位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的SNP分子标记及应用的制作方法

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记及应用。

背景技术：

目前，全球育种目标已经从脂肪型猪向瘦肉型猪转变，提高瘦肉率是猪的主要育种目标。眼肌面积是衡量瘦肉率的一个重要指标之一，且这两个性状呈有利的正相关关系，因此育种工作者也通过增加猪的眼肌面积来提高瘦肉率。几十年来，人们通过传统的选育方法来增加眼肌面积和提高瘦肉率，使得这两个性状得到一定程度上的改良。但眼肌面积和瘦肉率是复杂的数量性状，受多基因调控。因此，通过传统的选育方法来改良这两个性状，耗时长且收效甚微。如若能利用分子标记辅助选择(markerassistedselection，mas)技术同时改良猪的眼肌面积和瘦肉率，将进一步加快这两个性状的育种进程，能够显著提高生猪养殖的经济效益。

杜长大(杜洛克猪×长白猪×大白猪)是全球最受欢迎的商业猪品种，杜洛克猪被广泛用作杜长大商品猪的终端父本。杜洛克作为终端父本直接影响杜长大的生产性能，而商品猪的生产性能直接影响到养殖场的经济效益。因此，对核心群杜洛克猪的眼肌面积和瘦肉率性状进行改良，能够较大程度的将改良得到的优势遗传给商品猪后代，增强商品猪的生产竞争力，从而提高养殖场的经济效益。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记的引物对。

本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记，其snp位点对应于国际猪参考基因组11.1版本16号染色体上第33757844bp处的a>c突变；

所述的位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记的核苷酸序列为seqidno.1所示，其中序列中的m是a或c，导致猪眼肌面积和瘦肉率性状的不同；

所述的位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记的snp位点为seqidno:1序列标注位置为26位的a26-c26的核苷酸突变(位于该序列片段第26核酸单碱基突变，命名为：g.26a>c)；

所述的位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记在鉴定杜洛克猪眼肌面积和瘦肉率性状和遗传育种中应用；

一种检测猪眼肌面积和瘦肉率性状的方法，包含如下步骤：

检测猪16号染色体上上述位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记，所述的snp分子标记的5’端第33757844位单核苷酸是a还是c；

所述的猪优选为加系杜洛克及其合成系；

一种用于鉴定上述位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记的引物对，包含引物primer-f和primer-r，其核苷酸序列如下：

上游引物primer-f：5’-aggtcagagtggggcagtaa-3’；

下游引物primer-r：5’-aatgggattggatgcgggtt-3’；

所述的引物对在鉴定影响种猪眼肌面积和瘦肉率性状中的应用；

所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用；

所述的引物对在增加种猪眼肌面积和提高种猪瘦肉率中的应用；

一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中种猪的上述位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记，并根据所述分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组11.1版本16号染色体上第33757844bp处的cc基因型和ac基因型的种猪个体，淘汰该点的aa基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因c的频率，从而增加后代猪眼肌面积和提高后代猪的瘦肉率；

所述的猪优选为加系杜洛克及其合成系；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定影响猪眼肌面积和瘦肉率相关的分子标记位于猪的16号染色体的核苷酸序列上，验证其对猪眼肌面积和瘦肉率性状的影响效应，最终建立对猪眼肌面积和瘦肉率性状进行快速改良的分子标记辅助选择育种技术，极大地改善了杜洛克及其合成系的选育进程，适应活猪市场的需求，提高了肉猪的价格，为企业增加了销售利润，提高核心竞争力。

(2)本发明提供一种用于位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确的对性状进行选育，加快育种进程，将其应用于种猪眼肌面积和瘦肉率性状遗传改良中，从而增加猪的眼肌面积和提高猪的瘦肉率，进而提高企业利润，增加核心竞争力。

(3)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因，提供了一种猪选育的方法，能够加快杜洛克猪的遗传进展，缩短了杜洛克改良的时间，从而有效提高种猪育种的经济效益，其中，若本发明将影响猪眼肌面积和瘦肉率性状的分子标记的aa型个体全部选育成cc型个体，则每头猪在100kg体重时，瘦肉率可以提高0.39％，在一个规模化万头猪场则可以增加3.9吨瘦肉；而每头猪在100kg体重时眼肌面积可以增加0.89cm²，由此可见增加眼肌面积和提高瘦肉率为养猪产业提供收益的潜力是巨大的，可最终实现提高商品猪的经济效益，从而增加企业的收益。

附图说明

图1是加系杜洛克在16号染色体上关于100kg体重时种猪眼肌面积的全基因组关联(gwas)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logp值。

图2是加系杜洛克在16号染色体上关于100kg体重时种猪瘦肉率性状的全基因组关联(gwas)分析图。

图3是不同基因型猪在100kg体重时的眼肌面积结果分析图。

图4是不同基因型猪在100kg体重时的瘦肉率结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验猪群：本实验一共使用了2127头加系杜洛克。

实施例1具体解释得到本发明中影响瘦肉率的测定过程

通过新西兰hgs(hennessygradingsystem)胴体分级系统测定活体猪体重达100kg时瘦肉率。利用alokassd500v型活体b超测定仪测定所有试验猪只100kg时的眼肌面积，测定部位为第10～11肋间处。测量结果利用软件进行100kg眼肌面积的校正。利用标配测量软件包计算眼肌面积，直接打印出影像及测量值。

本发明所使用的实验猪群群体为广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种加系杜洛克2127头，为种猪分公司核心群，群体系谱记录详细。本实验共选取该资源群体中加系杜洛克种猪，猪群在统一的饲养标准下，自由采食、饮水，饲养至100±5kg体重。

实施例2具体解释得到本发明中基因标记的发明过程

(1)加系杜洛克猪耳样组织dna的提取方法参照标注苯酚-氯仿法提取全基因组dna。用nanodrop-nd1000分光光度计对纯种加系杜洛克群体的dna进行质量检测和浓度测定。a260/280比值在1.8～2.0，a260/230比值在1.7～1.9判定为合格。最后将合格的dna样品统一稀释成50纳克/微升。

(2)猪全基因组50ksnp基因型检测：geneseekgenomicprofilerporcine50ksnp分型平台，采用illuminainfinium的使用说明和标准流程进行芯片杂交与结果扫描。最后通过genomestudio软件读取基因型数据。用plinkv1.07对获得的基因型数据进行质量控制，剔除检出率<99％，次等位基因频率(mimorallelfrequency，maf)<1％或偏离哈代温伯格平衡(hardy-weinbergequilibrium，hwe)检验p≤10^-6的snp标记，排除检出率<90％，家系孟德尔错误率高于0.1的个体，排除位于未知位置和性染色体上的snp。100kg体重瘦肉率质控剩余的35845个snp标记和2113个样本用于后续数据分析；100kg体重眼肌面积质控剩余35845个snp和2121个样本用于后续数据分析。

(3)全基因组关联(gwas)分析：为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合r语言genabel软件包进行gwas分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用bonferrini法确定snp与眼肌面积和瘦肉率性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效snp位点数量，即基因组水平显著阈值为1.3949×10^-6，即1/35845(有效snp数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效snp位点数量，即染色体显著水平阈值为2.7898×10^-5，即1/35845(有效snp数量)。

gwas分析结果如图1和图2所示。从图1和图2可知，在杜洛克中，在16号染色体中存在在一个显著影响100kg眼肌面积和100kg瘦肉率的位点，最强关联的snp为g.26a>c(p＝5.75×10^-6；p＝4.25×10^-6)(seqno.1中第26位核苷酸，即对应于国际猪参考基因组11.1版本16号染色体上第33757844bp处的a>c突变)。

(4)不同基因型与种猪100kg体重时的眼肌面积和瘦肉率表型的关联性分析：根据表1可知，分子标记的snp位点g.26a>c与眼肌面积和瘦肉率性状极显著相关(p<0.01)，说明此分子标记显著影响猪的眼肌面积和瘦肉率，可以通过对猪的此snp位点的辅助选择，从而增加该群体眼肌面积和提高瘦肉率，进而加快瘦肉型种猪的育种进程。另外根据表1、图3和图4还可知，aa型比ac和cc型的眼肌面积小、瘦肉率低，说明纯合子aa对种猪的眼肌面积和瘦肉率是最不利的。眼肌面积和瘦肉率是衡量种猪生长性能的重要指标，眼肌面积大、瘦肉率高说明猪的生长性能好。因此，aa基因型的猪的生长性能是最差的，我们在进行育种的过程中需要逐步淘汰aa型和ac型的种猪，保留cc型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因c的频率。

表1分子标记的snp位点g.26a>c与性状的相关性

实施例3具体解释发明检测snp标记的发明过程

(1)含有与加系杜洛克100kg体重眼肌面积和100kg体重瘦肉率性能显著相关snp位点的目的片段为16号染色体中的一段239bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为primer-f和primer-r，其核苷酸序列如下：

上游引物primer-f：5’-aggtcagagtggggcagtaa-3’；

下游引物primer-r：5’-aatgggattggatgcgggtt-3’。

(2)pcr扩增的体系与条件设置

配置10μl体系，其中dna样品1μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl，pcrmix5μl，ddh2o3.4μl，pcr条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后延伸为72℃5min。

(3)dna序列测序鉴定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，得出对应snp位点的突变，测序结果如下所示：

注：序列中标注的m为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为引物序列结合位置。

实施例4分子标记的snp位点g.26a>c效应分析

本发明提供一个能显著增加杜洛克种猪眼肌面积和提高杜洛克种猪瘦肉率snp分子标记，使用该snp分子标记进行标记辅助选择，能够极大地加快杜洛克种猪的眼肌面积和瘦肉率育种进程。若本发明将影响猪眼肌面积和瘦肉率性状的分子标记的aa型个体全部选育成cc型个体，则每头猪在100kg体重时，瘦肉率可以提高0.39％，在一个规模化万头猪场则可以增加3.9吨瘦肉；而每头猪在100kg体重时眼肌面积可以增加0.89cm²，由于眼肌面积和瘦肉率呈有利的正相关关系，育种工作者可以通过增加猪的眼肌面积来提高瘦肉率。由此可见增加眼肌面积和提高瘦肉率为养猪产业提供收益的潜力是巨大的。本snp分子标记个体中，通过优选加系杜洛克该snp的优势等位基因(c)，可最终实现提高商品猪的经济效益，从而增加企业的收益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>华南农业大学

<120>位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记及应用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>位于猪16号染色体上与猪瘦肉率和眼肌面积相关的snp分子标记的核苷酸序

列

<400>1

aggtcagagtggggcagtaaactggmcagagaagtacagaaatggctgagtgaaaattca60

acactgagctttgatttgatttgatttttattttttggctacccctcgggatatggagtt120

cccagaccagggatcagatcccaatcatagttgtgacttaagccgcaggtgcagcaacac180

caggttggatccttaacccactgtgccagccagggatcgaacccgcatccaatcccatt239

<210>2

<211>20

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aggtcagagtggggcagtaa20

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<400>3

aatgggattggatgcgggtt20