喃型倍半萜新化合物的制备方法，包括以下步骤：(1)提取：取永瓣藤茎叶，按料液比1:10-1:30加入50-90%甲醇回流提取3次，合并提取液，浓缩成流浸膏；(2)硅胶柱层析粗分：将流浸膏拌样，上100-200目硅胶柱层析，依次以100:1、50:1、20:1、10:1、5:1（v/v）的二氯甲烷-甲醇溶剂系统梯度洗脱，薄层色谱检测将所得相同流分合并，获得8个流分（fr.1-fr.8）；(3)硅胶柱层析细分：流分2（fr.2）拌样，上200-300目硅胶柱层析，依次以5:1、4:1、3:1、2:1、1:1（v/v）的石油醚-四氢呋喃溶剂系统梯度洗脱，薄层色谱检测将所得相同流分合并，进一步获得5个流分（fr.2-1-fr.2-5）；(4)制备液相纯化：流分2-4（fr.2-4）上制备液相纯化得到本发明化合物。色谱条件：shim-packrp-c18柱，规格为20×200mm，10μm，流动相a相为水和b相为甲醇，采用等度洗脱程序：0-40min，80%b，流速为5ml/min，柱温为25℃，检测波长为210nm和270nm。实施例2化合物的结构解析白色无定形粉末，:-20.2（c0.113,meoh）。高分辨质谱（hr-esi-ms：m/z=631.2642[m+h]+，计算值631.2652）表明其分子式为c35h38n2o9。质谱碎片峰表明分子中可能含有烟酸（m/z123）、苯甲酸（m/z122）和5-羧基-n-甲基-2-吡啶酮（m/z153）结构。13c-nmr谱和hsqc谱显示分子有4个甲基碳δ=31.1（c-12）、24.0（c-13）、12.5（c-14）和16.9（c-15），2个亚甲基碳δ=22.3（c-2）和26.6（c-3），6个次甲基碳δ=79.7（c-1）、34.3（c-4）、75.8（c-6）、54.4（c-7）、70.0（c-8）、76.8（c-9），和3个季碳δ=91.5（c-5）、49.2（c-10）和81.6（c-11），以上光谱数据说明分子中含有1个由15个碳组成的β-二氢沉香呋喃骨架。根据hmbc谱可获知，3个取代基分别与3个次甲基碳（79.7、75.8、76.8）相连。同时，在hmbc谱中可发现h-1（5.63）与δc164.2羰基碳相关，以及该羰基碳和化学位移为δh6.85-8.39的烟酰基（nic）质子相关，可以推断烟酰基与c-1相连；h-6（6.32）与δc162.8羰基碳相关，以及该羰基碳和化学位移为6.57-8.18的5-羧基-n-甲基-2-吡啶酮取代基（cnmp）质子相关，可以推断5-羧基-n-甲基-2-吡啶酮取代基与c-6相连；h-9（5.59）与δc164.9羰基碳相关，以及该羰基碳和化学位移为7.17-7.68的苯甲酰基（bz）质子相关，可以推断苯甲酰基与c-9相连。其他所有环上质子均可清楚的由1h-nmr，hsqc和hmbc谱进行归属。光谱数据详见表1。相对立体构型通过分析hmbc和hsqc谱中的碳氢关系及与同植物中分得的其他化合物对比，判定为（+）-1s，4r，5s，6r，7r，8s，9s，10s，因此鉴定该化合物为1α-烟酰氧基-6β-（5-羧基-n-甲基-2-吡啶酮基）-9α-苯甲酰氧基-8α-羟基-β-二氢沉香呋喃，命名为永瓣藤素g。永瓣藤素g的化学结构：表1永瓣藤素g的nmr数据全归属实施例3永瓣藤素g的抑菌活性分析按实施例1制备所得的永瓣藤素g的抑菌活性测定使用的供试植物病原菌包括山核桃疮痂病菌（fusicladiumeffusum）、炭疽病菌（gloeosporiumfructigenum）、叶斑病菌（alternariaalternata）、根腐病菌（fusariumoxysporum）、黑斑病菌（xanthomonasjugladis）等5种山核桃上常见病原菌。将永瓣藤素g溶于dmso，配制成浓度为5000μg/ml的母液，并使用dmso进行梯度稀释后待用。将各浓度永瓣藤素g溶液或等体积dmso分别加入加热融化并冷却至55℃的psa培养基中，混匀后倒入直径为9cm的培养皿中制成含药平板。用直径5mm的打孔器在预培养的真菌（山核桃疮痂病菌、炭疽病菌、叶斑病菌和根腐病菌）菌落边缘打取菌碟，并接种至含药平板中间，每个处理3个重复。25℃倒置培养至对照接近长满板，十字交叉法测定菌落直径并计算抑制率。菌落直径=十字交叉法测定直径平均值-5mm。抑制率（%）=（对照菌落直径﹣加药处理菌落直径）/对照菌落直径×100。根据不同浓度的抑制率计算永瓣藤素g的ec50值。将各浓度永瓣藤素g溶液或等体积dmso分别加入nb培养液中制成含药培养液，用分光光度计将预培养至对数生长期的细菌（山核桃黑斑病菌）培养物od600值调至0.02，并按1:200的比例加入含药培养液中，每个处理3个重复。28℃175rpm摇培使对照长至对数生长期，用分光光度计测定od600并计算抑制率。抑制率（%）=（对照od600值﹣加药处理od600值）/对照od600值×100。根据不同浓度的抑制率计算永瓣藤素g的ec50值。试验结果：按实施例1制备所得的永瓣藤素g对5种山核桃病原菌的抑菌活性如表2所示。从表中结果可以看出，永瓣藤素g对山核桃疮痂病菌和炭疽病菌具有较好的抑制活性，但对其他三种供试病原菌在受试范围内无活性。表2永瓣藤素g对山核桃病原菌的抑菌活性病原菌ec50（μg/ml）山核桃疮痂病菌23.29±3.15山核桃炭疽病菌59.71±9.86山核桃叶斑病菌>100山核桃根腐病菌>100山核桃黑斑病菌>100当前第1页12