本发明涉及微藻生物技术领域，具体涉及一种利用褪黑素促进高光缺氮胁迫下微藻油脂积累的方法。
背景技术：
微藻对非生物胁迫具有一定的耐受性，可积累高价值次级代谢物，包括油脂、虾青素、藻蓝蛋白等。又因其可以进行光合作用，能有效利用太阳能将水、co2和无机盐转化为有机物。因此，微藻生物质作为替代陆生植物生产生物燃料的原料。
在异养条件下微藻利用葡萄糖等有机碳源可快速积累生物质，大大缩短了藻细胞生长周期，提高了细胞生物量产率，但异养条件下培养的藻细胞品质较差，一般获得的藻细胞油脂含量较低，因此异养阶段一般不适于积累油脂。而采用两阶段法诱导微藻积累油脂成为当今研究的热点，zhao等利用“异养-光化学诱导”大幅度提高了微藻中油脂含量(zhao,y.,li,d.,ding,k.,che,r.,xu,j.w.,zhao,p.,li,t.,ma,h.,yu,x.2016.productionofbiomassandlipidsbytheoleaginousmicroalgaemonoraphidiumsp.qly-1throughheterotrophiccultivationandphoto-chemicalmodulatorinduction.bioresourtechnol,211,669-76.)；此外，高光照、缺氮均是常见的诱导微藻积累次级代谢产物的方式，但高光照和缺氮胁迫下通常会抑制藻细胞的生长，从而降低了微藻生物量产率，进而增加微藻生产生物柴油的成本。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供一种利用褪黑素促进高光缺氮胁迫下微藻油脂积累的方法，本发明方法采用可异养的微藻，进行藻种异养的培养使藻细胞在短时间内快速生长，随后稀释至适量的浓度进行光自养缺氮培养，同时结合褪黑素诱导藻细胞大量积累油脂，并利用有机溶剂提取藻细胞内油脂；本发明操作简单，能够缩短藻细胞的生长周期，提高油脂的产率。
一种利用褪黑素促进高光缺氮胁迫下微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为24～26℃条件下，以10g/l葡萄糖为碳源的bg-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的bg-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/l作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制10mmol/l的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤(1)的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为10～80μmol/l，并置于温度为24～26℃诱导培养；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；
进一步的，所述单针藻为单针藻菌株monoraphidiumsp.qly-1(ncbi：km199735)；
进一步的，所述步骤(2)中光照强度为100～120μmol·m-2·s-1；
进一步的，所述步骤(3)中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液；
进一步的，所述氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；
进一步的，步骤(3)中提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。
本发明的有益效果为：
(1)植物激素可调控微藻的生长和次级代谢产物代谢而备受关注，为解决非生物胁迫下微藻生物量低提供了新的解决方案；褪黑素作为一种植物激素具有光谱的作用，可调控植物根的形态、种子的萌发、周期及响应一系列的生物和非生物胁迫，因此，本发明中使用褪黑素，褪黑素有助于微藻在非生物胁迫下的生长和油脂积累。
(2)本发明工序简单方便、本较少，只需添加微量的褪黑素就可以保障微藻在高光缺氮条件下的生物量，又可以进一步提高微藻中油脂的积累，较对照组油脂含量提高了1.35-1.47倍；
(3)本发明也进一步提高了高光缺氮胁迫下微藻的油脂产率，在添加微量褪黑素的情况下，油脂产率比对照组提高了1.25-1.43倍，当外援添加20μmol/l褪黑素时，油脂产率较单独高光缺氮胁迫下提高了1.06倍；
(4)本发明的褪黑素分子量小、易被植物吸收，还可以保证植物在逆境中的生长和发育。在产油微藻的培养中，褪黑素可作为外源植物激素促进微藻大量积累次级代谢产物和提高微藻的抗逆性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明作进一步说明。
对比例1：一种利用褪黑素促进高光缺氮胁迫下微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以10g/l葡萄糖为碳源的bg-11基础培养基异养培养单针藻monoraphidiumsp.qly-1(ncbi：km199735)，待单针藻monoraphidiumsp.qly-1(ncbi：km199735)生长至对数生长期后期(生物量达到5g/l)收集藻细胞，用新鲜的bg-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/l作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂：将步骤(1)的诱导藻液置于温度为25℃、光照强度为30μmolm-2s-1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。油脂含量最高为细胞干重的36.72％(见表1)，生物量为0.85g/l。
对比例2：一种利用褪黑素促进高光缺氮胁迫下微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以10g/l葡萄糖为碳源的bg-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜缺氮的bg-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/l作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂：将步骤(1)的诱导藻液置于温度为25℃、光照强度为100μmol·m-2·s-1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。油脂含量最高为细胞干重的51.67％(见表1)，生物量为0.81g/l，高光缺氮条件下的生物量为对比例1的95.29％，而藻细胞油脂含量和油脂产率较对比例1分别增加了1.41和1.35倍。
实施例1：一种利用褪黑素促进高光缺氮胁迫下微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以10g/l葡萄糖为碳源的bg-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的bg-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/l作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制10mmol/l的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤(1)的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为20μmol/l，并置于温度为25℃、光照强度为105μmol·m-2·s-1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。诱导第1天油脂含量达到最高为细胞干重的51.38％(见表1)，生物量为0.83g/l，从表1可知，高光缺氮下，添加20μmol/l褪黑素的生物量达到对比例1的97.65％，生物量为对比例2的1.02倍，藻细胞油脂含量和油脂产率较对比例1分别增加了1.46和1.43倍，较对比例2分别增加了1.04和1.06倍。
实施例2：一种利用褪黑素促进高光缺氮胁迫下微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为24℃条件下，以10g/l葡萄糖为碳源的bg-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的bg-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/l作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制10mmol/l的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤(1)的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为40μmol/l，并置于温度为24℃、光照强度为110μmol·m-2·s-1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。从表1可知，高光缺氮下，添加40μmol/l褪黑素的生物量达到对比例1的98.82％，生物量为对比例2的1.04倍，藻细胞油脂含量和油脂产率较对比例1分别增加了1.35和1.34倍，分别为对比例2的96.05％和99.57％。
实施例3：一种利用褪黑素促进高光缺氮胁迫下微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以10g/l葡萄糖为碳源的bg-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的bg-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/l作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制10mmol/l的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤(1)的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为80μmol/l，并置于温度为26℃、光照强度为115μmol·m-2·s-1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。从表1可知，高光缺氮下，添加80μmol/l褪黑素的生物量仅为对比例1的90.59％，生物量为对比例2的95.06％，藻细胞油脂含量和油脂产率较对比例1分别增加了1.39和1.25倍，分别为对比例2的98.47％和92.57％。
实施例4：一种利用褪黑素促进高光缺氮胁迫下微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以10g/l葡萄糖为碳源的bg-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的bg-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/l作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制10mmol/l的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤(1)的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为20μmol/l，并置于温度为26℃、光照强度为120μmol·m-2·s-1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。从表1可知，缺氮下胁迫下，增加光照至120μmol·m-2·s-1，添加20μmol/l褪黑素的生物量为对比例1的96.47％，生物量为对比例2的1.01倍，藻细胞油脂含量和油脂产率较对比例1分别增加了1.47和1.42倍，分别为对比例2的1.04和1.05倍。
实施例5：一种利用褪黑素促进高光缺氮胁迫下微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以10g/l葡萄糖为碳源的bg-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的bg-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/l作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制10mmol/l的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤(1)的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为10μmol/l，并置于温度为26℃、光照强度为100μmol·m-2·s-1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。从表1可知，高光缺氮下，添加10μmol/l褪黑素的生物量为对比例1的97.65％，生物量为对比例2的1.02倍，藻细胞油脂含量和油脂产率较对比例1分别增加了1.4和1.37倍，分别为对比例2的99.65％和101.67％。
表1不同培养模式下微藻生物量、生物量产率、油脂含量和油脂产率结果
注：mt-褪黑素
异养培养微藻可快速增加微藻生物量，利用光自养诱导异养后的藻细胞积累油脂，发现缺氮条件下可促进藻细胞中油脂的积累，但微藻生长受到抑制；添加适量浓度的外源褪黑素可进一步提高非生物胁迫下藻细胞中油脂的积累，且维持了藻细胞的生长；通过此诱导微藻的方法，既实现了藻细胞中油脂的快速、大量积累，又保证了微藻稳定的生长，可显著提高微藻的油脂产率。但当褪黑素浓度过高时，对微藻有一定的毒害作用，抑制了藻细胞的生长。
以上所述，仅是本发明的较佳案例，并不对本发明做出任何限制，凡是针对本发明技术内容对以上实施案例所做的任何简单修改、变更、模仿均属于本发明技术方案的保护范围。