基于重叠延伸PCR的抗结核药物耐药性检测方法与流程

本发明属于基因技术领域，涉及一种基于重叠延伸pcr的一次检测三种抗结核药物耐药性的方法。

背景技术：

结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)引起的慢性传染病，是一种严重危害人类身体健康的重大公共卫生问题。近年来，结核分枝杆菌耐药性情况逐步恶化，耐药结核疫情形势十分严峻，所以耐药结核病诊断的重要性日益突出。虽然基于培养的方法仍然是诊断耐药结核的金标准，但是传统药敏实验检测mtb耐药性耗时长达数周，延误患者治疗并可能导致新的耐药产生，耗费人力，并可能给实验室工作人员带来严重的生物危害。因此对结核患者耐药性的快速诊断日益受到重视。

快速基因型耐药检测方法可以减少到几个手工步骤，更适合即时检测，这可以显著扩大其在医疗服务不足人群中的应用。目前国内外应用比较多的基因型耐药检测方法主要有实时荧光pcr法、线性探针杂交法和基因芯片法。这些基因型耐药检测方法原理都是基于mtb基因序列突变与其对各种药物耐药相关性的研究。多项研究表明，大多数情况下mtb对主要的抗tb药物耐药主要与六个基因和启动子区中的约25个突变相关联。大约90％的异烟肼耐药情况可以检测到katg基因密码子315和inha启动子-8至-15位核苷酸的突变。大约90％的氟奎诺酮类耐药情况可以检测出现gyra基因密码子88至94的突变，gyrb基因密码子500和538到540的突变占较少百分比的病例。在rrs基因1401和1402位点的突变可鉴定大约80％的阿米卡星耐药病例，相同rrs突变加上eis启动子-8至37位核苷酸的突变一约80％的卡那霉素耐药性相关。有47％-89％乙胺丁醇耐药的mtb存在阿拉伯糖转移酶编码基因embb基因306位密码子突变。

基于实时荧光pcr的方法中，主要有genexpertmtb/rif和熔解曲线分析法。然而，genexpertmtb/rif测定的耐药性部分仅提供有关利福平耐药的信息，因为它难以在单个反应管中检测6个独立基因或启动子区域所有与临床耐药相关的突变。熔解曲线分析法主要缺点是多个反应探针的熔解曲线峰存在重叠，这增加了熔解曲线分析的复杂性；另外信号灵敏度相对较低。线性探针和基因芯片技术对mtb的耐药性的检测，操作也比较繁琐。这几类方法与genexpertmtb/rif检测类似，一个试剂盒只能检测一种药物的耐药性。

综上分析，这些基因型耐药检测方法具高效、快速等检测优点，可快速诊断结核病及其部分耐药情况，但因其检测费用相对高昂。昂贵的价格在贫困地区造成患者经济负担加重。还存在少部分检测结果与测序结果不相符的情况，在耐药相关基因编码区中探针结合位点存在同义突变的情况下，出现错误的假性耐药结果。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重叠延伸pcr的一次检测三种抗结核药物耐药性的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、检测引物，包括以结核分枝杆菌标准株h37rv的dna序列为模板，设计rpob、embb、katg基因和inha启动子四个包含耐常见药突变位点的片段pcr引物，具体如下：

rpobf：5'-gtacggtcggcgagctgatcca-3'，如seqidno.1所示；

rpobr：

5'-caccgggtgcacgtcgcggacctccagcccggcacgctcacgtgacagac-3'，如seqidno.2所示；

embf：5'-ggaggtccgcgacgtgcacccggtgatattcggcttcctgctc-3'，如seqidno.3所示；

embr：5'-acggaagggatcctccgggctgccgaaccagcggaaatagttgga-3'，如seqidno.4所示；

katf：5'-cggcagcccggaggatcccttccgtatggcaccggaaccggtaa-3'，如seqidno.5所示；

katr：

5'-acgcaagcgccagcagggctcttcgtcagctcccactcgtagccgtaca-3'，如seqidno.6所示；

inhf：

5'-gacgaagagccctgctggcgcttgcgtaaccccagtgcgaaagttcccg-3'，如seqidno.7所示；

inhr：5'-ggactgaacgggatacgaatgg-3'，如seqidno.8所示。

作为优选的技术方案之一，三对重叠延伸引物的设计方法为：rpobr和embf之间，embr和katf之间，katr和inhf之间5'端分别含有一段25bp至27bp的重叠互补序列，且三段重叠互补序列互不相同。

2、试剂盒，包括上述检测引物，其中各引物的浓度比为rpobf：rpobr：embf：embr：katf：katr：inhf：inhr＝100：5：1：5：5：1：5：100至60：2：2：1：1：2：2：60之间，选择最优比例为30：1：1：1：1：1：1：30；rpobf和inhr终浓度为0.5～1.0μm。

3、上述检测引物或试剂盒在抗结核药耐药性检测中的应用。

4、利用上述检测引物或试剂盒实现的基于重叠延伸pcr的抗结核药物耐药性检测方法，具体步骤如下：

(1)dna提取：提取结核分枝杆菌的dna作为模板；

(2)构建pcr反应体系：

10×buffer5.0μl，

dntps1.0μl(2.5mmeach)，

热启动taq酶0.2μl(5u/μl)，

引物混合物5μl(rpobf和inhr浓度10μm，引物按上述比例混合)，

模板dna5μl，

加水总共到50μl。

(3)pcr反应；

(4)测序分析：对rpob-embb-katg-inha融合片段进行测序，测得序列与标准株h37rv的dna序列进行对比分析，获得氨基酸序列及相关耐药突变信息。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，dna提取的具体方法是：取结核分枝杆菌用dna提取试剂盒，按说明书操作，或者用煮沸法，提取样品的dna作为模板。

作为优选的技术方案之一，步骤(3)中，利用abi7500实时荧光定量pcr仪(可设置touchdown退火温度的普通)进行pcr反应，具体过程如下：第一步：95℃5分钟；第二步：95℃10秒；第三步：68℃，每个循环降低0.5℃，10秒，第四步：72℃30秒，第二步至第四步循环30次；第五步：95℃10秒，第六步：59℃10秒，第七步：72℃30秒，第五步至第七步循环40次。

作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，利用核苷酸序列如测序引物seqidno.9所示tbseq对rpob-embb-katg-inha融合片段进行测序；

tbseq：5'-accagatccgggtcggcatg-3'，如seqidno.9所示。

本发明的有益效果在于：

本发明采用重叠延伸pcr法，在单管中将rpob、embb、katg基因和inha启动子的四个耐药相关片段连接扩增为一个约700bp长的融合片段，并只需一次测序反应得到四个片段的耐药突变信息，从而获知某结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、乙胺丁醇这三种一线抗结核药的耐药情况。用该方法检测临床标本100例以上，与培养法药敏试验、genexpert对比验证结果的可靠性。该方法在临床上推广应用将极大地降低检测成本，减轻患者经济负担并产生良好的社会效益。简单来说，利用单管pcr扩增rpob-embb-katg-inha融合片段进行测序从而检测抗结核一线三种药物(利福平、异烟肼和乙胺丁醇)耐药情况的方法，为临床耐药结核的检测减轻经济负担并提高检测准确性，方法简便，准确，成本低。

本发明在单管中将rpob、embb、katg基因和inha启动子这四个耐药相关片段连接扩增为一个约700bp长的融合片段。融合片段可送测序公司进行测序，一般一天内可出测序结果。并且约700bp长的片段只需一次测序反应得到四个片段的耐药突变信息，从而获知标本mtb对利福平、异烟肼、乙胺丁醇这三种一线抗结核药的耐药情况。本发明的检测准确性高于genexpert和熔解曲线法，且将极大地降低检测成本。而且pcr片段没有mtb菌的生物危害性，将其运送到测序公司比将含菌标本或mtb菌株运送到有耐药检测能力的实验室更能避免生物安全隐患。本方法的成功建立和在临床上推广应用能很大程度地减轻患者经济负担，提高检测生物安全性，并产生良好的社会效益。

本发明的主要优势可以概括为以下两点：

1)简化pcr和测序步骤：从四管分别扩rpob、embb、katg、inha四个片段，分别测序共四个反应，简化到单管只扩一个融合片段，只测序一个反应；用重叠延伸pcr将四个需扩增的片段连接成一个片段，减少了分别做四个pcr的麻烦操作，同时将四个片段分别四个测序反应减少至一个测序反应，减轻了检测劳动强度并大幅降低检测成本。

2)提高了耐药检测准确性：探针法和熔解曲线法都是检测序列是否有突变，但不能检测出是什么突变。本发明可以直接检测出具体的突变方式，可避免探针法和熔解曲线法对rpob、embb基因同义突变误报为耐药突变的现象。测序法是who要求的探针法、熔解曲线法、芯片法等其它方法比较的金标准，用测序融合片段来检测耐药突变提高了检测的准确性。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明的检测过程原理示意图；

图2为部分标本pcr产物凝胶电泳图，其中，m为dnamarkerdl2000plus，1-20为标本扩增产物，大小接近750bp，n为阴性对照。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例：

基于重叠延伸pcr的抗结核药物耐药性检测方法，具体步骤如下：

1、重叠延伸pcr扩增融合片段(原理见图1)

(1)dna提取：

取结核分枝杆菌用dna提取试剂盒，按说明书操作，或者用煮沸法，提取样品的dna作为模板；(生理盐水作为阴性对照，由于不存在天然的rpob-embb-katg-inha融合片段，不设阳性对照)

(2)构建pcr反应体系：

10×buffer5.0μl，

dntps1.0μl(2.5mmeach)，

热启动taq酶0.2μl(5u/μl)，

引物混合物5μl(rpobf和inhr浓度10μm，引物按上述比例混合)，

模板dna5μl，

加水总共到50μl。

3)pcr反应程序：

以abi7500为例，第一步：95℃5分钟；第二步：95℃10秒；第三步：68℃，每个循环降低0.5℃，10秒，第四步：72℃30秒，第二步至第四步循环30次；第五步：95℃10秒，第六步：59℃10秒，第七步：72℃30秒，第五步至第七步循环40次；

2、测序和突变分析

测序引物为tbseq：5'-accagatccgggtcggcatg-3'；如seqidno.1所示；

用引物tbseq对rpob-embb-katg-inha融合片段进行测序(北京擎科生物科技有限公司重庆分公司)。测得序列与标准株h37rv的dna序列进行对比分析，获得氨基酸序列及相关耐药突变信息。标准株h37rv为模板的rpob-embb-katg-inha融合dna序列如下：

caaaaccagatccgggtcggcatgtcgcggatggagcgggtggtccgggagcggatgaccacccaggacgtggaggcgatcacaccgcagacgttgatcaacatccggccggtggtcgccgcgatcaaggagttcttcggcaccagccagctgagccaattcatggaccagaacaacccgctgtcggggttgacccacaagcgccgactgtcggcgctggggcccggcggtctgtcacgtgagcgtgccgggctggaggtccgcgacgtgcacgcggtgatattcggcttcctgctctggcatgtcatcggcgcgaattcgtcggacgacggctacatcctgggcatggcccgagtcgccgaccacgccggctacatgtccaactatttccgctggttcggcagcccggaggatcccttcgcgtatggcaccggaaccggtaaggacgcgatcaccagcggcatcgaggtcgtatggacgaacaccccgacgaaatgggacaacagtttcctcgagatcctgtacggctacgagtgggagctgacgaagagccctgctggcgctagcgtaaccccagtgcgaaagttcccgccggaaatcgcagccacgttacgctcgtggacataccgatttcggcccggccgcggcgagaygataggttgtcggggtgactgccacagccactgaaggggccaaacccccattcgtatcccgttcagtcc

标准株h37rv为模板的rpob-embb-katg-inha融合dna片段序列转换为氨基酸序列如下(inha启动子无氨基酸序列)：

qnqirvgmsrmervvrermttqdveaitpqtlinirpvvaaikeffgtsqlsqfmdqnnplsglthkrrlsalgpgglsreraglevrdvhavifgfllwhviganssddgyilgmarvadhagymsnyfrwfgspedpfaygtgtgkdaitsgievvwtntptkwdnsfleilygyeweltkspaga

序列注释：

rpob(1-273bp)-embb(274-420bp)-katg(421-564bp)-inha(565-722bp)

embb306位点：346-348bp,116位氨基酸残基

katg315位点：457-459bp,153位氨基酸残基

inha启动子(-15)位点：第653bp，(-8)位点：第660bp

常见rpob氨基酸残基突变位点与标准株h37rv对比序列对应关系见表1。

表1.对比序列对应关系

3、临床应用研究

收集共108份临床结核分枝杆菌标本，分别提取dna作为模板，用本发明建立的重叠延伸pcr法扩增各份标本的融合片段(图2)。对各标本扩得融合片段进行测序，通过序列分析其耐药突变获得对三种一线抗结核药的结果。然后与培养法药敏试验结果对比，结果见表2～表4。

表2本发明方法与培养法检测利福平耐药

表3本发明方法与培养法检测异烟肼耐药

表4本发明方法与培养法检测乙胺丁醇耐药

注：s表示敏感；r表示耐药

由表2-表4可看出本发明方法与培养方法检测利福平、异烟肼、乙胺丁醇耐药的一致性分别为94.4％、94.4％、76.9％，达到了基因型耐药检测方法与表型的符合率。

用本发明方法与genexpert法分别对56例标本进行检测结果见表5，两种方法检测利福平耐药一致性达100％。

表5本发明方法与genexpert检测利福平耐药

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>重庆市公共卫生医疗救治中心

<120>基于重叠延伸pcr的抗结核药物耐药性检测方法

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtacggtcggcgagctgatcca22

<210>2

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

caccgggtgcacgtcgcggacctccagcccggcacgctcacgtgacagac50

<210>3

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggaggtccgcgacgtgcacccggtgatattcggcttcctgctc43

<210>4

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acggaagggatcctccgggctgccgaaccagcggaaatagttgga45

<210>5

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cggcagcccggaggatcccttccgtatggcaccggaaccggtaa44

<210>6

<211>49

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

acgcaagcgccagcagggctcttcgtcagctcccactcgtagccgtaca49

<210>7

<211>49

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gacgaagagccctgctggcgcttgcgtaaccccagtgcgaaagttcccg49

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ggactgaacgggatacgaatgg22

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

accagatccgggtcggcatg20