一种与大豆植株分枝数显著相关的InDel标记及其应用的制作方法

本发明涉及遗传育种
技术领域：
，具体涉及一种与大豆植株分枝数显著相关的indel标记以及鉴定大豆植株分枝数多少的方法。
背景技术：
：大豆是世界上最重要的一种油料经济作物，同时也是最大的食用油和蛋白的来源。随着对大豆需求的增长，利用大豆品种的遗传改良来提高大豆产量将变得越来越重要。优化植株形态结构、培育具有最优分枝的大豆品种是植物育种家一直追求的育种目标。常规育种年限长、效率低且成本高，而分子标记反映生物个体基因组dna片段的差异，直接反应种质资源本质，具有高效、准确以及经济等优点，大幅缩短育种周期，是传统育种技术的有力补充snp分子标记具有数量多、遗传稳定等优点，基于酶切扩增多态性序列标记技术(caps)的snp分子标记检测方法，主要是将pcr扩增产物中含snp位点的dna片段进行限制性酶切分析，是snp分子标记的检测方法之一。indel标记是由插入/缺失位点两侧的基因序列所设计的特异性引物，根据pcr产物片段大小可直接快速的进行检测，具有准确性高、稳定性好以及成本低等优势。indel标记相比较与caps标记来说，耗时短、成本低及操作简便。目前已广泛应用于植物种质资源分析及分子标记辅助育种。大豆植株分枝数是影响大豆品质的重要组分因素，而现有技术中并未见报道可对大豆植株分枝数多少进行有效判断的分子生物学方法；而现有技术中，虽然存在对大豆植株其它性状进行分子筛选的方法，但是多数存在筛选技术不稳定、时间长、技术繁琐等问题。因此，如何避免上述风险，是急需解决的技术问题。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种与大豆植株分枝数显著相关的indel标记及其应用，以解决现有技术中不存在对大豆植株分枝数多少有效筛选、筛选技术时间长等技术问题。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明提供了一种与大豆植株分枝数显著相关的indel标记，所述indel标记的核苷酸序列具体如seqidno.1：tgtctgtgaagt。本发明还提供一种上述的indel标记在鉴定大豆植株分枝数中的应用。本发明还提供一种用于扩增上述indel标记的引物对，所述引物对的序列具体为：1f：gcaaatctgtctgtgaagtacgseqidno.21r：tatccgaattgcaaaagcgcaseqidno.3。本发明还提供一种上述的引物对在鉴定大豆植株分枝数中的应用。本发明还提供一种双引物对快速鉴定大豆植株分枝数多少的方法，该方法包括以下步骤：步骤1、设计鉴定待测大豆基因组dna是否有缺陷的引物对2f：gtgtcattcctggcatacaaaagtseqidno.42r：taatgcctcctgccctgttgseqidno.5步骤2、提取待测大豆基因组dna步骤3、以seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5所述的序列为引物，对步骤2提取的待测大豆基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物步骤4、对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物仅含1条主带，则对应待测大豆dna没问题且植株分枝数多；若扩增产物包含两条主带，则对应待测大豆dna没问题且植株分枝数少。进一步，步骤3中pcr扩增体系为：2.0μl100ng/μl的模板dna、10μm的引物各1.0μl，1.0uprimestarmax酶12.5μl，ddh2o8.5μl；反应条件为：94℃变性2min，98℃变性10s，62℃,降落-0.2℃，退火15s，72℃延伸19s，共循环38次；最后72℃延伸8min，4℃保存。本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种与大豆植株分枝数显著相关的indel标记及其应用，其中：(1)本发明采用双引物对对待测大豆基因组dna进行pcr扩增，实现了同步筛选无缺陷大豆基因组dna和鉴定被测大豆分枝数多少的目的，降低了筛选时间，提高了筛选效率和筛选准确率；(2)本发明的分子标记可以筛选分枝数多和分枝数少的大豆材料，为优化植株形态结构、培育最优分枝的大豆品种提高了方法基础，为了提高大豆产量，在大豆遗传改良中具有重要的作用。附图说明图1为实施例中扩增产物琼脂糖电泳图，m为2kmarker，编号1-12为分枝数少的材料，编号13-24为分枝数多的材料,第一条带为601bp,用来验证dna的有效性，第二条带为401bp，是显性分子标记。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本实施例中，选用1600份全国大豆种质资源精准鉴定(中国农业科学院作物科学研究所提供)中植株分枝数多的品种12份，植株分枝数少的品种12份，共24份材料，详细材料清单如附表1。编号12345678名称黑河13glacier黑河26黑河23垦丰20黑河43号永丰豆黑生101编号910111213141516名称mn0201黑河9号黑河13哈13-2185彭县绿豆气死洼华夏1号崖州黑豆编号1718192021222324名称湘春豆10茶山黑豆rhodes小黑豆白荚子古黄豆－482-16六月忙-3表1本实施例中，对上述24份材料进行提取基因组dna操作针对本发明提出的indel标记seqidno.1tgtctgtgaagt，设计用于鉴定seqidno.1(本发明针对的indel标记位于大豆基因组dna启动子中，以起始密码子atg为位置0，该indel的位置是：-2743～-2732)的引物对1f：gcaaatctgtctgtgaagtacgseqidno.21r：tatccgaattgcaaaagcgcaseqidno.3为了避免在对待测大豆基因组dna进行pcr扩增时，提取的待测大豆基因组dna因存放时间久、提取过程被污染等因素导致提取的待测大豆基因组dna存在问题，设计一对引物对，对其进行鉴定，该引物对如下：2f：gtgtcattcctggcatacaaaagtseqidno.42r：taatgcctcctgccctgttgseqidno.5为了实现快速检测与鉴定大豆分枝数的多少，本实施例中，采用上述两对引物对对提取的待测大豆基因组dna进行pcr扩增；pcr扩增体系为：2.0μl100ng/μl的模板dna、10μm的引物各1.0μl，1.0uprimestarmax酶12.5μl，ddh2o8.5μl；反应条件为：94℃变性2min，98℃变性10s，62℃,降落-0.2℃，退火15s，72℃延伸19s，共循环38次；最后72℃延伸8min，4℃保存。获得扩增产物对扩增产物进行琼脂糖电泳，其结果如图1。由图1，可得扩增产物仅含1条主带的(其核苷酸序列如seqidno6，用于验证被测大豆基因组dna是否存在缺陷，若能够扩增出该条主带，则对应被测大豆基因组dna没问题)，对应的待测大豆dna没问题且对应植株分枝数为多(结合图1，可以得出，扩增产物仅为一条主带的均为编号13-24分枝数多的材料)；扩增产物包含两条主带的(其序列分别为seqidno.6、seqidno.7，seqidno.6可以验证待测大豆dna没问题，seqidno.7则用于验证大豆分枝数的多少)，对应的待测大豆dna没问题且对应植株分枝数少(结合图1，可以得出，扩增产物为两条主带的均为编号1-12分枝数少的材料)。将表1中的大豆在2017年及2018年分别种植，并统计相应植株分枝数平均值，其结果如表2表2选择的20份栽培大豆植株分枝数平均值表2对表2中选择的24份栽培大豆植株分枝数方差进行分析，分析结果如表3表3由表3可知，2017、2018年研究选用12份分枝数少的品种，mean±sd分别为0.4208±0.30321％、0.4892±0.23693％，标准误(se)分别为为0.08753、0.06840；12份分枝数多的品种mean±sd分别为9.0083±2.30145％、8.1325±1.38772％，标准误(se)分别为0.66437、0.40060。结合图1和表3中2017年、2018年p＝0.000方差分析结果表明，大豆植株分枝数多少与所述基因(seqidno.1所示核苷酸序列)表现为极显著相关，本发明提供的indel标记为一种新的鉴定大豆分枝数多少的显性分子标记，能够方便、有效、稳定、准确的鉴定出大豆植株分枝数多与分枝数少，利用本发明的分子标记可以筛选分枝数多和分枝数少的大豆材料，为优化植株形态结构、培育最优分枝的大豆品种提高了方法基础，为了提高大豆产量，在大豆遗传改良中具有重要的作用。序列表<110>安徽农业大学<120>一种与大豆植株分枝数显著相关的indel标记及其应用<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>12<212>dna<213>大豆(glycinemax)<400>1tgtctgtgaagt12<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(syntheticsequence)<400>2gcaaatctgtctgtgaagtacg22<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(syntheticsequence)<400>3tatccgaattgcaaaagcgca21<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(syntheticsequence)<400>4gtgtcattcctggcatacaaaagt24<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(syntheticsequence)<400>5taatgcctcctgccctgttg20<210>6<211>601<212>dna<213>大豆(glycinemax)<400>6gtgtcattcctggcatacaaaagtaaaacaaactctaatgtctggcacttttattgacag60ataatagtggcagaggtagcaactttctgatggaattgacttcatacccaaagcttagtc120tgagaaattcacttccaactcctagatcatctgagctagctcctggaaatcaaacctcca180cacttagctggaatggcaactcagagacatcatctgaccttttcttgcaaggttcggtgg240gtgggacaagcttcgccagcccgggacatcctccaggggaaagttacattggggtcaccg300acacgagctgtgctctctctcttctgtcaaatcaaacatggggttctagaaacacagcac360caagtcttgggttgagtaacatgataaatttcaacgggacacccttgacacaacttgctg420catcatctcatggtgcatcaatccatcaacttccaaatacctcgtggtttttcaagggca480ttgattctggtaactgttcgcccgaggtggtccctgatctaggtctcggtcagatttcac540agcctctcaatagccaacttcatggtgagctggacctgtcccaacagggcaggaggcatt600a601<210>7<211>401<212>dna<213>大豆(glycinemax)<400>7gcaaatctgtctgtgaagtacgtaaactttgtggatattaagtctttttttaaagtttat60gtagttatattgagtttttgagttcataaattcttgaatttgattgactttatttatgga120ctcgtaaattatttatttaaattatttaagtttgatgtgtaagtaattttaattgcttat180gttaagattttgatttttaatttaggttgttatcgttaaattgtgatgtttaaaatattg240atatattttagtgtgatagattttagctttaaaaatgaagttaatttttcttcttctaat300tttatacactttttttacttttttaaaaatattttttnttcaaattactacttaatttca360tggattgattcatttattcatgcgcttttgcaattcggata401当前第1页12