一种tRNAmu及其在提高链霉菌抗生素产量中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种trnamu-asp-auc及其在提高链霉菌抗生素产量中的应用。

背景技术：

链霉菌是一类商业价值极高的放线菌，链霉菌在其复杂的形态分化过程中所产生的极为丰富的次级代谢产物，目前所发现抗生素，有1/2以上均产自链霉菌，在工、农、医等方面具有重要而广泛的应用价值。

链霉菌中的抗生素基因属于次生代谢产物基因，大部分抗生素基因处于沉默状态，由于密码子的摆动效应，部分次生代谢产物基因能够实现表达，但是产量普遍不高，因此，如何研究出快速高效的提高链霉抗生素产量的方法显得十分重要，目前的常用方法包括两大类：一类是通过理化方法对链霉菌进行诱变，在突变株中筛选高产菌株；一类是通过遗传学方法，对菌株进行遗传改变，提高抗生素的产量。通过理化方法对链霉菌进行诱变已经取得了相当的成绩，得到了大量的高产菌株，但是，这种方法的筛选工作量大，无法准确的获得所需的菌株。随着对细菌基因组研究的深入，用遗传学的方法育种降低操作的盲目性，而且使工作量大大降低。

专利号为201310177365.7，名称为《硫藤黄链霉菌抗生素调控基因及其提高链霉菌抗生素产量的方法》的发明专利中，公开了一种硫藤黄链霉菌抗生素调控基因orf4，还公开了所述基因在制备抗生素高产链霉菌基因突变株中的应用以及一种提高链霉菌抗生素产量的方法。本发明通过使用硫膜黄谜霉菌抗生素调控基因orf4，解决了传统链霉菌胃种的高工作量、高盲目性的问题。

但是由于上述方法均无法从根本解决抗生素基因的沉默问题，所以结果并不理想。本发明提供了一种突变trnamu-asp-auc，将所述trnamu-asp-auc转入天蓝色链霉菌中，能够显著提高十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)和放线菌紫素(actinorhodin)的产量，具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种突变trnamu-asp-auc，所述的trnamu-asp-auc是经过基因突变所得，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

含有所述trnamu-asp-auc的质粒。

含有所述trnamu-asp-auc的细胞株。

所述trnamu-asp-auc在提高链霉菌抗生素产量中的应用。

所述trnamu-asp-auc在提高链霉菌抗生素产量中的应用，所述链霉菌为天蓝色链霉菌。

所述trnamu-asp-auc在提高链霉菌抗生素产量中的应用，所述抗生素为十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)和放线菌紫素(actinorhodin)。

一种可以有效促进链霉菌抗生素合成的表达系统，所述的表达系统包括含有所述trnamu-asp-auc的质粒。

所述的表达系统在提高链霉菌抗生素产量中的应用。

所述的表达系统在提高链霉菌抗生素产量中的应用，所述的链霉菌为天蓝色链霉菌。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种突变的trnamu-asp-auc，所述的trnamu-asp-auc是通过对trna-asp-auc进行基因突变所获得的。所述的trnamu-asp-auc构建的表达系统psh152-erme-promoter-trnamu-asp-auc，转化入天蓝色链霉菌后，相对于原始trna-asp-auc构建的表达系统psh152-erme-promoter-trna-asp-auc，可以产更高产量的十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)和放线菌紫素(actinorhodin)，能够显著的提高链霉菌的抗生素产量。

附图说明

图1转化有原始trna-asp-auc和突变trnamu-asp-auc的天蓝色链霉菌所产的抗生素产量变化

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明中使用的psh152质粒购自于北京合生基因科技有限公司，大肠杆菌jm109购自于北京全式金生物技术有限公司。

下述实施例中用到的培养基：

mm培养基(100ml培养基配方)：黄豆粉2g、甘露醇2g、琼脂2g，ph＝7.2-7.4。

na培养基：蛋白胨10g/l、牛肉粉3g/l、氯化钠5g/l。

lb培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g，5mol/lnaoh调ph至7.0。

实施例一、trnamu-asp-auc序列突变

1.委托上海强耀生物科技有限公司合成trna-asp-auc的序列，trna-asp-auc的原有序列如seqidno:2所示。

aaggctgtagcgcagaggtcgtcgcgcccacgcatcaagctggaggacgtcggttcgaatccgaccggtcttg

2.pcr突变

利用融合pcr对原始trna-asp-auc进行突变：

突变引物pmu1：aaggctgtagcgcagaggtcgtcgcgcccacgcatcaagctggagg

突变引物pmu2:caagaccggtcggattcgaaccgacgtcctccagcttgatgc

取2xmix12.5μl、引物pmu11μl和引物pmu21μl，加水补至25μl。相互作为模板，进行pcr扩增，95℃3min(1个循环)；95℃30s、55℃40s、72℃20s(30个循环)；25℃恒温。

3.突变后的trnamu-asp-auc序列如seqidno:1所示。

aaggctgtagcgcagaggtcgtcgcgcccacgcatcaagtgggaggacgtcggttcgaatccgaccggtcttg。

通过全合成方式直接合成trnamu-asp-auc的序列也是本领域技术人员所能理解的。

实施例2、psh152-erme-promoter-trnamu-asp-auc质粒构建及天蓝色链霉菌的抗生素产量对比

由于突变后的trnamu-asp-auc不能自主进入到链霉菌中促使链霉菌表达抗生素，因此，需要将其插入到psh152载体中，同时，在trnamu-asp-auc序列的前端插入erme-promoter启动子序列，保证trnamu-asp-auc被插入到psh152载体后的能够正常转录，翻译。构建获得的载体为psh152-erme-promoter-trnamu-asp-auc，具体构建方法如下所述：

1.psh152-erme-promoter-trnamu-asp-auc质粒构建

(1)引物构建

引物ph1:ctgttgtgggcacaatcgtgccggttggtagg

引物ph2:acctctgcgctacagccttcgctggatcctaccaacc

引物ph3:ccagcgaaggctgtagcgcagaggtcgtcgc

引物ph4:caagaccggtcggattcgaaccgacgtcc

(2)pcr扩增

取2xmix12.5μl、引物ph11μl和引物ph21μl，加水补至25μl。相互作为模板，进行pcr扩增，95℃3min(1个循环)；95℃30s、55℃40s、72℃20s(30个循环)；25℃恒温。

取2xmix12.5μl、引物ph31μl和引物ph41μl，加水补至25μl。相互作为模板，进行pcr扩增，95℃3min(1个循环)；95℃30s、55℃40s、72℃20s(30个循环)；25℃恒温。

取2xmix12.5μl、引物ph11μl和引物ph41μl，加水补至25μl，以ph11μl和引物ph21μl以及引物ph31μl和引物ph41μl扩增产物为模板，进行pcr扩增，95℃3min(1个循环)、95℃30s、55℃40s、72℃20s(30个循环)、25℃恒温，扩增出113bp的片段，所述的片段的核苷酸序列如下：

ctgttgtgggcacaatcgtgccggttggtaggatccagcgaaggctgtagcgcagaggtcgtcgcgcccacgcatcaagtgggaggacgtcggttcgaatccgaccggtcttg

(3)酶切

取buffer3μl、psh152质粒26μl、ecorv1μl；在37℃下跑电泳1h、切胶回收，利用碱性磷酸酶对酶切后的质粒去磷酸化，备用。

取buffer3μl、t4dna连接酶1μl、去磷酸化后的psh152质粒5μl和扩增出的片段21μl；20℃连接2h，最终形成psh152-erme-promoter-trnamu-asp-auc载体。

2.质粒转化

(1)大肠杆菌转化

将连接好的psh152-erme-promoter-trnamu-asp-auc载体取10μl加入大肠杆菌jm109感受态中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，加入lb培养基孵育1h后，在含有安普霉素的培养基上培养。

(2)天蓝色链霉菌转化

将链霉菌在mm培养基(黄豆粉2g、甘露醇2g、琼脂2g，ph＝7.2-7.4)中培养至孢子成熟。用10mlpbs重悬单个培养皿中的成熟孢子。取1ml的重悬液放置于50℃水浴热激10min，然后迅速放入冰中5min。

加入4mlna培养基，于30℃下对孢子预萌发培养3小时。加入含有目标结合质粒psh152-erme-promoter-trnamu-asp-auc的大肠杆菌jm109与孢子30℃下混合静置培养1小时。在含有40ug/ml萘啶酮酸和载体上对应的抗生素的mm培养基上涂布混合的液体。30℃下培养至单菌落长出。

按照上述相同的方法制备psh152-erme-promoter-trna-asp-auc载体，并将psh152-erme-promoter-trna-asp-auc载体转化至天蓝色链霉菌中，作为对照。

3.抗生素产量测定方法

将转化的菌株在含有250mmkcl的na培养基上培养，待抗生素产出后加入1nhcl将培养的上清液ph调节至2-3。利用1/2体积的甲醇:氯仿(1:1)混合液对actinorhodin萃取。萃取后在542nm下检测光吸收值对放线菌紫素(actinorhodin)进行定量。利用含有250mmkcl的na培养基对天蓝色链霉菌进行培养，待抗生素产出后加入0.5mhcl以及等体积的甲醇进行萃取。在530nm下检测光吸收值对十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)进行定量。

4.抗生素产量比较

图1的实验结果显示，将本发明所述的突变trnamu-asp-auc转化至天蓝色链霉菌中，转化后的天蓝色链霉菌所产的抗生素十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)和放线菌紫素(actinorhodin)的产量显著提高，其中，十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)的产量提高最显著。在第3天，转化有突变trnamu-asp-auc的天蓝色链霉菌十一烷基灵菌红素萃取物的光吸收值高达0.362，而转化有原始trna-asp-auc的天蓝色链霉菌光吸收值仅为0.226。第5天时，转化有突变trnamu-asp-auc的天蓝色链霉菌十一烷基灵菌红素萃取物的光吸收值高达0.517，而转化有原始trna-asp-auc的天蓝色链霉菌光吸收值仅为0.419(光吸收值与十一烷基灵菌红素含量呈线性正相关关系)。相对于原始trna-asp-auc，突变后的trnamu-asp-auc-asp-auc能够更为显著地提高链霉菌地抗生素含量。

同时，本发明还提供了一种产十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)和放线菌紫素(actinorhodin)的产量更高的表达系统psh152-erme-promoter-trnamu-asp-auc，所述的表达系统中包含有trnamu-asp-auc。

综上所述，向不含有trnamu-asp-auc的链霉菌中转化trnamu-asp-auc，可以显著提高链霉菌的抗生素含量，因此trnamu-asp-auc具有显著促进天蓝色链霉菌抗生素的合成的功能。由于天蓝色链霉菌为链霉菌属的模式菌株，因此，trnamu-asp-auc还能够提高其他链霉菌的抗生素含量，这是本领域技术人员可以理解的。

序列表

<110>中国科学院寒区旱区环境与工程研究所

<120>一种trnamu及其在提高链霉菌抗生素产量中的应用

<141>2019-06-04

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>73

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

aaggctgtagcgcagaggtcgtcgcgcccacgcatcaagtgggaggacgtcggttcgaat60

ccgaccggtcttg73

<210>2

<211>73

<212>dna

<213>streptomyceslinzensis

<400>2

aaggctgtagcgcagaggtcgtcgcgcccacgcatcaagtgggaggacgtcggttcgaat60

ccgaccggtcttg73