壁虎蛆虫蛋白质在制备抗淋巴癌药品中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种壁虎蛆虫蛋白质的新用途，尤其是壁虎蛆虫蛋白质在制备抗淋巴 癌药品中的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性淋巴癌是原发于淋巴结或淋巴结外组织或器官的恶性肿瘤，根据临床病理特 点可以划分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。一般认为恶性淋巴瘤起源于淋巴细胞及其 前体细胞，病毒和细菌感染、免疫缺陷、环境致癌物、电离辐射和遗传等都可能是恶性淋巴 瘤的病因。
[0003] 现在的治疗方法采用化疗、靶向治疗、造血干细胞移植、干扰素等。
[0004] CN103667466A公开了一种用于B细胞非霍奇金淋巴瘤及其耐药性检测的标志物。 该标志物为采用实时定量PCR的扩增产物，可以通过标志物检测其表达水平与疾病进展之 间的相关性。
[0005] CN101757558A公开了一种治疗恶性淋巴肿瘤的中草药制剂及其制备方法。该药剂 由藿香、红花、山豆根、三棱、莪术、猫布草、桃仁、白花、蛇舌草、川乌、草乌、蜈蚣、全虫等19 种中草药组成制备成散剂、煎剂、丸剂，用于治疗淋巴肿瘤。
[0006] CN101007158公开了一种治疗恶性肿瘤的中药组合物，该组合物是由灵脂、没药、 乳香、三棱、莪术、蒲公英、藿香、紫河车、水蛭、蟾蜍、壁虎、双花、皂刺、连翘、大青叶等组成。
[0007] CN102861236A公开了一种纯中药抗肿瘤制剂，该制剂是由黄精、灵芝、三七、桃仁、 葛根、牡蛎、石耳、枸杞子、半枝莲、白花蛇舌草等13种中草药组成。
[0008] 201210315707. 2公开了人工培殖壁虎蛆虫的工艺，该发明以壁虎等为原料，配制 成适宜的培养基，培殖出药用壁虎蛆虫，该虫体具有较高生物活性，可以抗淋巴癌。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种壁虎蛆虫蛋白质在制备抗淋巴癌药品中的应用，根据淋 巴癌的病灶特性及壁虎蛆虫蛋白质生物活性特点，两者相结合制备的药剂具有适应性强、 疗效好的特点。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000 g壁虎蛆虫在常温膨化装置（200520108339. X)中常温条件下膨化粉碎。
[0011] 本步骤中，所述膨化压力为0? l~5MPa，时间为10~60min。
[0012] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出壁虎蛆虫蛋白质粗品。
[0013] 本步骤中，所述膨胀溶剂由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H2O组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。
[0014] 本步骤中，所述提取温度为10~20°C，时间为10~30min。
[0015] (3)收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
[0016] 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~50Mm。
[0017] (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液。
[0018] 本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
[0019] (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
[0020] 本步骤中，所述溶剂为乙腈。
[0021] (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。
[0022] 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。
[0023] (7)纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
[0024] 本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。
[0025] (8)赋予不同的药用辅助材料，可用于制备抗淋巴癌药品。
[0026] 本技术方案中分离的纯化壁虎蛆虫蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向聚丙烯酰 胺凝胶电泳及琼脂聚糖免疫电泳谱上测得非均一蛋白质；用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为10. 9~12. 6KPa ;用等电聚焦发测定其等 电点为PH8. 8~10. 2 ;常规化学法分析结果表明其不含糖基；紫外分光光度法测定纯化的壁 虎蛆虫蛋白质含量为96. 7%。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0028] 实施例1: (1) 将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ? H2O,加压至2~10MPa，形成膨 胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压 至常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH 3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3. OKW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm ; (7)纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~501：、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0029] 实施例2: (1) 将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ? H2O,加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系，保持 温度15°C，时间20min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成壁虎蛆虫蛋 白质粗品与甲醇-NH 3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径30Mm的微孔过滤器过滤去处固体杂 质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用1〇~80%的乙腈梯度脱洗，流速 5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率I. 0KW，频率500KHz，流速200mL/ min，紫外检测器波长260nm ; (7) 纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~40°C、时间20h干燥制备 成冻干蛋白粉。
[0030] 实施例3: (1) 将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成膨胀 溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至 常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比I. 25:3. 75:5)溶剂体系中， 用超声驻波液相制备色谱（200920274485. 8 )分离纯化，超声波功率0. 2~3. OKW，频率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外检测器波长 260~280nm ; (7) 纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~501：、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0031] 实施例4: (1) 将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至2MPa，时间40min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆虫被膨化 成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入6Kg液态二氧化碳、200mL乙醇及150g氯化铵，加压至6MPa，形成膨胀溶剂体系，保持 温度20°C，时间lOmin，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成壁虎蛆虫蛋 白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径50Mm的微孔过滤器过滤去处固体杂 质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用60%乙腈活化预处理，加0. 08%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用1〇~80%的乙腈梯度脱洗，