一种鉴定NWB细胞质雄性不育的分子标记的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种鉴定nwb细胞质雄性不育的分子标记。

背景技术：

萝卜(raphanussativusl.)是原产于我国的一种重要蔬菜，年栽培面积1800万亩，占我国蔬菜面积的6％。萝卜是异花授粉作物，具有明显的杂种优势，自交不亲和系和雄性不育系是萝卜杂种优势利用的两种途径。由于细胞质雄性不育系(cms)不仅可以提高杂交种子纯度，而且可有效遏制有益基因资源的流失，保护育种家权益，正在逐步取代自交不亲和系，成为萝卜杂种优势利用的主要方法。目前所发现的细胞质雄性不育中，ogura-cms的利用最为广泛，但在一些萝卜品种(如心里美)中缺乏对ogura-cms的保持基因，限制了该不育源的利用。

2003年韩国农友种苗有限公司(nongwoobioco.)发现了新的细胞质雄性不育源－nwb-cms，该不育源具有配合力高、不育性易保持、制种产量高等优点，利用该不育源育成的萝卜品种长期垄断我国的种子市场。nwb-cms是目前最具应用潜力的萝卜细胞质雄性不育源。nahm等(nahmsh,leehj,leesw,joogy,harnch,yangsg,minbw,2005,developmentofamolecularmarkerspecifictoanovelcmslineinradish(raphanussativusl).theorapplgenet,111:1191–1200)开发了鉴定nwb-cms的特异分子标记atp6-nad3。但之后的研究表明，除nwb-cms外，该标记在大部分萝卜种质中均有扩增，只是阳性条带的扩增强度存在差异，这可能是由于复杂的线粒体片段化学计量引起的(leeyp,parks,limc,kimh,limh,ahnys,sungsk,yoonmk,kims,2008,discoveryofanovelcytoplasmicmale-sterilityanditsrestorerlinesinradish(raphanussativusl.),theorapplgenet117:905–913)。因此，继续寻找nwb-cms特异的分子标记，有助于推动该不育源在萝卜育种中的快速应用，对促进萝卜杂种优势的利用具有重要的理论意义和应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鉴定nwb细胞质雄性不育的分子标记。

第一方面，本发明要求保护一种用于鉴定或辅助鉴定待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状的引物对。

本发明所要求保护的用于鉴定或辅助鉴定待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状的引物对，可为如下任一：

(a)由seqidno.1和seqidno.2所示的两条单链dna组成的引物对；

(b)由将seqidno.1和seqidno.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链dna分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对；

(c)根据seqidno.3设计得到的引物对。

第二方面，本发明要求保护一种用于鉴定或辅助鉴定待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状的分子标记。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状的分子标记，为以具有nwb细胞质雄性不育性状的萝卜品种(如圆白a)的基因组dna作为模板，以由seqidno.1和seqidno.2所示的两条单链dna组成的引物对进行pcr扩增，所得的扩增产物。

进一步地，所述分子标记的核苷酸序列具体为seqidno.3。

第三方面，本发明要求保护一种用于鉴定或辅助鉴定待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状的试剂盒。

本发明所要求保护的用于鉴定或辅助鉴定待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状的试剂盒，含有前文第一方面中所述的引物对，还可含有常规pcr反应试剂。

第四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的引物对或前文第二方面中所述的分子标记或前文第三方面中所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状中的应用。

第五方面，本发明要求保护一种鉴定或辅助鉴定待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状的方法。

本发明所要求保护的鉴定或辅助鉴定待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状的方法，可为如下方法a或方法b：

所述方法a可包括如下步骤：

(a1)以待测萝卜的基因组dna作为模板，以由seqidno.1和seqidno.2所示的两条单链dna组成的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；

(a2)根据所述扩增产物，按照如下确定所述待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状：如果所述扩增产物中含有大小为1058bp的dna片段，则所述待测萝卜具有或候选具有nwb细胞质雄性不育性状；反之，则所述待测萝卜不具有或候选不具有nwb细胞质雄性不育性状。

其中，所述大小为1058bp的dna片段的核苷酸序列具体如seqidno.3所示。

所述方法b可包括如下步骤：

(b1)检测待测萝卜的基因组dna中是否含有seqidno.3所示dna片段；

(b2)根据步骤(b1)的检测结果，按照如下确定所述待测萝卜是否具有nwb细胞质雄性不育性状：如果所述待测萝卜的基因组dna中含有seqidno.3所示dna片段，则所述待测萝卜具有或候选具有nwb细胞质雄性不育性状；反之，则所述待测萝卜不具有或候选不具有nwb细胞质雄性不育性状。

进一步地，步骤(b1)中，所述“检测待测萝卜的基因组dna中是否含有seqidno.3所示dna片段”可通过任何能够达到该目的的技术手段来实现，如直接测序或者pcr扩增等。在本发明的具体实施方式中，具体是按照如下方法检测所述待测萝卜的基因组dna中是否含有seqidno.3所示dna片段的：以所述待测萝卜的基因组dna作为模板，以由seqidno.1和seqidno.2所示的两条单链dna组成的引物对进行pcr扩增；如果所述扩增产物中含有seqidno.3所示dna片段，则所述待测萝卜的基因组dna中含有seqidno.3所示dna片段；如果所述扩增产物中不含有seqidno.3所示dna片段，则所述待测萝卜的基因组dna中不含有seqidno.3所示dna片段。

在上述各方面中，所述待测萝卜即可以为具有nwb细胞质雄性不育性状的萝卜品种，也可以为不具有nwb细胞质雄性不育性状的萝卜品种。

在本发明的具体实施方式中，所述具有nwb细胞质雄性不育性状的萝卜品种具体为圆白a、世农cr301或者世农cr501。所述不具有nwb细胞质雄性不育性状的萝卜品种为具有正常可育细胞质的萝卜品种或者具有ogura细胞质雄性不育性状的萝卜品种，具体品种见实施例。

第六方面，本发明要求保护前文所述的引物对或分子标记或试剂盒或方法在萝卜育种中的应用。

实验证明，利用本发明所提供的nwb细胞质雄性不育萝卜特异性分子标记及其开发出的特异性扩增引物可以实现对nwb细胞质雄性不育萝卜的特异性检测。本发明有助于推动该不育源在萝卜育种中的快速应用，对促进萝卜杂种优势的利用具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1为9对候选nwb-cms特异引物特异性检测结果。注：其中marker条带从上到下大小依次为：2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp。白色三角标识的是2份nwb-cms类型材料世农cr301和世农cr501。另外4份具有正常可育细胞质或ogura-cms类型不育萝卜材料顺序依次是二年子、汉白玉、七星和荷兰红星。

图2为ns4-2引物对在60份自然群体材料中的特异性验证结果。注：60份自然群体材料名称从上到下从左到右(即泳道1-60)依次是二年子、yr天狗、圆白a、世农cr301、世农cr501、新关、美浓、白首宫重大长、秋大根、广州白沙短叶十三号、象牙白、打木源助、耐病总太、关白、青首宫重丸、新八洲、夏季、圣护院、银玉白萝卜、和歌山、白玉春、汉白玉、玉山白雪、七星、满堂红、欧雅2号、赛梨、天津卫青、郑禧991、沙窝青、浙大长、南畔洲、白凤、扬州圆白、马耳萝卜、甜晶白叶萝卜、广东春不老南州、长春大型纯萝卜、顶级雪丽、春雷、抗病博士、雪单3号、棒棰红、荷兰红星、樱桃萝卜、京红4号、京脆1号、红丰1号、绿星大红、胭脂红萝卜、西南红帅、成都满身红萝卜、板叶满身红、四季满身红萝卜、夏播王萝卜、双红一号、五樱萝卜、大红萝卜、红宝、七叶红，其中3份nwb-cms类型用白色三角标注。marker条带从上到下大小依次为：2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

萝卜圆白a和圆白b：均由北京市农林科学院蔬菜研究中心育成。圆白b来源于江苏地方品种扬州圆白，是经过6代自交获得的优良自交系；细胞质雄性不育系圆白a(nwb-cms)，是以世农cr301(nwb-cms类型)为不育源作母本，以圆白b为父本，经过连续6代回交转育育成的优良不育系。

萝卜世农cr301和世农cr501：世农cr301和世农cr501是公知的301a类型萝卜品种；根据“萝卜雄性不育细胞质的鉴定与分类，华北农学报，2014，29(5)：125-129”一文可知301a为nwb-cms类型，因此，世农cr301和世农cr501均为nwb-cms类型。

实施例中所涉及的各品种萝卜均可从商业途径获得，具体信息如下(产品目录号即品种名称)：二年子(日本丸种株式会社)、yr天狗(日本泷井种苗株式会社)、圆白a(北京市农林科学院蔬菜研究中心)、圆白b(北京市农林科学院蔬菜研究中心)、世农cr301(北京世农种苗有限公司)、世农cr501(北京世农种苗有限公司)、新关(日本泷井种苗株式会社)、美浓(日本泷井种苗株式会社)、白首宫重大长(日本太田种苗)、秋大根(日本泷井种苗株式会社)、广州白沙短叶十三号(柳州市兴旺蔬菜良种经营部)、象牙白(天津蓟县京津蔬菜种苗)、打木源助(日本泷井种苗株式会社)、耐病总太(日本泷井种苗株式会社)、关白(日本泷井种苗株式会社)、青首宫重丸(日本太田种苗)、新八洲(日本泷井种苗株式会社)、夏季(北京东方九龙种业有限公司)、圣护院(日本泷井种苗株式会社)、银玉白萝卜(河北邢台大力种苗)、和歌山(日本泷井种苗株式会社)、白玉春(北京中川绿禾农业科技有限公司)、汉白玉(北京世农种苗有限公司)、玉山白雪(北京世农种苗有限公司)、七星(天津科润农业科技股份有限公司)、满堂红(莱阳华绿种苗有限公司)、欧雅2号(欧兰德种业有限公司)、赛梨(哈尔滨万利达种业)、天津卫青(天津优先达种子有限公司)、郑禧991(郑州郑研种苗科技有限公司)、沙窝青(天津先优达种子有限公司)、浙大长(杭州科丰种子有限公司)、南畔洲(汕头市金韩种业有限公司)、白凤(福建省漳州市农得利种业有限公司)、扬州圆白(安徽省华禾种业有限公司)、马耳萝卜(汕头市金韩种业有限公司)、甜晶白叶萝卜(重庆市永川区优兵蔬菜种苗有限责任公司)、广东春不老南州(新余市常青种业)、长春大型纯萝卜(先正达韩国种子公司)、顶级雪丽(北京吉利德丰种子有限公司)、春雷(北京丰桥国际种子有限公司)、抗病博士(北京百慕田种苗有限公司)、雪单3号(湖北省农业科学院)、棒棰红(山东昌邑隆达种业有限公司)、荷兰红星(北京拓新逸达科技有限公司)、樱桃萝卜(天津蓟县良丰蔬菜种子站)、京红4号(京研益农(北京)种业科技有限公司)、京脆1号(京研益农(北京)种业科技有限公司)、红丰1号(沈阳市农科院)、绿星大红(沈阳绿星种苗有限公司)、胭脂红萝卜(四川省绵阳市农兴种业)、西南红帅(四川省绵阳市城区农达牌蔬菜)、成都满身红萝卜(四川省绵阳市农兴种业)、板叶满身红(四川种都种业有限公司)、四季满身红萝卜(四川省绵阳市南峰蔬菜研究所)、夏播王萝卜(山东省新泰市蔬菜种苗研究中心)、双红一号(武汉市蔬菜科技发展总公司)、五樱萝卜(江苏睢宁县古邳蔬菜良种站)、大红萝卜(沈阳丰华种业有限公司)、红宝(武汉市蔬菜科技发展总公司)、七叶红(武汉宏达种苗有限公司)。

实施例1、鉴定nwb细胞质雄性不育的分子标记的开发与利用

一、鉴定nwb细胞质雄性不育的引物筛选和分子标记的确定

通过对细胞质雄性不育系圆白a(nwb-cms)及其保持系圆白b进行线粒体基因组测序，获得了线粒体基因组的序列，然后进一步对两者线粒体基因组序列比对，发现圆白a(nwb-cms)含有11个特异片段。并根据特异片段设计得到9对引物，如表1所示。

表1候选nwb-cms特异引物信息

注：“位置”一栏是在圆白a线粒体基因组中的位置。

然后，以nwb-cms类型雄性不育材料及其他类型不育材料或者可育材料为模板进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定nwb细胞质雄性不育特异的分子标记。利用6份材料，包括2份nwb-cms类型材料(世农cr301和世农cr501)以及4份可育或ogura-cms类型材料(二年子、汉白玉、七星和荷兰红星)对表1中9对候选nwb-cms特异引物进行特异性检测。具体操作如下：提取各供试萝卜的基因组dna，以其为模板，分别以表1中的9对引物进行pcr扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示只有ns4-2(1058bp)在nwb-cms类型材料中呈现特异性(图1)。

因此，确定本发明中用于特异性鉴定萝卜nwb细胞质雄性不育的引物对ns4-2，具体序列如下：

ns4-2-f：5’-aatcgtgtggtagtaagaaaagggt-3’(seqidno.1)；

ns4-2-r：5’-ggtttggctaggtaacataatggc-3’(seqidno.2)。

理论扩增产物大小为1058bp，其核苷酸序列如seqidno.3所示。seqidno.3所示dna片段即为本发明所开发的用于特异性鉴定萝卜nwb细胞质雄性不育的分子标记。

二、鉴定nwb细胞质雄性不育的实际应用

为进一步对本发明ns4-2引物对的特异性进行验证，接下来利用ns4-2引物对在60份自然群体材料中进行扩增检测。

供试萝卜品种：

(1)3份nwb-cms类型材料：圆白a、世农cr301和世农cr501；

(2)43份具有正常可育细胞质材料：二年子、yr天狗、新关、美浓、白首宫重大长、秋大根、广州白沙短叶十三号、象牙白、打木源助、耐病总太、关白、青首宫重丸、新八洲、夏季、圣护院、银玉白萝卜、和歌山、七星、满堂红、赛梨、天津卫青、郑禧991、沙窝青、浙大长、南畔洲、扬州圆白、马耳萝卜、甜晶白叶萝卜、广东春不老南州、长春大型纯萝卜、棒棰红、荷兰红星、樱桃萝卜、京脆1号、胭脂红萝卜、西南红帅、成都满身红萝卜、板叶满身红、四季满身红萝卜、夏播王萝卜、五樱萝卜、大红萝卜、七叶红；

(3)14份ogura-cms类型材料：白玉春、汉白玉、玉山白雪、欧雅2号、白凤、顶级雪丽、春雷、抗病博士、雪单3号、京红4号、红丰1号、绿星大红、双红一号、红宝。

pcr反应体系(50μl)：基因组dna8μl；上下游引物各1μl；taqmastermix(2x)25μl；ddh2o15μl。

pcr反应条件：94℃5min；94℃30s,56℃30s,72℃1min10s(35个循环)；72℃10min。

结果如图2所示，可见：ns4-2引物对仅在3份nwb-cms类型材料中扩增出1058bp的特异片段(seqidno.3)，而在其他57份可育或ogura-cms类型材料中均未扩增出1058bp的特异片段。这一结果再一次证实ns4-2引物对可以特异性的鉴定萝卜的nwb细胞质雄性不育。

<110>北京市农林科学院

<120>一种鉴定nwb细胞质雄性不育的分子标记

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