一种鉴定猪的肌纤维密度大小的方法及其所用引物对与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定猪的肌纤维密度大小的方法及其所用引物对。

背景技术：

猪肉质品质是猪的重要经济性状，它与人们的肉食营养、肉食品加工和养猪业经济效益都密切相关。因此，猪肉质品质研究已成为肉食品加工和猪遗传育种领域的一个重要组成部分，作为影响猪肉质主要因素的肌纤维密度也愈来愈受到研究者和育种者们的关注，成为猪育种计划的一部分。

然而，肌纤维密度只有屠宰后才能进行测定，育种工作困难。分子育种可以通过筛选与性状关联分子标记进行育种工作，避免屠宰。因此，获得一种能鉴定猪的肌纤维密度大小的分子标记显得非常重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鉴定猪的肌纤维密度大小的方法及其所用引物对。

为达到以上目的，本发明提供了一种扩增含有ssc14g.85531863c＞t多态性位点的dna片段的引物对；

所述ssc14g.85531863c＞t多态性位点为猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上自5′末端起第85531863位核苷酸；

所述猪参考基因组sscrofa11.1为genbank中更新日为2017年2月的猪参考基因组序列。

上述引物对由序列1所示的dna分子和序列2所示的dna分子组成。

一种鉴定或辅助鉴定猪的肌纤维密度大小的试剂盒，该试剂盒包含上述引物对。

所述试剂盒还包含使用说明书，说明书中记载内容如下：

以待测猪的基因组dna为模板，利用上述引物的进行pcr扩增，得到pcr产物，该pcr扩增产物含有猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上自5′末端起第85531863位核苷酸，如果该处核苷酸均为c，则所述猪的基因型为纯合cc基因型，如果该处核苷酸为c和t，则所述猪的基因型为杂合ct基因型，如果该处核苷酸均为t，则所述猪的基因型为纯合tt基因型；纯合cc基因型与杂合ct基因型猪的肌纤维密度大于纯合tt基因型猪的肌纤维密度，纯合cc基因型与杂合ct基因型的猪的肌纤维密度差异不显著。

上述试剂盒中，所述猪为北京黑猪。

一种鉴定或辅助鉴定猪的肌纤维密度大小的方法也属于本发明的保护范围，该方法为：纯合cc基因型与杂合ct基因型的猪的肌纤维密度大于或候选大于纯合tt基因型的猪的肌纤维密度，纯合cc基因型与杂合ct基因型的猪的肌纤维密度差异不显著；

所述纯合cc基因型的猪为ssc14g.85531863c＞t多态性位点均为c的猪；

所述杂合ct基因型的猪为ssc14g.85531863c＞t多态性位点为c和t的猪；

所述纯合tt基因型的猪为ssc14g.85531863c＞t多态性位点均为t的猪；

所述ssc14g.85531863c＞t多态性位点为猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上自5′末端起第85531863位核苷酸；

所述猪参考基因组sscrofa11.1为genbank中更新日为2017年2月的猪参考基因组序列。

上述方法中，所述纯合cc基因型、杂合ct基因型或纯合tt基因型的判定方法如下：以猪的基因组dna为模板，用权利要求1或2所述的引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，如果pcr扩增产物自5’末端起第154位的核苷酸均为c，则所述猪的基因型为纯合cc基因型，如果pcr扩增产物自5’末端起第154位的核苷酸为c和t，则所述猪的基因型为杂合ct基因型，如果pcr扩增产物自5’末端起第154位的核苷酸均为t，则所述猪的基因型为纯合tt基因型。

一种选育更大肌纤维密度的猪的方法也属于本发明的保护范围，是选择纯合cc基因型和/或杂合ct基因型的猪进行选育；

所述纯合cc基因型的猪为ssc14g.85531863c＞t多态性位点均为c的猪；

所述杂合ct基因型的猪为ssc14g.85531863c＞t多态性位点为c和t的猪；

所述ssc14g.85531863c＞t多态性位点为猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上自5′末端起第85531863位核苷酸；

所述猪参考基因组sscrofa11.1为genbank中更新日为2017年2月的猪参考基因组序列。

上述方法中，纯合cc基因型的判定方法如下：以猪的基因组dna为模板，用上述引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，如果pcr扩增产物自5’末端起第154位的核苷酸均为c，则所述猪的基因型为纯合cc基因型，如果pcr扩增产物自5’末端起第154位的核苷酸为c和t，则所述猪的基因型为杂合ct基因型。

一种选育更小肌纤维密度的猪的方法也属于本发明的保护范围，是选择纯合tt基因型的猪进行选育；

所述纯合tt基因型的猪为ssc14g.85531863c＞t多态性位点均为t的猪；

所述ssc14g.85531863c＞t多态性位点为猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上自5′末端起第85531863位核苷酸；

所述猪参考基因组sscrofa11.1为genbank中更新日为2017年2月的猪参考基因组序列。

上述方法中，纯合tt基因型的判定方法如下：以猪的基因组dna为模板，用上述引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，如果pcr扩增产物自5’末端起第154位的核苷酸为t，则所述猪的基因型为纯合tt基因型。

上述任一所述的方法中，所述猪为北京黑猪。

上述任一所述引物对、上述试剂盒和/或上述任一所述的方法在猪的选育中的应用。

上述任一所述的应用中，所述猪为北京黑猪。

本发明使用测序的方法检测猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上g.85531863c＞t多态性位点(ssc14g.85531863c＞t)处的核苷酸，判别猪个体的基因型，从而对猪肌纤维密度性状进行选择，获得肌纤维密度较大或较小的猪。本发明提供的方法可对待选猪进行早期筛选，有效地解决实际生产中的肌纤维密度无法活体测定的问题，降低了育种花费，有效增大或减小实际生产中的猪的肌纤维密度，该方法准确度高，检测费用低，并可实现自动化检测，在猪的育种方面具有很高的实践应用价值。

附图说明

图1为cc基因型个体和tt基因型个体猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上g.85531863c＞t多态性位点附近序列的测序结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

北京黑猪(susscrofa)，购自北京黑六牧业科技有限公司。

下述实施例中的猪参考基因组sscrofa11.1均是指genbank中更新日为2017年2月的猪参考基因组序列。

实施例1鉴定猪的肌纤维密度大小

一、猪ssc14g.85531863c＞t多态性位点的确定

(一)以两头北京黑猪为实验材料，分别提取其耳缘组织的基因组dna。

(二)引物的设计与合成

根据猪参考基因组sscrofa11.1的序列，设计并合成如下引物：

u(上游引物)：5’-ctgcacctgactctttccc-3’(如序列1所示)；

d(下游引物)：5’-ggtccacagattcccttcc-3’(如序列2所示)。

(三)pcr扩增

分别以步骤(一)得到的北京黑猪的基因组dna为模板，以u和d为引物进行pcr扩增，得到两种pcr扩增产物，分别命名为产物1和产物2。

pcr扩增体系：基因组dna200ng，10×pcr扩增缓冲液5μl，dntps终浓度为10mm，上、下游引物各50ng，taqdna聚合酶0.75u，mg²⁺2.5mmol/l，用ddh2o补足体系至50μl。

pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

(四)测序及序列分析

将产物1和产物2进行测序，得到产物1的序列(如序列3所示)和产物2的序列(如序列4所示)。序列3和序列4只存在一个核苷酸的差异，均为序列3和序列4中自5’末端起第154位，该处的核苷酸为c或t，如图1中箭头所示，该位点为猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上自5′末端起第85531863位核苷酸，因此将该位点命名为ssc14g.85531863c＞t。

在猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上自5′末端起第85531863位核苷酸(或步骤(三)得到的pcr扩增产物自5’末端起第154位的核苷酸)均为c的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合cc基因型，在猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上自5′末端起第85531863位核苷酸(或步骤(三)得到的pcr扩增产物自5’末端起第154位的核苷酸)均为t的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合tt基因型，在猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上自5′末端起第85531863位核苷酸(或步骤(三)得到的pcr扩增产物自5’末端起第154位的核苷酸)为c和t的个体，该个体为杂合型个体，将该个体的基因型命名为杂合ct基因型。

二、猪ssc14g.85531863c＞t多态性位点与猪的肌纤维密度的关联性分析

为确定ssc14g.85531863c＞t多态性位点与猪的肌纤维密度性状是否相关，以148头北京黑猪为实验材料，进行如下试验：

(一)提取每头猪的耳缘组织的基因组dna，分别按照步骤一中(三)的方法进行pcr扩增，得到各pcr扩增产物，按照步骤一中(四)的方法确定每头猪的基因型是纯合cc、杂合ct还是纯合tt。

(二)用苏木精-伊红染色(he)法进行背最长肌切片染色后，使用image-pro图像分析软件统计每头猪的肌纤维密度、i型纤维比例、iia型纤维比例和iib型纤维比例。

(三)对猪的基因型与猪肌纤维密度以最小二乘法开展关联分析，具体方法可参见文献“zhangl，wangl，liy，liw，yanh，liux，zhaok，wangl.asubstitutionwithinerythropoietinreceptorgened1domainassociatedwithlittersizeinbeijingblackpig，susscrofa.animscij.2011；82(5)：627-632”。

所用模型如下：

y＝s+g+e

其中y为性状测定值，s为性别效应，g为基因型效应，e为残差效应。

结果如表1所示。

表1猪ssc14g.85531863c＞t位点基因型与猪肌肌纤维件状关联件分析

注：同列上标不同字母表示差异显著(p＜0.05)

从表1可以看出：在猪的肌纤维密度性状中，纯合cc基因型与杂合ct基因型的猪的肌纤维密度显著大于纯合tt基因型猪的肌纤维密度(p＜0.05)，纯合cc基因型与杂合ct基因型的猪的肌纤维密度差异不显著。

结果表明，本发明用猪参考基因组sscrofa11.1的14号染色体上自5′末端起第85531863位核苷酸多态性鉴定猪的肌纤维密度的结果与猪的肌纤维密度的实际测定结果一致。因此，利用本发明由序列1所示的dna分子和序列2所示的dna分子组成的引物对扩增含有ssc14g.85531863c＞t多态性位点的dna片段，可鉴定或辅助鉴定猪的肌纤维密度大小。在实际的猪育种中，为获得更大肌纤维密度的猪，最好选择纯合cc基因型和/或杂合ct基因型的猪进行育种。

序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>一种鉴定猪的肌纤维密度大小的方法及其所用引物对

<130>gncfy191243

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

ctgcacctgactctttccc19

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

ggtccacagattcccttcc19

<210>3

<211>357

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

ctgcacctgactctttccccttcatattgtgacttaaaggagctccattaaaaatttagt60

acatggagagttgctcattgttgttaatgacagtacatttctttggctttgaattttgga120

aaaacttcttgggttgtttggggaacctccctccgccaaagctgtcctcttctccccaca180

ctgtagcttccagtaaaaggtacccaatacagtccaccccaccctcagggattggcaccc240

tccctgcagctctccctggttttcctgccagtggtggagaggagcgaggcagttggaacc300

acagaacagctgaactgaaaagggaaatggctctttctggaagggaatctgtggacc357

<210>4

<211>357

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