本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种内酯型槐糖脂的制备方法。
背景技术：
槐糖脂(sophorolipid)是由酵母菌以糖和植物油等为碳源，经一定条件的发酵工艺产生的微生物次级代谢产物。槐糖脂是一种糖脂类生物表面活性剂，其具有常规表面活性剂所具有的增溶、乳化、润湿、发泡、分散、降低表面张力等通用性能，而且还具有无毒、100％可生物降解、耐温、耐高盐、适应ph范围广以及对环境友好等特性。槐糖脂可应用于石油、环保、医药、食品、化妆品、洗涤、家居护理、农业、饲料等领域，可部分或完全替代化学合成表面活性剂的使用。
槐糖脂分为内酯型和酸型两种，通常内酯型槐糖脂具有较高的降低表面张力和抗菌的能力，而酸型槐糖脂具有更好的溶解度和发泡能力。此外，与酸型槐糖脂相比，内酯型槐糖脂具有更好的抗菌抗炎乳化能力且在高温高盐情况下更加稳定。然而，一般地，微生物发酵所产槐糖脂主要由17-羟基十八烯酸或十八烷酸的内酯型和酸型槐糖脂同系物构成，而酸型和内脂型槐糖脂在结构和理化性质上具有高度的相似性，使得两者的分离提纯较为困难。目前，现有技术多采用有机试剂萃取的方法制备内酯型槐糖脂，例如，中国专利cn105886572采用乙酸乙酯萃取并在低温环境析出内酯型槐糖脂的方法制备内酯型槐糖脂。上述制备方法的生产成本高，且在生产中存在着安全风险，这些因素给内酯型槐糖脂及其粉剂的生产带来了很大的困难。因此，开发制备工艺简单、低毒性、低成本的内酯型槐糖脂制备方法具有重要意义。
技术实现要素：
为解决现有技术中的技术问题，本发明的目的在于提供一种从含有内酯型槐糖脂和酸型槐糖脂的生物发酵液中分离制备内酯型槐糖脂的方法，该方法采用低毒性提取溶剂，分离工艺安全简单，成本低，同时能够保证较高的内酯型槐糖脂的纯度和收率。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种内酯型槐糖脂的制备方法，所述制备方法包括：将含有内酯型槐糖脂和酸型槐糖脂的生物发酵液经预处理后得到槐糖脂层，将所述槐糖酯层与水混合后分离去除固体杂质得到槐糖脂溶液，在所述槐糖脂溶液中加入磷酸二氢盐和邻苯二甲酸氢盐，在碱性条件下冷却结晶得到内酯型槐糖脂。
在不同的溶剂、ph和温度条件下，酸型槐糖脂和内酯型槐糖脂的与溶剂分子相互作用方式不同，在溶剂中的状态处于不断的动态变化，本发明通过对大量的溶剂及其复配方式进行筛选，通过分析内酯型槐糖脂和酸型槐糖脂在不同ph和温度等条件下、在各种不同溶剂中的溶解度变化，发现在提取体系中添加邻苯二甲酸氢盐和磷酸二氢盐，内酯型槐糖脂在碱性低温条件下迅速结晶析出，而酸型槐糖脂则能够保持稳定的较高的溶解度，极少结晶析出，能够同时保证从生物发酵液中分离得到的内酯型槐糖脂的纯度和收率。基于此，本发明通过引入邻苯二甲酸氢盐和磷酸二氢盐，将由生物发酵液的槐糖脂层制备的水溶液中的酸型槐糖脂和内酯型槐糖脂在碱性低温条件下有效分离，获得较高纯度和收率的内酯型槐糖脂。
作为优选，所述碱性条件为ph8～10；所述冷却结晶为降温至1～10℃进行结晶。
本发明发现，在上述ph和温度条件下，内酯型槐糖脂能够更快速有效地结晶析出，而酸型槐糖脂则保持稳定的溶解状态，能够更好地保证从生物发酵液中分离得到的内酯型槐糖脂的纯度和收率。
进一步优选地，所述碱性条件为ph8～9；所述冷却结晶为降温至4～6℃进行结晶。
上述碱性条件的ph可通过添加koh调节ph得到。
上述冷却结晶为迅速降温至结晶温度后维持结晶温度进行结晶。
作为优选，所述邻苯二甲酸氢盐与所述磷酸二氢盐的添加量的摩尔比为1：(1～2)。
当邻苯二甲酸氢盐与磷酸二氢盐以上述摩尔比配合使用时，内酯型槐糖脂能够更快速有效地在碱性条件下冷却结晶，而酸型槐糖脂则保持稳定的溶解状态，能够更好地同时保证内酯型槐糖脂的纯度和收率。
进一步优选地，所述邻苯二甲酸氢盐的添加量为至浓度为0.2-0.4mol/l。所述磷酸二氢盐的添加量为至浓度为0.2-0.6mol/l。
作为本发明的优选实施方式，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钾，所述邻苯二甲酸氢盐为邻苯二甲酸氢钾。
在上述结晶条件下，结晶时间可以根据对于内酯型槐糖脂的纯度和收率的要求不同，进行调整。作为优选，所述结晶的时间为10～20小时。
本发明发现在以上述比例复配的邻苯二甲酸氢盐和磷酸二氢盐时，在ph8～10、1～10℃结晶10～20小时能够同时保证较高的内酯型槐糖脂的纯度和收率。
本发明中，在分离得到生物发酵液的槐糖脂层后，将所述槐糖酯层与水混合后分离去除固体杂质得到溶液步骤中，水的添加量为槐糖脂层体积的4～8倍。
作为优选，将所述槐糖酯层与4～8倍体积的水混合后，充分搅拌，离心去除固体杂质。
进一步优选地，所述离心为4000～5000rpm，5～10分钟。
作为优选，所述槐糖脂层中内酯型槐糖脂的含量＞60％。本发明提供的方法对于总槐糖脂中内酯型槐糖脂的含量＞60％的生物发酵液能够实现更高的内酯型槐糖脂的纯度和收率。
本发明中，在进行内酯型槐糖脂的分离提取前，先对生物发酵液进行预处理，所述预处理为将生物发酵液高温处理后自然沉降分层。
作为优选，所述自然沉降分层为在25～30℃静置3～5小时。
作为优选，所述高温处理为在100～125℃处理10～30分钟。
自然沉降分层可采用本领域常用的仪器，如分液漏斗等。自然沉降分层后，生物发酵液中的菌体和水分位于上层，槐糖脂位于下层，分离下层即得到含有酸型槐糖脂和内酯型槐糖脂的槐糖脂层。
本发明中，所述生物发酵液可为任意产槐糖脂的生物细胞经发酵获得的含有酸型槐糖脂和内酯型槐糖脂的发酵液。
作为优选，所述生物发酵液为产槐糖脂酵母菌经发酵得到。
作为本发明的优选实施方案，所述产槐糖脂酵母菌为拟威克酵母。
产槐糖脂酵母菌的发酵方法可采用本领域常规方法，例如：在含4％～8％的葡萄糖和6％～10％的大豆油的基础无机培养基中，发酵培养72～96小时得到。
作为本发明的一种优选方案，所述内酯型槐糖脂的制备方法包括如下步骤：
(1)利用产槐糖脂酵母菌以葡萄糖和植物油为碳源发酵生产槐糖脂；
(2)发酵结束后，将发酵液在110-120℃热处理15～25分钟，将热处理后的发酵液置于分液漏斗中在25～30℃静置3-5小时，并将下层可见槐糖脂从分液漏斗中取出得到槐糖脂层；
(3)将所述槐糖脂层与4～8倍体积的水混合，充分搅拌，4000～5000rpm离心5～10min去除固体杂质，得到槐糖脂与水的溶液；
(4)在步骤(3)得到的溶液中加入邻苯二甲酸氢盐使其浓度为0.2-0.4mol/l，加入磷酸二氢盐使其浓度为0.2-0.6mol/l，加入氢氧化钾调节ph为8～10，置于结晶瓶中于4～6℃低温结晶10-15小时；
(5)过滤得到内脂型槐糖脂晶体，干燥即得。
本发明制备得到的内酯型槐糖脂可经粉碎制备内脂型槐糖脂粉剂。
本发明的有益效果在于：本发明提供的通过分离发酵液中内酯型槐糖脂和酸型槐糖脂制备内酯型槐糖脂的方法，避免了使用高毒性的有机溶剂(如乙酸乙酯)，与现有技术中的内酯型槐糖脂制备方法相比具有安全性高、不需要复杂的仪器设备、生产成本低、工艺简单易行的优势，适于大范围推广应用，同时保证了较高的内酯型槐糖脂的纯度和收率。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中使用的产槐糖脂酵母菌为拟威克酵母(wickerhamiella)，菌种保藏编号为cicc33031。
以下实施例中基础无机盐培养基的配方如下：二水合氯化钙18mg/l、七水合硫酸亚铁12mg/l、二水合氯化锰4mg/l、五水合硫酸铜1.2mg/l、七水合硫酸锌16mg/l、碘化钾0.4mg/l。
实施例1
本实施例提供一种内酯型槐糖脂的制备方法，具体如下：
(1)配制yepd种子培养基，300ml摇瓶中装入50mlyepd培养基，并接入酵母单菌落，在160r/min,30℃的培养箱中培养24h。
(2)配制含有葡萄糖4％和大豆油6％(质量体积百分比)的基础无机盐培养基3l，按发酵培养基总量的10％接入酵母菌yepd种子液，在发酵初始温度为30℃，搅拌为200r/min，溶氧保持在30％以上的条件下，发酵培养72小时；其中并根据具体情况调节转速与通气量，保持ph5.5。
(3)发酵结束后，将发酵液在110℃下热处理20分钟，然后将刚处理完的发酵液倒入分液漏斗中25℃静置3小时，将最下层槐糖脂层取出，得到槐糖脂层，采用液相色谱分析其中内脂型槐糖脂的含量为65％；
(4)将槐糖脂层加入至4倍体积的纯净水中，充分搅拌10分钟，并在4500rpm离心5分钟，去除固体杂质，得到槐糖脂与水的溶液；
(5)在步骤(4)得到的溶液中加入邻苯二甲酸氢钾使其浓度为0.2mol/l，并加入磷酸二氢钾使其浓度为0.2mol/l，采用4m的koh调节ph为8.0，置于带夹套的结晶瓶中4℃低温结晶10小时；
(6)过滤得到内脂型槐糖脂晶体，最后烘干、粉碎得到内脂型槐糖脂粉剂。
采用高效液相色谱分析槐糖脂粉剂的纯度和收率，结果表明，上述内酯型槐糖脂粉剂的纯度为86％，内脂型槐糖脂的收率为92％。
实施例2
本实施例提供一种内酯型槐糖脂的制备方法，具体如下：
(1)配制yepd种子培养基，300ml摇瓶中装入50mlyepd培养基，并接入酵母单菌落，在160r/min,30℃的培养箱中培养24h。
(2)配制含葡萄糖6％和大豆油8％的基础无机盐培养基3l，按发酵培养基总量的10％接入酵母菌yepd种子液，在发酵初始温度为30℃，搅拌为200r/min,溶氧保持在30％以上的条件下，发酵培养96小时；其中并根据具体情况调节转速与通气量，保持ph5.5。
(3)发酵结束后，将发酵液在120℃下热处理20分钟，然后将刚处理完的发酵液倒入分液漏斗中25℃静置3小时，将最下层槐糖脂层取出，得到槐糖脂层，采用液相色谱分析其中内脂型槐糖脂的含量为70％；
(4)将槐糖脂层加入至6倍体积的纯净水中，充分搅拌10分钟，并在4500rpm离心5分钟，去除固体杂质，得到槐糖脂与水的溶液；
(5)在步骤(4)得到的溶液中加入邻苯二甲酸氢钾使其浓度为0.2mol/l，并加入磷酸二氢钾使其浓度为0.4mol/l，采用4m的koh调节ph为9.0，置于带夹套的结晶瓶中4℃低温结晶15小时；
(6)过滤得到内脂型槐糖脂晶体，最后烘干、粉碎得到内脂型槐糖脂粉剂。
采用高效液相色谱分析槐糖脂粉剂的纯度和收率，结果表明，上述内酯型槐糖脂粉剂的纯度为90％，内脂型槐糖脂的收率为86％。
实施例3
本实施例提供一种内酯型槐糖脂的制备方法，具体如下：
(1)配制yepd种子培养基，300ml摇瓶中装入50mlyepd培养基，并接入酵母单菌落，在160r/min,30℃的培养箱中培养24h。
(2)配制含有葡萄糖8％和大豆油10％的基础无机盐培养基3l，按发酵培养基总量的10％接入酵母菌yepd种子液，在发酵初始温度为30℃，搅拌为200r/min,溶氧保持在30％以上的条件下，发酵培养96小时；其中并根据具体情况调节转速与通气量，保持ph5.5。
(3)发酵结束后，将发酵液在120℃下热处理20分钟，然后将刚处理完的发酵液倒入分液漏斗中25℃静置3小时，将最下层槐糖脂层取出，得到槐糖脂层，采用液相色谱分析其中内脂型槐糖脂的含量为75％；
(4)将槐糖脂层加入至8倍体积的纯净水中，充分搅拌10分钟，并在4500rpm离心5分钟，去除固体杂质，得到槐糖脂与水的溶液；
(5)在步骤(4)得到的溶液中加入邻苯二甲酸氢钾使其浓度为0.4mol/l，并加入磷酸二氢钾使其浓度为0.6mol/l，采用4m的koh调节ph为9.0，置于带夹套的结晶瓶中4℃低温结晶15小时；
(6)过滤得到内脂型槐糖脂晶体，最后烘干、粉碎得到内脂型槐糖脂粉剂。
采用高效液相色谱分析槐糖脂粉剂的纯度和收率，结果表明，上述内酯型槐糖脂粉剂的纯度为92％，内脂型槐糖脂收率为75％。
对比例1
(1)配制yepd种子培养基，300ml摇瓶中装入50mlyepd培养基，并接入酵母单菌落，在160r/min,30℃的培养箱中培养24h。
(2)配制含有葡萄糖8％和大豆油10％的基础无机盐培养基3l，按发酵培养基总量的10％接入酵母菌yepd种子液，在发酵初始温度为30℃，搅拌为200r/min,溶氧保持在30％以上的条件下，发酵培养96小时；其中并根据具体情况调节转速与通气量，保持ph5.5。
(3)发酵结束后，将发酵液在120℃下热处理20分钟，然后将刚处理完的发酵液倒入分液漏斗中25℃静置3小时，将最下层槐糖脂层取出，得到槐糖脂层，采用液相色谱分析其中内脂型槐糖脂的含量为75％；
(4)将槐糖脂层加入至8倍体积的纯净水中，充分搅拌10分钟，并在4500rpm离心5分钟，去除固体杂质，得到槐糖脂与水的溶液；
(5)将步骤(4)得到的溶液使用4m的koh调节ph为9，置于带夹套的结晶瓶中4℃低温结晶15小时；
(6)过滤得到内脂型槐糖脂晶体，最后烘干、粉碎得到内脂型槐糖脂粉剂。
采用高效液相色谱分析槐糖脂粉剂的纯度和收率，结果表明，上述内酯型槐糖脂粉剂的纯度为75％，内脂型槐糖脂收率为60％。
对比例2
(1)配制yepd种子培养基，300ml摇瓶中装入50mlyepd培养基，并接入酵母单菌落，在160r/min,30℃的培养箱中培养24h。
(2)配制含有葡萄糖8％和大豆油10％的基础无机盐培养基3l，按发酵培养基总量的10％接入酵母菌yepd种子液，在发酵初始温度为30℃，搅拌为200r/min,溶氧保持在30％以上的条件下，发酵培养96小时；其中并根据具体情况调节转速与通气量，保持ph5.5。
(3)发酵结束后，将发酵液在120℃下热处理20分钟，然后将刚处理完的发酵液倒入分液漏斗中25℃静置3小时，将最下层槐糖脂层取出，得到槐糖脂层，采用液相色谱分析其中内脂型槐糖脂的含量为75％；
(4)将槐糖脂层加入至8倍体积的纯净水中，充分搅拌10分钟，并在4500rpm离心5分钟，去除固体杂质，得到槐糖脂与水的溶液；
(5)在步骤(4)得到的溶液中加入磷酸二氢钾使其浓度为0.6mol/l,采用4m的koh调节ph为9.0，置于带夹套的结晶瓶中4℃低温结晶15小时；
(6)过滤得到内脂型槐糖脂晶体，最后烘干、粉碎得到内脂型槐糖脂粉剂。
采用高效液相色谱分析槐糖脂粉剂的纯度和收率，结果表明，上述内酯型槐糖脂粉剂的纯度为78％，内脂型槐糖脂收率为62％。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。