单纯性增生型外阴营养不良生物标志物及筛选方法和检测试剂盒与流程

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种单纯性增生型外阴营养不良生物标志物及筛选方法和检测试剂盒。
背景技术：
：外阴营养不良是女性外阴皮肤和黏膜组织发生变性及色素改变的一组慢性疾病，外阴营养不良按其病理类型不同可分为：外阴硬化性苔藓型、外阴鳞状细胞单纯性增生型。典型的临床表现为外阴瘙痒难忍或/和伴有疼痛，外阴皮肤粗糙、呈苔藓样增厚、局部色素减退，甚至发生皲裂、萎缩，严重时阴蒂、大小阴唇萎缩、粘连，甚至影响排尿和性生活，严重影响患者生活质量。近年来发病还有明显上升趋势，同时年轻化比较明显。外阴营养不良目前病因不明，发病机制不明确。目前的病因学研究涉及免疫、遗传、激素、内分泌代谢等各个方面，但目前均无较为肯定的结论。kazandi等认为外阴营养不良和自身免疫性疾病有关，因为患者可以合并多种自身免疫性疾病，如白癜风、甲状腺功能低下等。但本病仅在外阴皮肤有病损，身体其他部位没有类似的皮肤改变，所以这与其他自身免疫性疾病不同。也有学者研究表明外阴营养不良可能与外阴局部神经血管营养失调有关。li等通过对患者及对照组局部皮肤进行cd34及髓鞘碱性蛋白(mbp)免疫标记来间接了解微血管及神经纤维的数量，结果显示患者微血管及神经末梢的数量明显减少。cowalewski等用三维成像技术研究外阴上皮内非瘤样病变的微血管变化，结果发现病变区域的血管密度较正常外阴组织低。这些研究仅仅显示了病变的结果，但最初的病因还是不明。gnthert等报道认为该病是内分泌因素-性激素缺乏引起，因为本病好发于围绝经期妇女，且患者血清中性激素水平低于正常同龄妇女，提示性激素可能是外阴营养不良发病机制中的一个因素。但本病患者年龄跨度很大，很难用激素这一因素来解释本病的临床特点。技术实现要素：针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种单纯性增生型外阴营养不良生物标志物及筛选方法和检测试剂盒，可以通过确定研究对象阴道菌群中是否存在这些微生物中的至少一种，来有效确定研究对象是否患有或者易患早期单纯性增生型外阴营养不良。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种单纯性增生型外阴营养不良生物标志物，包括：paenibacillus(芽孢杆菌属)、megasphaera(巨球型菌属)、enterococcus(肠球菌属)、sphingomonas(鞘脂单胞菌属)和escherichia/shigella(大肠杆菌/志贺菌属)中的至少一种。本发明还提供了上述生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：(1)收集待测样本并进行微生物基因组dna提取，得到样本dna；(2)利用16srrna特异性的v3-v4区域扩增引物对样本dna进行pcr扩增，回收pcr产物，构建dna文库，并进行测序；所述扩增引物序列为：338f：5'-actcctacgggaggcagcag-3′；806r：5’-ggactachvgggtwtctaat-3′；(3)利用dna条形码区分每个待测样本的原始reads，并对其进行过滤获得cleanreads，将cleanreads相似性≥98％的归为同一out，并计算out的丰度；(4)在门、目和属水平上比较待测样本，选出丰度最大的菌属，并用ldaeffectsize和荧光定量pcr对其进行分析验证，筛选出生物标志物。进一步地，步骤(1)中所述待测样本为阴道分泌物。进一步地，步骤(1)中pcr扩增时的扩增体系为25ngdna样本，12.5μl荧光定量pcrmix，引物各2.5μl，补充milliqwater至总体积为25μl；pcr扩增程序为98℃预变性30秒，98℃变性10秒，54℃解链30秒，72℃延伸45秒，共循环35次，最后72℃延伸10分钟。本发明还提供了用于检测上述单纯性增生型外阴营养不良生物标志物的试剂盒，包括：细菌16srrnav3-v4区域扩增引物、荧光定量pcrmix和milliqwater。进一步地，细菌16srrnav3-v4区域扩增引物序列为：338f：5'-actcctacgggaggcagcag-3′；806r：5’-ggactachvgggtwtctaat-3′。本发明提供的单纯性增生型外阴营养不良生物标志物及筛选方法和检测试剂盒，具有以下有益效果：本发明提供的生物标志物可简单有效的检测对象是否患有早期单纯性增生型外阴营养不良，并且可通过检测对象与候选药物接触后，生物标志物水平的变化，来确定候选药物是否可以作为治疗或预防单纯性增生型外阴营养不良的药物。附图说明图1为lsc组、h组和vls组在phylum水平上的差异对比分析结果(其中lsc组为单纯性增生型外阴营养不良，vls组为硬化性苔藓型外阴营养不良，h组为健康对照组，下同)。图2为lsc组、h组和vls组在order水平上的差异对比分析结果。图3为lsc组、h组和vls组在genus水平上的差异对比分析结果。图4为bray-curtisanalysis校验阴道微生态的差异程度结果。图5为h组和lsc组的ldaeffectsize分析结果。图6为荧光定量pcr检测菌株在lsc组、h组和vls组中的丰度结果图。图7为利用荧光原位杂交法在活检组织样本中检测enterococcus的结果图。具体实施方式本发明中所用的主要试剂及来源如下：实施例11、样本收集样本纳入的标准：生育期妇女，激素表达水平高，有子宫，无宫颈糜烂，无hpv感染。样本采集数量：健康人群40例，外阴慢性单纯性苔藓型50例。采集志愿者阴道分泌物，且志愿者在采样前3天无阴道用药记录。2、dna提取阴道分泌物样品的收集和处理：将取好的阴道分泌物样品放入无菌的1.5mlep管内，立即放入冰上将样本冷冻，然后将冷冻的样本送到保存点，每份样本加入50μl乙醇，保存于-80℃直至测序分析。dna提取按照omega试剂盒步骤进行。3、测序文库构建利用细菌16srrna特异性的v3-v4区域扩增引物对样本dna进行pcr扩增，进行文库构建。其中，细菌16srrna基因的v3-v4区域扩增引物序列为：338f：5'-actcctacgggaggcagcag-3′(seqidno:1)；806r：5’-ggactachvgggtwtctaat-3′(seqidno:2)。将细菌16srrna特异性的v3-v4区域扩增引物的5'端连接样本特异性的dna条形码和通用测序引物，进行pcr扩增。扩增体系为：25ngdna样本，12.5μl荧光定量pcrmix，引物各2.5μl，补充milliqwater至总体积为25μl。pcr扩增程序为：98℃预变性30秒，98℃变性10秒，54℃解链30秒，72℃延伸45秒，共循环35次，最后72℃延伸10分钟。pcr产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测质量。整个过程中，超纯水为阴性对照，pcr产物用axypreppcrcleanupkit回收，用promegaquantifluor检测质量合格后提交测序，测序平台为hi-3000sequence。4、数据分析利用特异性的dna条形码区分每个样本的原始reads，原始reads用flash(v1.2.8).quality过滤并用fastqc获得cleanreads。相似性≥98％的被归类于同一out(operationaltaxonomicunits)。分析时，每个out都用特异性的特征序列代表。特征序列根据ribosomaldatabaseproject(v11.5)和ncbiclassifier数据库进行物种分类，以标准序列的标准拷贝数和最少拷贝数的比值来表征out的丰度。最后利用stamp(v2.1.3)来计算统计学差异。5、α多样性分析α多样性被用于评估菌群微生态，本发明用7个参数来表征女性阴道微生态的物种多样性。健康女性(h)、单纯性增生型苔藓样病变(lsc)的阴道微生态特征参数如下：hlscage(average±sd)42.09±10.344.89±11.52bmi(average±sd)22.78±3.2123.95±3.03uniquetag(average)26831503outnumber(average)80.529.8richness(average±sd)80.5±40.5929.82±25.40chao1(average±sd)86.92±39.8937.87±32.65shannon(average±sd)1.89±1.290.81±0.79simpson(average±sd)0.51±0.300.75±0.23dominance(average±sd)0.49±0.300.25±0.23equitability(average±sd)0.29±0.190.16±0.156、样品在门、目和属水平上的差异对比在门(phylum)、目(order)和属(genus)水平，lsc组与h组有较大的差异。结果如图1-图3所示，其中vls为硬化性苔藓样病变。图1每组柱状图中从上到下的颜色块分别代表firmicutes、proteobacteria、actinobacteria、fusobacteria、deinococcus-thermus、bacteroidetes、candidatus-saccharibacteria、acidobacteria、tenericutes和其他。图2每组柱状图中从上到下的颜色块分别代表lactobacillales、enterobacteriales、bacillales、coriobacteriales、bifidobacteriales、burkholderiales、fusobacteriales、caulobacterales、thermales、selenomonadales、actinomycetales、clostridiales、bacteroidales、sphingomonadales、xanthomonadales、pseudomonadales、deinococcales、mycoplasmatales、erysipelotrichales和其他。图3每组柱状图中从上到下的颜色块分别代表lactobacillus、escherichia/shigella、streptococcus、staphylococcus、atopobium、gardnerella、bifidobacterium、sneathia、massilia、thermus、tepidimonas、granulicatella、brevundimonas、corynebacterium、caulobacter、prevotella、sphingomonas、vulcaniibacterium、acinetobacter、fusobacterium、finegoldia、pseudomonas、dialister、deinococcus、aerococcus、porphyromonas、stenotrophomonas、mycoplasma、peptoniphilus和其他。由图1-图3可知，在phylum、order和genus水平，lsc组均与h组有较大差异。从phylum水平到order水平再到genus水平，可以筛选出lsc组中特异性的菌属，再从这些特异性的菌属中筛选出丰度高的菌作为lsc的生物标志物。lsc组α指数低，菌群的物种丰富程度低，菌种的丰度也低，但是lsc组有高丰度的paenibacillus(p＝0.038)，megasphaera(p＝0.03)，enterococcus(p＝0.015)，sphingomonas(p＝0.0033)，escherichia/shigella(p＝0.0004)。因此这5个菌属可用于lsc的诊断。7、校验阴道微生态差异程度用bray-curtisanalysis来校验阴道微生态的差异程度，其香农指数结果见图4。由图4可知，r值为正，说明lsc和vls组是具有差异性的独立微生态系统，即从阴道微生态系统分析，尽管在疾病早期lsc和vls的临床表型相似，但是从阴道微生态系统分析，lsc和vls组已是不同的微生态系统。与病理学亚型分类一致，证明可从菌群中筛选生物标志物区分两个微生态系统。ldaeffectsize分析寻找h组和lsc组中差异最大的菌属，结果如图5所示，图5中坐标轴左侧为lsc组，右侧为h组。图5进一步说明paenibacillus(p＝0.038),megasphaera(p＝0.03),enterococcus(p＝0.015),sphingomonas(p＝0.0033),escherichia/shigella(p＝0.0004)可作为lsc的诊断标志物。8、荧光实时定量pcr(rtq-pcr)检测特异性菌属根据ssofastevagreenmix(bio-rad)进行荧光实时定量pcr检测，实验仪器为bio-radcfx96，所用的特异性引物如下：enterococcusforward：5'-tgggtctcaagccattcc-3′(seqidno:3)；reverse：5'-ggctggttgttccacagag-3′(seqidno:4)；sphingomonasforward：5'-ggactggtattgacgctgag-3′(seqidno:5)；reverse：5'-tgcgaccattccaagacg-3′(seqidno:6)；escherichia/shigellaforward：5'-cgatccctagctggtctgag-3′(seqidno:7)；reverse：5'-ttcttcatacacgcggcatg-3′(seqidno:8)；xanthobacterforward：5'-cggaatcactgggcgtaaag-3′(seqidno:9)；reverse：5'-acctcagcgtcagtatcgag-3′(seqidno:10)；nocardioidesforward：5'-ataggggtctctttgatact-3′(seqidno:11)；reverse：5'-agaaaggaggtgatccagcc-3′(seqidno:12)；streptococcusforward：5'-aggtcaaccactatatagcga-3′(seqidno:13)；reverse：5'-tcttcaaattccgctgactt-3′(seqidno:14)。荧光定量pcr分别检测enterococcus、sphingomona、escherichia/shigella、xanthobacter、nocardioides和streptococcus在h、lsc和vls中的丰度，结果如图6所示，图6中每组柱状图从左到右分别为h组、lsc组和vls组。该结果与测序结果一致。9、细菌荧光原位杂交实验验证16srrna测序结果利用荧光原位杂交法检测活检组织样本，其enterococcus检测结果见图7。图7中绿色表示探针阳性反应，蓝色为组织细胞核染色。该结果与测序结果一致，enterococcus仅在lsc组织中出现。本发明提供的生物标志物在使用时，具体为：采集待测样本，然后提取微生物基因组dna，对其进行测序，当序列中含有这些标志物的基因序列时就说明患有早期单纯性增生型外阴营养不良。序列表<110>四川大学华西第二医院<120>单纯性增生型外阴营养不良生物标志物及筛选方法和检测试剂盒<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1actcctacgggaggcagcag20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggactachvgggtwtctaat20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgggtctcaagccattcc18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggctggttgttccacagag19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ggactggtattgacgctgag20<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tgcgaccattccaagacg18<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cgatccctagctggtctgag20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ttcttcatacacgcggcatg20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cggaatcactgggcgtaaag20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10acctcagcgtcagtatcgag20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ataggggtctctttgatact20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12agaaaggaggtgatccagcc20<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13aggtcaaccactatatagcga21<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tcttcaaattccgctgactt20当前第1页12