一种利用微藻低成本生产油脂的方法与流程

本发明属于微藻生物处理技术领域，具体涉及一种利用微藻低成本生产油脂的方法。

背景技术：

土壤盐渍化是一直存在的世界性环境问题，盐碱地不但面积大而且治理难度也大。盐碱土作为一种潜在的土地资源，具有成为优质农地或者草地的潜力，如果得到合理的开发利用，可以带来巨大的收益。根据中国农业部的数据显示，中国约有34万平方公里的盐碱地，其中大约12.4万平方公里的土地在修复后可进一步用于农业生产。土壤盐渍化不仅影响土壤性质，降低土壤生产力，而且会引起生态系统变化如植物的生长和分布，最终导致草地退化。目前，盐碱地的改良已受到广泛关注。已知改良盐碱地的措施主要有水利措施，物理措施，化学措施及生物措施。其中，世界范围内盐碱地治理一般采用灌溉淋洗法，然而，该方法需要大量农业灌溉水资源，且排出大量含有氮磷钾等植物营养素的淋洗液，这部分含盐废水通常需要进一步处理排放，从而增加了治理成本。

微藻因培养不占耕地，生长周期较短，油脂含量较高等优点，被视为第三代生物能源的理想原材料，且微藻环境适应能力强，经光合作用可累积包括蛋白质、多糖、色素、脂肪酸等在内的多种高值代谢物质，近年来在医药、食品、资源与能源开发领域备受关注。利用微藻制备生物柴油及其他高价值产物一直是全球的研究热点，但其难于培养、生产成本过高等问题较为严重，限制了微藻在生产油脂中的推广应用。

技术实现要素：

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用微藻低成本生产油脂的方法。

本发明提供了一种利用微藻生产油脂的方法，将微藻接种至盐碱地淋洗液中，20～30℃培养25～30d，然后从培养液中分离获得油脂。

优选的，所述微藻包括小球藻和/或栅藻。

优选的，所述盐碱地淋洗液由再生水淋洗盐碱土获得。

优选的，所述盐碱地淋洗液的盐度为0.14～0.6％。

优选的，所述盐碱地淋洗液在使用前经过滤、高压灭菌处理；所述过滤用滤膜的孔径为0.4～0.5μm；所述高压灭菌的温度为118～125℃，高压灭菌的时间为20～40min。

优选的，所述微藻在接种时的密度为2×10⁵～2×10⁶个/ml。

优选的，所述培养的光暗比为13～15h：9～11h。

优选的，光培养时的光照强度为50～70μmolphotons·m^-2·s^-1。

优选的，所述微藻为小球藻hq；所述微藻在接种时的密度为2×10⁵～5×10⁵个/ml；所述培养温度为25～26℃。

本发明还提供了上述方法制备得到的油脂。

有益效果：本发明提供了一种利用微藻生产油脂的方法，将微藻接种至盐碱地淋洗液中，20～30℃培养25～30d，然后从培养液中分离获得油脂。本发明利用盐碱地淋洗液培养微藻，盐碱地淋洗液中含有大量微藻生长所必需的营养素和微量元素，且适宜的盐度有利于藻类脂质的积累。本发明提供的方法降低了微藻养殖成本，在获得高产生物质的同时净化了盐碱地淋洗液，提高了废水循环利用效率。另外，本发明提供的方法利用盐碱地淋洗液培养微藻转化生物质积累油脂，成本较低，适于推广应用。

生物保藏信息说明

小球藻hq，于2013年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，藻种保藏号为cgmccno.7601；

栅藻lx1，于2009年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，藻种保藏号为cgmccno.3036。

附图说明

图1为本发明实施例1所述三株产油微藻在盐碱地淋洗液(山东)中的生长曲线；

图2为本发明实施例1所述三株产油微藻在盐碱地淋洗液(山东)中的油脂积累特性；

图3为本发明实施例2所述三株产油微藻在盐碱地淋洗液(内蒙古)中的生长曲线；

图4为本发明实施例2所述三株产油微藻在盐碱地淋洗液(内蒙古)中的油脂积累特性。

具体实施方式

本发明提供了一种利用微藻生产油脂的方法，将微藻接种至盐碱地淋洗液中，20～30℃培养25～30d，然后从培养液中分离获得油脂。

本发明先将微藻接种至盐碱地淋洗液中。

在本发明中，所述微藻优选包括小球藻和/或栅藻，所述小球藻包括小球藻hq(课题组前期分离获得)和普通小球藻(购买于中国科学院淡水藻种库)，优选为小球藻hq，所述栅藻优选为栅藻lx1(由清华大学模拟与污染控制实验室提供)；在本发明最优选的方案中，使用小球藻hq进行油脂的生产。

在本发明中，所述盐碱地淋洗液优选由再生水淋洗盐碱土获得。所述再生水优选为污水处理厂终端水；在本发明更具体的实施例中，所述再生水选用北京市北肖河污水处理厂终端水，其出水水质标准为北京市地方标准水污染综合排放标准(db11/307-2013)中的b级排放标准。本发明对所述盐碱土的来源不作特别限定。在本发明中，所述盐碱土的盐度优选为0.14～0.6％，更优选为0.2～0.5％，更优选为0.25～0.4％。所述盐碱土的ph值优选为7.5～8.5。

在本发明中，所述盐碱地淋洗液在使用前优选经过滤、高压灭菌处理；所述过滤用滤膜的孔径优选为0.4～0.5μm，更优选为0.45μm；所述高压灭菌的温度优选为118～125℃，更优选为121℃；所述高压灭菌的时间优选为20～40min，更优选为30min。

在本发明中，所述微藻在接种时的密度优选为2×10⁵～2×10⁶个/ml，更优选为2×10⁵～5×10⁵个/ml。

本发明将微藻接种至盐碱地淋洗液中，然后进行培养。

在本发明中，所述培养的温度优选为20～30℃，更优选为25～26℃。所述培养的光暗比优选为13～15h：9～11h，更优选为14h：10h。在进行光培养时，所述光培养的光照强度优选为50～70μmolphotons·m^-2·s^-1，更优选为60μmolphotons·m^-2·s^-1。所述培育的时间优选为25～30d，更优选为28d。

培养结束后，本发明在培养液中获得微藻生产的油脂。经分离测定，微藻经盐碱地淋洗液培养后的脂质产量最高能达到69.90mg/l。

本发明提供的方法可以节省碳源和氮源以及其他微量元素，降低了微藻培养的成本；盐碱地淋洗液得到了净化，提高了淋洗液的循环利用效率，有利于节约能源，保护环境。

本发明中三株产油微藻均可以很好地在盐碱地淋洗液中生长，不但为盐碱地淋洗液的治理提供了一条新思路，而且将营养物质转化为微藻生物质；可能存在的作用机制是盐碱地淋洗液中的碳源和氮源被微藻吸收利用，其中主要利用的是无机碳源。本发明筛选出了在盐碱地淋洗液中生长的最优藻种小球藻hq，微藻油脂产量较高。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例中的再生水取自北京市北肖河污水处理厂的终端水；盐碱土分别取自山东东营和内蒙古自治区呼和浩特市土默特左旗察素齐镇。

以下实施例中的藻密度测定方法采用细胞计数法，即取一定藻液摇匀后在光学显微镜下通过血球计数板监测培养液中藻细胞密度，每两天测定一次藻密度，绘制微藻生长曲线。

以下实施例中微藻油脂的测定步骤为：取40ml藻液置于50ml离心管中，在4℃下以转速为10000rpm离心10min，倒掉上清液至藻液为0.8ml。依次往上述浓缩液中添加1ml氯仿、2ml甲醇充分混合，再加入1ml氯仿和1ml高纯水，再次充分摇晃混合后离心(4℃，4000rpm×10min)。用移液枪将下层有机相转移至干燥已称重好的玻璃消解管中，氮吹至恒重。再次称取玻璃管的重量，前后之差即为总油脂质量。

实施例1

(1)盐碱土土样采集：按蛇形取样法，在山东东营地区的盐碱土地上随机挑取10个取样点。用专业取样器在每个取样点的土壤上层(0-20cm)、中层(20-40cm)和下层(40-60cm)取样，得到上、中、下层土样。然后将各层土样自然风干、研磨、过3mm筛后混合均匀，分层保存。

(2)将取回的上、中、下层盐碱土样按下层、中层和上层的顺序从下到上放入淋洗装置(规格为100×92×70mm)中，经再生水淋洗，得到淋洗液。淋洗液经0.45μm水洗滤膜过滤，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温，得到培养基。经测定，培养基的ph值为7.73，盐度为0.28％。

(3)将步骤(2)得到的培养基分为三份，分别接种普通小球藻、小球藻hq和栅藻lx1。初始接种密度均为2×10⁵个/ml。在温度为25℃，光暗比为14h：10h，光照强度为60μmolphotons·m^-2·s^-1的条件下培养25d。

(4)在培养过程中，用血球计数板检测培养液中藻细胞密度，每两天测一次，绘制微藻生长曲线；培养结束后，测定微藻油脂含量。

结果如图1～2所示。

图1为三株产油微藻在盐碱地淋洗液(山东)中的生长曲线。由图1可知：在培养初期，小球藻hq和普通小球藻的生长速度相对较快，而栅藻lx1的生长速度相对较慢。培养25d后，小球藻hq、普通小球藻和栅藻lx1的藻密度分别达到1.65×10⁷个/ml，1.41×10⁷个/ml和1.22×10⁷个/ml。表明小球藻hq在盐碱地淋洗液中培养25d后获得的藻密度最大。

图2为三株产油微藻在盐碱地淋洗液(山东)中的油脂积累特性。由图2可知：三株微藻在盐碱地淋洗液中经过25d培养后，小球藻hq的脂质产量最大为69.90mg/l，约为普通小球藻和栅藻lx1的两倍。表明小球藻hq在盐碱地淋洗液中可以积累大量的油脂。

实施例2

(1)盐碱土土样采集：按蛇形取样法，在内蒙古地区的盐碱土地上随机挑取10个取样点。用专业取样器在每个取样点的土壤上层(0-20cm)、中层(20-40cm)和下层(40-60cm)取样，得到上、中、下层土样。然后将各层土样自然风干、研磨、过3mm筛后混合均匀，分层保存。

(2)将取回的上、中、下层盐碱土样按下层、中层和上层的顺序从下到上放入淋洗装置(规格为100×92×70mm)中，经再生水淋洗，得到淋洗液。淋洗液经0.45μm水洗滤膜过滤，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温，得到培养基。经测定，培养基的ph值为8.50，盐度为0.38％。

(3)将步骤(2)得到的培养基分为三份，分别接种普通小球藻、小球藻hq和栅藻lx1。初始接种密度均为2×10⁵个/ml。在温度为25℃，光暗比为14h：10h，光照强度为60μmolphotons·m^-2·s^-1的条件下培养28d。

(4)在培养过程中，用血球计数板检测培养液中藻细胞密度，每两天测一次，绘制微藻生长曲线；培养结束后，测定微藻油脂含量。

结果如图3～4所示。

图3为三株产油微藻在盐碱地淋洗液(内蒙古)中的生长曲线。由图3可知：培养28d后，小球藻hq、普通小球藻和栅藻lx1的藻密度分别达到1.16×10⁷个/ml，0.75×10⁷个/ml和0.63×10⁷个/ml，其中小球藻hq生长状况更好。

图4为三株产油微藻在盐碱地淋洗液(内蒙古)中的油脂积累特性。由图4可知：三株微藻在盐碱地淋洗液中经过28d培养后，小球藻hq的脂质产量最高，为54.52mg/l。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。