鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对及其应用。
背景技术：
：螨隶属于蛛形纲arachinida、蜱螨亚纲acari、真螨目acariformes，个体微小，成螨体长一般0.1-0.2mm，肉眼难以观察。仓储害螨在仓储物中可大量孳生，食用仓储物的营养部分，造成仓储物质量和数量的损失，同时，仓储害螨的活动会增加热量，而其排泄物以及身上携带的微生物在热量催化下会快速地造成仓储物大范围的污染、霉变。更重要的是，仓储害螨中的大多数品种都会造成哮喘等过敏性疾病，危害人们的身体健康。从近年来的仓储物调查发现，腐食酪螨为仓储害螨中的优势种，检出率最高，部分地区达到49.3％，是目前适应性最强的仓储害螨。在饲养仓储害螨的过程中，发现绝大部分的仓储害螨的种类发生改变，经检测，皆被椭圆食粉螨污染，且种群中以椭圆食粉螨为主。由此可见，椭圆食粉螨的竞争力较强。但由于腐食酪螨和椭圆食粉螨个体微小，形态鉴定时需要制作玻片标本，而且鉴定主要依靠刚毛的位置与长短等特征，这给2种螨的形态学鉴定造成了极大困难。因此如何对其进行快速准确的鉴定，尤其是非成虫态螨及螨成虫残体的种类鉴定是亟待解决的问题。dna条形码技术(dnabarcoding)是利用生物体dna中一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。近些年，基于dna条形码序列设计特异性引物、探针而发展的常规pcr技术、实时荧光pcr技术、环介导等温扩增技术lamp已广泛应用于物种的分子鉴定。其中，常规pcr技术由于操作快速简便、特异性强、灵敏度高、节省成本等优点已在螨的分子鉴定中广泛应用。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供用于鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对。所述引物对甲由tp-f和tp-r组成；所述引物对乙由ao-f和ao-r组成；所述tp-f为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链dna分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链dna分子；所述tp-r为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链dna分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链dna分子；所述ao-f为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链dna分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；所述ao-r为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链dna分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子。进一步的，所述引物对甲和所述引物对乙中的两条单链dna分子的摩尔比均为1:1。所述引物对甲和所述引物对乙中的两条单链dna分子均独立包装。本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括上述成套引物对。进一步的，所述试剂盒还可包括用于进行常规pcr扩增的试剂，如2×taqpcrmastermix和ddh2o等。本发明的第三个目的是提供上述成套引物对或上述试剂盒的新用途。本发明提供了上述成套引物对或上述试剂盒在如下c1)-c8)中任一种中的应用：c1)制备鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的产品；c2)鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨；c3)制备鉴定待测螨为腐食酪螨还是椭圆食粉螨的产品；c4)鉴定待测螨为腐食酪螨还是椭圆食粉螨；c5)制备腐食酪螨和/或椭圆食粉螨的疫情监测的产品；c6)腐食酪螨和/或椭圆食粉螨的疫情监测；c7)制备预防腐食酪螨和/或椭圆食粉螨的入侵和/或扩散的产品；c8)预防腐食酪螨和/或椭圆食粉螨的入侵和/或扩散。本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测螨为腐食酪螨还是椭圆食粉螨的方法。本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测螨为腐食酪螨还是椭圆食粉螨的方法包括如下步骤：以待测螨的基因组dna为模板，分别采用上述引物对甲和引物对乙进行pcr扩增；若引物对甲pcr扩增得到大小为484bp的目的片段，则待测螨为或候选为腐食酪螨；若引物对乙pcr扩增得到大小为639bp的目的片段，则待测螨为或候选为椭圆食粉螨。上述引物对甲在如下d1)-d8)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：d1)制备鉴定腐食酪螨的产品；d2)鉴定腐食酪螨；d3)制备鉴定待测螨是否为腐食酪螨的产品；d4)鉴定待测螨是否为腐食酪螨；d5)制备腐食酪螨的疫情监测的产品；d6)腐食酪螨的疫情监测；d7)制备预防腐食酪螨的入侵和/或扩散的产品；d8)预防腐食酪螨的入侵和/或扩散。上述引物对乙在如下e1)-e8)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：e1)制备鉴定椭圆食粉螨的产品；e2)鉴定椭圆食粉螨；e3)制备鉴定待测螨是否为椭圆食粉螨的产品；e4)鉴定待测螨是否为椭圆食粉螨；e5)制备椭圆食粉螨的疫情监测的产品；e6)椭圆食粉螨的疫情监测；e7)制备预防椭圆食粉螨的入侵和/或扩散的产品；e8)预防椭圆食粉螨的入侵和/或扩散。本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测螨是否为腐食酪螨的方法。本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测螨是否为腐食酪螨的方法包括如下步骤：以待测螨的基因组dna为模板，采用上述引物对甲进行pcr扩增；若pcr扩增得到大小为484bp的目的片段，则待测螨为或候选为腐食酪螨；若pcr扩增未得到大小为484bp的目的片段，则待测螨不为或候选不为腐食酪螨。本发明的第六个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测螨是否为椭圆食粉螨的方法。本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测螨是否为椭圆食粉螨的方法包括如下步骤：以待测螨的基因组dna为模板，采用上述引物对乙进行pcr扩增；若pcr扩增得到大小为639bp的目的片段，则待测螨为或候选为椭圆食粉螨；若pcr扩增未得到大小为639bp的目的片段，则待测螨不为或候选不为椭圆食粉螨。上述方法中，所述大小为484bp的目的片段为腐食酪螨线粒体基因组中nad4基因(序列5)第405-889位所示的dna片段。所述大小为639bp的目的片段为椭圆食粉螨线粒体基因组中nad2基因(序列6)第201-840位所示的dna片段。上述任一所述方法中，所述pcr反应体系由dna模板1.5μl、正向引物(10μm)1μl、反向引物(10μm)1μl、2×taqpcrmastermix12.5μl和ddh2o9μl组成。所述正向引物和所述反向引物为所述引物对甲中的tp-f和tp-r或所述引物对乙中的ao-f和ao-r。所述tp-f、所述tp-r、所述ao-f和所述ao-r在所述pcr反应体系中的终浓度均为0.6μm。所述pcr反应条件如下：腐食酪螨：95℃预变性3min；35个循环的95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。椭圆食粉螨：95℃预变性3min；35个循环的95℃变性30s，60℃退火延伸1min；60℃延伸5min。上述任一所述方法中，所述螨具体可为所述螨的卵、幼虫、蛹和/或成虫。如下f1)-f16)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：f1)制备鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的产品；f2)鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨；f3)制备鉴定待测螨为腐食酪螨还是椭圆食粉螨的产品；f4)鉴定待测螨为腐食酪螨还是椭圆食粉螨；f5)制备鉴定腐食酪螨的产品；f6)鉴定腐食酪螨；f7)制备鉴定待测螨是否为腐食酪螨的产品；f8)鉴定待测螨是否为腐食酪螨；f9)制备鉴定椭圆食粉螨的产品；f10)鉴定椭圆食粉螨；f11)制备鉴定待测螨是否为椭圆食粉螨的产品；f12)鉴定待测螨是否为椭圆食粉螨；f13)制备腐食酪螨和/或椭圆食粉螨的疫情监测的产品；f14)腐食酪螨和/或椭圆食粉螨的疫情监测；f15)制备预防腐食酪螨和/或椭圆食粉螨的入侵和/或扩散的产品；f16)预防腐食酪螨和/或椭圆食粉螨的入侵和/或扩散。本发明基于常规pcr的分子鉴定技术实现对腐食酪螨和椭圆食粉螨的种类鉴定，本发明设计的鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异性引物对具有特异性强、灵敏度高、成本低、操作简单、耗时短的优点，不仅解决了非成虫态螨及螨成虫残体的种类鉴定问题，也为椭圆食粉螨和腐食酪螨的疫情监测、在我国的分布及入侵现状、以及其后续的治理提供了实用技术和理论依据。对有效预防其进一步的入侵和扩散、保护农业生产和生态安全、促进我国经济贸易发展具有重要意义。附图说明图1为腐食酪螨引物特异性检测结果。1：腐食酪螨；2：家食甜螨；3：椭圆食粉螨；4：线嗜酪螨；5：粗脚粉螨；6：马六甲肉食螨；7：普通肉食螨。图2为椭圆食粉螨引物特异性检测结果。1：椭圆食粉螨；2：腐食酪螨；3：家食甜螨；4：线嗜酪螨；5：粗脚粉螨；6：马六甲肉食螨；7：普通肉食螨。图3为腐食酪螨特异引物灵敏度检测结果。1：26.62ng/ul；2：13.31ng/ul；3：6.66ng/ul；4：3.33ng/ul；5：1.66ng/ul。图4为椭圆食粉螨特异引物灵敏度检测结果。1：15ng/ul；2：5ng/ul；3：1.67ng/ul；4：0.56ng/ul；5：0.18ng/ul。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的核酸序列，如无特殊说明，各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5’末端核苷酸，末位均为相应dna的3’末端核苷酸。下述实施例中腐食酪螨和椭圆食粉螨引物均由生工生物(上海)有限公司合成。下述实施例中的腐食酪螨线粒体基因组中nad4基因序列如序列表中的序列5所示；下述实施例中的椭圆食粉螨线粒体基因组中nad2基因序列如序列表中的序列6所示。实施例1、鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对的获得一、螨线粒体基因组获得1、供试螨样本供试椭圆食粉螨采集于捷克，供试腐食酪螨采集于中国北京，样品浸泡于无水乙醇中，-20℃保存备用。2、线粒体基因组序列使用天根公司的微量dna提取试剂盒提取供试螨样本dna，微量dna提取试剂盒成分如表1所示。表1、微量dna提取试剂盒成分试剂盒组成(50次)各组分的量缓冲液ga15ml缓冲液gb15ml缓冲液gd13ml漂洗液pw15ml洗脱缓冲液tb15ml蛋白酶k1mlcarrierrna310μgrnase-freeddh2o1ml吸附柱cr250个收集管(2ml)50个具体实验步骤如下：1)通过解剖镜观察并挑取50头纯化饲养的成螨，置于1.5ml的离心管中，用无水乙醇洗净，自然晾干。2)加入180ul的ga缓冲液以及20ul的蛋白质酶，摇匀，简短离心后56℃水浴过夜。取出离心管，擦去表面水滴，简短离心。3)加入200ul的gb溶液以及1ul的carrierrna溶液，充分摇匀(此时有沉淀产生，需使沉淀分散)后70℃水浴10min，此时管中清澈无沉淀。取出擦干，简短离心。4)加入200ul的无水乙醇(室温高于26℃时将无水乙醇放入4℃冰箱中预冷)，上下颠倒摇匀，简短离心后静置5min，然后使用移液枪将离心管中的液体全部转移到收集管上的吸附管中，常温12000rpm离心1min。取出，倒掉废弃液。5)加入500ul的gd溶液，静置5min，然后12000rpm离心1min。取出，倒掉废弃液。6)加入600ul的pw溶液，静置5min，然后12000rpm离心1min，取出，倒掉废弃液。重复本步骤两次。7)空管12000rpm离心2min，取出，倒掉废弃液，将吸附管放在干净的吸水纸自然晾干(约5min)后放在干净离心管上。8)加入30ul的ddh2o，静置5min，12000rpm离心2min，将离心管中的液体用移液枪吸取，后重新加入吸附管中，重复上述步骤。9)以1ul的ddh2o为对比测量dna溶液的溶度，达到2ug则为成功，取适量的dna溶液用于coⅰ基因测序，剩余的送至公司进行二代测序。10)以25ul的pcr体系进行coⅰ基因序列的扩增，得到的pcr产物置于4℃冰箱中保存。然后将pcr产物送至公司进行测序，得到coⅰ序列。11)得到公司二代测序结果后，以coⅰ序列为锚定序列，使用geneious软件拼接线粒体基因组序列，得到完整的线粒体基因组序列。12)将已得的线粒体基因组序列送至mitos线上平台进行各基因位置及长度的初步确定。13)以初始密码子，终止密码子，血缘相近种的同一基因长度及位置为参考，确定各基因的长度与位置。因为螨的trna降解严重，软件多无法识别，需根据trna的二级结构及反密码子手动进行确定及绘制。14)使用genieous软件得到包含37个基因位置的线粒体基因组环图。二、腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对的设计通过上述步骤一确定线粒体基因组序列，寻找特异位点，设计特异引物对，最后获得2个特异引物对，如表2所示，由生工生物(上海)有限公司合成。引物对tp-f/tp-r用于特异性鉴定腐食酪螨，引物对ao-f/ao-r用于特异性鉴定椭圆食粉螨。表2、腐食酪螨和椭圆食粉螨特异引物信息三、鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对的验证1、供试螨样品供试螨样品与线粒体基因组测序所用样品一致。2、pcr扩增腐食酪螨使用tp-f/tp-r引物对进行pcr扩增。pcr扩增体系为2×taqpcrmastermix12.5ul，上下游引物(10μm)各1ul，dna模板1.5ul，ddh2o9ul。pcr扩增条件如表3所示。表3、腐食酪螨pcr扩增条件椭圆食粉螨使用ao-f/ao-r引物进行pcr扩增。pcr扩增体系为2×taqpcrmastermix12.5ul，上下游引物(10μm)各1ul，dna模板1.5ul，ddh2o9ul。pcr扩增条件如表4所示。表4、椭圆食粉螨pcr扩增条件3、pcr产物检测取8ulpcr扩增产物分别进行电泳检测，将检测合格的pcr扩增产物直接交于华大基因有限公司进行纯化和双向测序。结果表明：引物对tp-f/tp-r在腐食酪螨样品中扩增得到484bp的目的序列，即为腐食酪螨线粒体基因组中nad4基因(序列5)第405-889位所示的dna片段，而在椭圆食粉螨中皆无产物。引物对ao-f/ao-r在椭圆食粉螨样品中扩增得到639bp的目的序列，即为椭圆食粉螨线粒体基因组中nad2基因(序列6)第201-840位所示的dna片段，而在腐食酪螨中皆无产物。实施例2、鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对的特异性检测一、鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对的特异性检测方法1、供试螨样品供试螨如表5所示，样品螨均置于无水乙醇中，-20℃保存备用。表5、鉴定特异引物特异性pcr中所用螨样本中文名科拉丁文名椭圆食粉螨粉螨科aleuroglyphusovatus粗脚粉螨粉螨科acarussiro腐食酪螨粉螨科tyrophagusputrescentiae线嗜酪螨粉螨科tyroboruslini家食甜螨食甜螨科glycyphagusdomesticus普通肉食螨肉食螨科cheyletuseruditus马六甲肉食螨肉食螨科cheyletusmalaccensis1、提取dna采用天根“微量dna提取试剂盒”提取表5中的各种螨的dna，具体提取流程如下：1)通过解剖镜观察并挑取50头纯化饲养的成螨，置于1.5ml的离心管中，用无水乙醇洗净，自然晾干。2)加入180ul的ga缓冲液以及20ul的蛋白质酶，摇匀，简短离心后56℃水浴过夜。取出离心管，擦去表面水滴，简短离心。3)加入200ul的gb溶液以及1ul的carrierrna溶液，充分摇匀(此时有沉淀产生，需使沉淀分散)后70℃水浴10min，此时管中清澈无沉淀。取出擦干，简短离心。4)加入200ul的无水乙醇(室温高于26℃时将无水乙醇放入4℃冰箱中预冷)，上下颠倒摇匀，简短离心后静置5min，然后使用移液枪将离心管中的液体全部转移到收集管上的吸附管中，常温12000rpm离心1min。取出，倒掉废弃液。5)加入500ul的gd溶液，静置5min，然后12000rpm离心1min。取出，倒掉废弃液。6)加入600ul的pw溶液，静置5min，然后12000rpm离心1min，取出，倒掉废弃液。重复本步骤两次。7)空管12000rpm离心2min，取出，倒掉废弃液，将吸附管放在干净的吸水纸自然晾干(约5min)后放在干净离心管上。8)加入30ul的ddh2o，静置5min，12000rpm离心2min，将离心管中的液体用移液枪吸取，后重新加入吸附管中，重复上述步骤。2、pcr扩增分别以表5中各个螨样品的dna为模板，分别使用引物对tp-f/tp-r和引物对ao-f/ao-r进行pcr扩增，分别得到表5中各个螨样品的pcr扩增产物。pcr反应体系和pcr扩增条件同实施例1步骤三的2。3、pcr产物检测常规pcr扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳检测，使用d2000marker，取各扩增产物8ul，在1×taebuffer中1.5％琼脂糖凝胶电泳30min，电泳结果通过紫外成像仪获得。二、鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对的特异性检测结果特异性检测的原则为每种螨的特异引物对只有在与其对应的目标螨的dna模板中扩增出目的序列，在电泳结果中出现相应长度的明亮单一条带，而其他dna模板中无目的序列被扩增，在电泳结果中不出现条带，即该特异引物对在所建立的腐食酪螨和椭圆食粉螨特异引物pcr鉴定技术体系下，能特异性地鉴定出目标螨种。若某特异引物对对应的dna扩增电泳结果中出现相应长度的明亮单一条带，则待测螨为或候选为该特异引物对对应的目标螨。若某特异引物对对应的dna扩增电泳结果中不出现条带，则待测螨不为或候选不为该特异引物对对应的目标螨。引物对tp-f/tp-r对应的目标螨为腐食酪螨；其相应条带的大小为484bp。引物对ao-f/ao-r对应的目标螨为椭圆食粉螨；其相应条带大小为639bp。腐食酪螨特异性检测结果如图1所示。结果表明：7个螨样品中，腐食酪螨特异引物对tp-f/tp-r在序号1的腐食酪螨样品中成功扩增出目的序列(大小为484bp的目标片段)，在电泳结果中出现明亮的单一条带，而在非腐食酪螨的dna样品中均无扩增出目标序列，电泳结果中无条带。椭圆食粉螨特异性检测结果如图2所示。结果表明：7个螨样品中，椭圆食粉螨特异引物对ao-f/ao-r在序号1的椭圆食粉螨样品中成功扩增出目的序列(大小为639bp的目标片段)，在电泳结果中出现明亮的单一条带，而在非椭圆食粉螨的dna样品中均无扩增出目标序列，电泳结果中无条带。上述结果表明：本发明的鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对具有良好的特异性，可实现对腐食酪螨和椭圆食粉螨的快速、准确鉴定。实施例3、鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对的灵敏度检测一、鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对的灵敏度检测方法腐食酪螨：使用螨样品与实施例1中相同，将腐食酪螨的dna样品进行稀释，得到浓度分别为26.62ng/ul、13.31ng/ul、6.66ng/ul、3.33ng/ul以及1.66ng/ul的dna样品，分别以被稀释的dna样品为模板，使用引物对tp-f/tp-r进行扩增，pcr扩增体系和扩增条件与实施例1步骤三的2相同。椭圆食粉螨：使用螨样品与实施例1中相同，将椭圆食粉螨的dna样品进行稀释，分别得到浓度为15ng/ul、5ng/ul、1.67ng/ul、0.56ng/ul以及0.18ng/ul的dna样品，分别以被稀释的dna样品为模板，使用引物对ao-f/ao-r进行扩增，pcr扩增体系和扩增条件与实施例1步骤三的2相同。二、鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨特异引物对的灵敏度检测结果腐食酪螨的特异引物对的灵敏度检测结果如图3所示，椭圆食粉螨的特异引物对的灵敏度检测结果如图4所示。由图可知鉴定腐食酪螨特异引物对可以在dna模板浓度为6.66ng/ul条件下通过常规pcr扩增出目的条带，鉴定椭圆食粉螨特异引物对可以在dna模板浓度为1.67ng/ul条件下通过常规pcr扩增出目的条带，可见本发明的鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨特异引物对的灵敏度良好。以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。序列表<110>中国农业大学<120>鉴定腐食酪螨和椭圆食粉螨的特异引物对及其应用<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtgttttccttgccttttctc21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ataagtagagccccataaacc21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tcttccacagaacaaaatatg21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cggttctttcgttagttactg21<210>5<211>1301<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ataaaaatgataatgagagtcttttttttgttgtctgttttttatgtttttcttgatttt60ttcttttttaattgagttttcttatttatggttttttttatttttaatttttacgggggc120tttacggatggatttttttacagagattatttttctcttcttttggtttttgttactttt180tgggtttttttattttcttttctttctatgaagttttctaatcctaattttgttgtgctt240tgagttataatattttttcttttttttagtttttttactgttaattatttatttttctat300gttttttttgagtttgtttttgttataatatttatttttcttttaggttgaggtaaaact360ctggagcgtttacaggcttctttttatatgtttttttacactatagtgttttccttgcct420tttctcgtttttttgatctatctaaatttttcaatttcagattctttttcttcattaact480ttttctcaatatgatgataatcttatctataatgattttttttgagtttttataatctta540gtttttgtagttaagcttcccctttttgggtttcatctttgattacctaaggcccatgtg600gaggctcctgttgctggttctataattttggctggggttctactaaaattagggggttat660ggtatttttcgttttttctcttctgtgggttgtctcaatttttcttatagagtgttattt720tcctatattttttatgtctctctttacggggctgtgtttgtaagcttgatttgtattcgt780caaatagaccttaagatactcattgcttactcttctgttgttcacataagagttataatc840ttaggtattttaagtttttctatttggggggtttatggggctctacttatgataattgct900catggttttatttcccctatgatattttatctcataacttacctttatgaaaatcaccat960tctcgtagaattatagtacttaagggggtgttgatctgtaaccctttattttgtctttta1020tggtttctatgttgttctttaaatttaagggctcctccttttatgtctttttattcagag1080gttattatttttggttctttaggttctttaggtttacttgagtgactaataattacttta1140agttgtttttttactggggtttactgtatctatagttatgtggtggtgagacacggttct1200tctctttctagattgttttatttcttagattataaaattgtcttagtttcagtttctcac1260tttatttttgttattttttaccctattatcttttttttgta1301<210>6<211>969<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6atggtactcactttaatagtaactaccatttcaggaatagcatgctcaagatgattaata60gtatgaatactattagaagcaaacaccctggctatgtgttttttagtatcccatgaatca120aaaacaagaataaaaagagaaaaagcaaccatgacatatttcatagtacaaatcttagca180tcaatccttattcttctagcttcttccacagaacaaaatatgttatcttcaactctgatc240ataggaggcattctcgccaaaataggagtctgaccagcccacctatggtacataaaaata300attaaccttcttcaaataaaacaaaattccttactaatcttaataacatggcaaaaaatc360ctaccagctttcctagcaataagaataagaaaaaatatagaaagagaaacccctttaata420atagtagccttagtatccctagtaacccctcttaccatattaaaatcaaacttaactaca480aaaagaattatagccttatcctcattaaacaacaacgcatggctagtaatagcaatctcc540ttatccacaaaatcattcacagcattcttagctttatactcttccacacttataatactt600ctaaaaacaataaactgactaacaaaaaaatcagaaagaacaggaaaaagattctgatac660tcaatagtaatattcggtaatctgggaggcctaccacctttaacaatattttgaataaaa720gtaataattttaaaaaccttaatggagagcaacacaagaacagaaatctgcggaattcta780atattatcagcatgtattatactttaccactacctatgaacagtaactaacgaaagaacc840gcctcaccagtaaaaaggcaaaaccaagccatcttaaacaaaaaagaaagaaaaacctat900atcaccataattttacccataagtttcgtgagagcgtacctaacaataattatattaggc960ttaacctaa969当前第1页12